本视频文章展示了全装片小鼠视网膜神经节细胞的膜片钳记录技术的实验装置、细胞体膜片钳操作步骤以及动态钳记录的实施方法。该技术可用于研究兴奋性和抑制性突触输入对神经元放电的精确贡献，及其相对强度和时间关系。
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摘要
摘要
神经节细胞是视网膜的输出神经元，其活动反映了来自特定神经回路的多种突触输入的整合。膜片钳技术在电压钳和电流钳模式下，常用于研究神经元的生理特性并表征其突触输入。尽管这些技术的应用具有重要信息价值，但仍存在多种局限性。例如，难以量化兴奋性和抑制性输入之间的精确相互作用如何决定神经元的输出反应。为解决这一问题，我们采用了一种改进的电流钳技术——动态钳（dynamic clamp），也称为电导钳1, 2, 3，以研究兴奋性和抑制性突触输入对神经元兴奋性的影响。该技术需要向细胞内注入电流，并依赖于实时反馈其当时的膜电位。注入电流的计算基于预设的兴奋性和抑制性突触电导、其反转电位以及细胞瞬时的膜电位。本视频文章展示了实验操作流程的详细内容，包括实现全细胞记录模式的膜片钳技术以及动态钳技术的应用。在此，我们展示了小鼠视网膜神经节细胞在对照条件下或药物存在时，对来自生理实验获得的不同电导波形的反应。此外，我们还展示了使用α函数生成的人工兴奋性和抑制性电导，以研究细胞的反应特性。
引言
视网膜是一层近乎透明的神经组织，位于眼球后部内表面。许多研究将视网膜作为模型，用于探究视觉信息处理的初始步骤以及突触信号传递的机制。由于在整体装片制备过程中，视网膜网络在解剖后仍保持完整，因此它是研究突触相互作用的理想系统，其生理反应与体内（in vivo）条件非常相似。因此，可以利用离体视网膜，通过膜片钳技术来研究其神经元的特性（有关该技术的综述，参见6,9,13）。然而，特定神经环路和神经递质对神经节细胞反应的确切贡献通常难以明确，因为药理学试剂会在多个位点发挥作用。
视网膜神经元对光（自然刺激）的生理反应可通过填充细胞内液的玻璃微电极记录。利用膜片钳技术，可将神经元对光刺激的反应记录为膜电位波动（电流钳模式）或记录为电流（电压钳模式）。通过在不同电压水平下钳制膜电位并实施 事后 传导分析，可以分离出抑制性和兴奋性突触输入 5,12此类实验可在正常灌流液中进行，也可在添加不同药理学试剂的条件下进行，以分离不同神经递质和受体对神经元反应的贡献。来自多个实验室的大量研究已阐明了神经元放电输出以及兴奋性和抑制性输入对刺激特性（如刺激大小、对比度、空间和时间频率、运动方向、朝向及其他刺激变量）的依赖关系。尽管这些实验方法能够提供关于刺激特性依赖下的放电输出与突触输入之间关系的信息，但要明确特定细胞类型及其突触输入对细胞兴奋性的具体贡献仍不简单。其原因在于，兴奋性和抑制性输入通常均随刺激特性的变化而变化，因此无法准确评估其中任一类输入的变化对神经元放电的精确影响。
克服这些局限性的另一种方法是进行动态钳制记录，该方法能够对单个突触输入对放电输出的贡献进行关键性评估。动态钳制技术允许向细胞直接注入电流，且在特定时刻注入的电流量取决于该时刻所记录的膜电位1,2,3（综述见7,14）。这是一种改进的电流钳装置，通过记录中的细胞与包含专用硬件、软件和计算机的设备之间实现快速实时的反馈交互，从而动态计算注入细胞的电流量。因此，该方法的优势在于，可以用不同组合的电导波形刺激细胞，使其反应模拟介导突触输入的受体激活。例如，比较仅注入小区域兴奋性电导的反应与同时注入小区域兴奋性和抑制性电导的反应，可提供关于抑制作用对细胞反应影响的信息。同样，可以共注入其他生理记录获得的电导组合，以揭示兴奋性和/或抑制性电导在刺激依赖性变化下如何影响动作电位输出。
在本研究中，采用动态钳技术来演示突触输入的相对幅度和时序对视网膜神经节细胞放电特性的影响。实验中使用了在对照条件或药物干预条件下通过生理实验获得的多种电导作为输入。此外，还采用了基于α函数的人工电导，以研究神经元如何整合突触输入。因此，该技术具有良好的灵活性，可将生理、药理或计算方法生成的不同类型电导注入同一神经节细胞，从而便于比较细胞对这些输入的响应。
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方案
1. 一般设置与组织制备
- 将小鼠置于黑暗环境中 30 分钟（旨在降低其应激水平）。等待期间，配制 1 L 细胞外液。首先将 1.9 g 碳酸氢钠溶解于 500 mL Milli-Q 水中。通过通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体维持溶液 pH 值为 7.4。2 和5% CO2五分钟后，将8.8 g Ames培养基溶解于100 ml Milli-Q水中，加入碳酸氢钠溶液中，用Milli-Q水定容至1 L，充分混匀。此后实验过程中保持该溶液通入含二氧化碳的气体。
- 取250 ml含饱和碳酰气体的Ames培养基，并在电生理实验装置中建立液体再灌注系统。保持溶液持续碳酰气体饱和。
- 在灌流室底部均匀涂抹一层真空脂。用盖玻片密封，确保密封处不漏气。取少量真空脂（直径约2 mm），置于灌流室上下两端。这些脂球将用于固定网格（由牙线穿过的铂金框架），防止其对视网膜施加过大压力。将灌流室固定在平台上，并对齐两个开口。
- 动物首先用异氟烷麻醉2分钟，随后通过颈椎脱位法处死。用一把小型剪刀（弯刃）迅速摘除眼球，置于小烧杯中用充氧细胞外液彻底清洗，然后放入盛有充氧细胞外液的培养皿中。
- 在解剖显微镜下，使用19号针头于角膜边缘约2 mm处刺入制作切口。另一只眼重复此操作。此步骤至关重要，应迅速完成，以确保双侧视网膜获得充分氧合。用小型虹膜剪沿角膜边缘平行剪除一侧角膜。随后，用精细镊子移除虹膜和晶状体。另一只眼重复上述操作。将一个眼球杯转移至盛有通入碳酰气体的细胞外溶液的烧杯中。
- 用手术刀片将一个眼球杯切成两半，以便展平全层组织，并使每个视网膜获得两个全层制片。使用钝头解剖探针或轻轻牵拉，小心地将视网膜从色素上皮层分离。一旦脱离，视网膜会变得较为透明。注意凸面为光感受器侧，凹面为神经节细胞侧，由于存在黏性的玻璃体液，凹面可能自行黏连。
- 用一对精细镊子夹住靠近锯齿缘的脱离视网膜组织边缘，再用另一对精细镊子夹住锯齿缘，将其向视网膜中心方向牵拉。此操作较为精细，可能需要多次尝试。若操作成功，锯齿缘、睫状体及玻璃体将随之被移除，视网膜的曲率亦随之降低。即 更平滑）。
- 修剪边缘，然后将组织转移至灌流室，使神经节细胞层朝上。将网格置于硅脂球上以固定组织。将剩余的组织与另一只眼球杯一起保存，以备后续使用。类似的视网膜分离操作步骤详见 Middleton 和 Protti 的文献。 16 和 Pottek 等. 17.
- 将记录室安装在直立显微镜下。立即以35.5 °C的碳酸化细胞外液持续灌流视网膜，灌流速率为3–5 ml/min。确保接地电极已正确放置。
- 显微镜上连接有一个数码相机，用于组织成像。整个装置置于气浮台（减震）上方，并位于法拉第笼（屏蔽外部静态和非静态电场）内部。
- 打开光源（红外， > 850 nm）并使用40倍物镜，将焦距对准神经节细胞的胞体。在全层视网膜铺片中找到用于记录的中央区域。
- 解冻一管冷冻保存的K+ 基于细胞内液（300 μl，pH = 7.4），其中含有（单位：mM）K-葡萄糖酸盐：140，HEPES 酸：10，MgCl2：4.6，ATP-Na+：4，GTP-Na+：0.4 和 EGTA：10。所有试剂均购自 Sigma-Aldrich。
2. 视网膜神经节细胞胞体的膜片钳记录
- 首先将硼硅酸盐毛细玻璃管的末端进行火焰抛光，然后使用双加热步骤的玻璃微电极拉制仪进行拉制（电阻：5 - 8 MΩ）。
- 向细胞内液中加入 3 μl 荧光黄（终浓度 0.2%），充分混匀后离心。接着，将上层 85% 的溶液转移至 1 ml 注射器中，连接 0.22 μm filter 过滤装置，再连接 30 G 可重复使用的皮下注射针头。冷藏保存。
- 将与记录所用玻璃电极尖端尺寸相似的玻璃移液管固定在其电极夹持器中，并使用显微操作器将其移至显微镜下。在 40X 物镜下，缓慢降低移液管，使其在内界膜表面形成微小凹陷。小心向前推进移液管，直至其钩住少量组织，然后向上和/或侧向移动，撕开一个小孔，以暴露节细胞的胞体。孔越小，视网膜网络的完整性保持得越高。如有需要，可在细胞外液中加入磺酰罗丹明 101（SR101；0.5 - 1 μM），通过荧光显微镜标记受损神经元15。
- 用 8 - 10 μl 细胞内液填充一支洁净的移液管。将其插入连接至放大器头阶段的夹持器中，并确保氯化银电极完全浸入溶液。若存在杂质和/或气泡，则弃用。
- 开启所有设备。我们使用由 PatchMaster 控制的 EPC 8 膜片钳放大器，在电压钳模式下实现全细胞记录。需注意，其他支持快速模式下电流钳记录的放大器也可使用。在移液管溶液中施加并维持正压。选择一个胞体较大的细胞，因其更可能是节细胞而非位移无长突细胞或胶质细胞。缓慢降低移液管尖端，使其在膜表面形成微小凹陷，停止下降并释放压力。立即将保持电位调至 -60 mV。当两者之间形成吉欧姆密封（GΩ）后，轻柔施加负压以破裂膜，实现全细胞膜片钳构型。此步骤十分关键：若负压过大，则连接处会出现漏液；若负压过小，则膜仍保持完整。
- 随着时间推移，荧光黄将逐渐充满细胞，从而可观察到细胞的形态结构。若状态稳定，该记录配置可持续 30 分钟或更长时间。
3. 使用动态钳技术记录神经节细胞
- 首先，使用 PatchMaster 执行电压-电流测试（从 -75 到 +35 mV，每 10 mV 一步）。只有当记录到较大的 Na+ 电流（> 1 nA）时，才继续进行后续测试。需注意，在极少数情况下，若记录的是位移的无长突细胞，则其在后续电流注入时不会产生动作电位串反应。
- 打开 LabVIEW，运行自行编写的 Neuroakuma 程序，然后加载各种电导波形。将重复次数设置为 8 次（出于统计目的，可设为 6–8 次）。将兴奋性和抑制性电导的反转电位分别设为 0 mV 和 -75 mV。选择一对匹配的兴奋性和抑制性电导进行测试。兴奋性电导轨迹（绿色）和抑制性电导轨迹（红色）将显示在下方面板中。
- 返回 PatchMaster，选择电流钳模式，并立即将放大器切换至“CC + Comm FAST”电流钳模式。该模式可准确追踪膜电位的快速变化。若细胞膜与电极之间保持良好的封接，则几乎无需补偿；否则，记录将无法持续较长时间。在 Neuroakuma 中按下“record”按钮。细胞反应（通常表现为一连串的时相性动作电位，图 1A）将显示在上方面板中。首先以较低比例的电导注入电流，若观察到微弱或无反应，则逐步小幅增加，直至产生强烈反应。过度的电流注入可能导致细胞死亡。完成测试后，选择新的电导波形对，重复上述步骤，测试所有生理性和人工电导组合。实时注入的生理电流（I）基于以下公式：
I(t) = Gexc(t) × (Vm(t) - Vexc) + Ginh(t) × (Vm(t) - Vinh)
电导（G，单位为 nS）可以是突触性的或人工的。兴奋性和抑制性突触电导波形来自 Protti、Di Marco、Huang、Vonhoff、Nguyen 和 Solomon 之前在对照条件以及河豚毒素（TTX，1 μM）存在下对不同视觉刺激所进行的实验（未发表结果）。人工电导波形使用α函数建模。Vm（单位为 mV）为记录到的膜电位。Gexc 和 Ginh 分别代表兴奋性和抑制性电导，而 Vexc 和 Vinh 分别代表兴奋性和抑制性电导的反转电位。时间为 t，单位为 ms。采样率为 40 kHz。
Is = I0(t/α)e-αt
上述方程为α函数（I0 = 最大电流；1/α = 电流达到峰值的时间（秒-1））。突触电流的上升时间和衰减时间由α4决定。兴奋性电导保持不变，而抑制性电导的潜伏期被调整，使其相对于兴奋起始的延迟缩短（图2D）。
- 记录完成后，小心回撤移液管，确保细胞体保持完整。立即用4%多聚甲醛固定组织30分钟，随后用0.1 M磷酸缓冲液洗涤三次，每次10分钟。将组织冷藏，并于次日或一周内进行抗体染色。
4. 针对 Lucifer Yellow 标记的视网膜神经节细胞的抗体染色
- 在室温下对 Lucifer Yellow 标记的神经节细胞进行抗体染色（使用一抗抗 Lucifer Yellow 兔 IgG（稀释比例 = 1:10,000）孵育五天；第六天使用二抗山羊抗兔 IgG（稀释比例 = 1:500）过夜孵育）。将视网膜置于荧光保护介质中湿封片，加盖盖玻片并用指甲油封固。
- 使用 Leica Spec-II 共聚焦显微镜拍摄细胞形态的共聚焦图像（图1B）。轴突的存在可用于确认神经节细胞。
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结果
通过施加不同的电导波形，可以展示不同来源的抑制性输入对神经节细胞反应的贡献。这些电导波形是在正常条件下以及存在河豚毒素（TTX）的情况下，使用不同亮度的刺激获得的；TTX 是一种电压门控 Na+ 通道阻断剂，仅阻断部分抑制性视网膜中间神经元的动作电位产生。图 2A 显示了在正常条件下，对小黑斑刺激（灰底背景）所记录的兴奋性和抑制性电导波形注入后，神经节细胞的代表性反应。当将 TTX 存在下、不同大小黑斑刺激所获得的电导波形注入同一细胞时，仅观察到微弱的反应（图 2B）。
图2C 展示了另一神经节细胞在注入不同组合的电导波形后的反应，其中调控了兴奋性与抑制性电导在对照条件下的比例（Gexc:Ginh 比例：1:0 至 1:2）。显然，随着抑制水平的增加，细胞的反应逐渐减弱。因此，通过调控兴奋与抑制之间的平衡，可量化其对神经元输出的影响。
我们还测试了改变兴奋与抑制...
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讨论
本文展示了利用动态钳技术评估兴奋与抑制的比率及其相对时序对视网膜神经节细胞输出影响的方法。动态钳技术利用计算机模拟，将生理记录或人工合成的突触电导引入活体神经元中。该方法提供了一种交互式工具，可对电导进行修改并注入神经元，以计算其对神经元反应的影响。电导波形可来源于实验，其中在对照条件以及药理学试剂存在下使用视觉刺激激活感光细胞，以分离特定细胞或回路的贡献。注入不同组合的这些电导波形可揭示其对放电输出的贡献。动态钳记录技术还可用于操控背景噪声水平，这可能在不同光适应条件下发生。此外，电导波形也可由突触输入模型生成，例如α函数，以及具有电压依赖性的突触输入（i.e. NMDA受体），也可用于电压门控离子通道或电耦合细胞。因此，不同条件之间的比较为理解不同突触机制对神经元反应及神经网络信号处理的贡献开辟了广阔的可能性。需要强调的是，尽管不同类型的神经节细胞表达明显不同的电压门控通道类型和密度，但我们发现突触电导整合的结果在不同细胞类型之间具有一致性。因此，尽管不同细胞类型的放电频率、峰间间隔和适应特性有所不同（数据未显示），兴奋性和抑制性电导的比率以及时序变化在反应中表现出相似的反映。
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披露
所有操作均首先经悉尼大学动物护理伦理委员会批准，随后依照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会《动物用于科学目的护理与使用实践规范》的指南进行。
致谢
本工作由澳大利亚研究理事会（ARC DP0988227）以及悉尼大学生物医学科学系生物医学科学研究计划资助金资助。膜片钳放大器EPC 8设备由悉尼大学生物医学科学系启动资金资助。InstruTECH LIH 8+8数据采集系统设备由Rebecca L. Cooper基金会以及悉尼大学生物医学科学系启动资金共同购置。我们谨向匿名评审专家致以感谢，感谢他们富有见地的建议和意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 异氟烷吸入麻醉剂 | Pharmachem | ||
| 含L-谷氨酸的艾姆斯培养基（粉末） | Sigma-Aldrich | ||
| 无水葡萄糖酸钾 | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES 钠盐 | Sigma-Aldrich | ||
| 氯化镁溶液（4.9 mol/l） | Sigma-Aldrich | ||
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | ||
| 鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | ||
| 乙二醇双(2-氨基–thylether)-N,N,N',N''四乙酸 | Sigma-Aldrich | ||
| 多聚甲醛粉末，95% | Sigma-Aldrich | ||
| 抗荧光黄，兔IgG组分（3 mg/ml） | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）2 mg/ml | Invitrogen | ||
| 荧光保存介质 | BioFX 实验室股份有限公司 | ||
| <强>仪器设备 | |||
| 带有火焰抛光端口的毛细玻璃管（外径 = 1.50 mm，内径 = 0.86 mm，长度 = 15 cm） | Warner Instruments | 64-0794 | |
| 单级玻璃微电极–电极拉制仪 | 日本 Narishinge | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm F过滤单元 | 默克密理博公司 | SLGV004SL | |
| 可重复使用鲁尔锁型皮下注射针头：30 G | Smith Nephew（澳大利亚） | ||
| 单通道在线溶液加热器 | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| 双自动温度控制器 | Warner Instruments | TC-344B | |
| 奥林巴斯体视显微镜 SZ61 | 奥林巴斯株式会社 | ||
| 奥林巴斯显微镜 BX50WI：配备 40X 物镜 | 奥林巴斯株式会社 | ||
| 0-30 V 2.5 A 直流电源 | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| ProgResMF cool 数字显微相机 | Jenoptik | ||
| 显微操作仪 MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| 膜片钳放大器 EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 数据采集系统 | HEKA Elektronik | ||
| 计算机：DELL | 戴尔公司 |
参考文献
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