该 离体 双循环人胎盘灌注模型可用于研究异源物质和纳米颗粒在人胎盘中的转运。在本视频方案中，我们描述了成功实施胎盘灌注所需的设备与技术。
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本文内容
摘要
摘要
几十年前，人类胎盘曾被认为是在母亲与胎儿之间不可逾越的屏障。然而，沙利度胺导致出生缺陷的发现以及随后的大量研究证实了相反的结果。如今，已有多种有害外源性物质被证实能够穿越这一屏障，包括尼古丁、海洛因、美沙酮等药物以及环境污染物。随着纳米技术的广泛应用，胎盘可能因意外暴露或潜在的纳米医学应用而与新型纳米颗粒发生接触。由于胎盘是哺乳动物中物种特异性最强的器官，来自动物实验的数据无法外推至人类。 1因此， 离体 双循环人胎盘灌注，由 Panigel 建立 等 1967年 2 并由施耐德持续改进 等 1972年 3可作为研究异源物质或颗粒转移的优良模型。
本文重点介绍ex vivo人胎盘双循环灌注实验方案及其进一步优化，以获得可重复的实验结果。
胎盘样本取自签署知情同意书的健康足月妊娠产妇，这些产妇接受了剖宫产手术。对完整小叶的胎儿和母体血管进行插管，并至少持续灌注五小时。作为模型颗粒，将直径为80 nm和500 nm的荧光标记聚苯乙烯颗粒加入母体循环系统。80 nm的颗粒能够穿过胎盘屏障，是可经胎盘转运至胎儿体内物质的典型范例；而500 nm的颗粒则被滞留在胎盘组织或母体循环中。ex vivo 人胎盘灌注模型是少数能够提供有关异源物质在重要组织屏障——胎盘——中转运行为可靠信息的模型之一，可获得具有预测性和临床相关性的数据。
引言
胎盘是一种复杂的器官，负责氧气、二氧化碳、营养物质和代谢废物的交换，同时能够使母体和胎儿的两个血液循环系统相互分离。此外，胎盘还能防止母体免疫系统对胎儿的排斥反应，并分泌激素以维持妊娠。细胞屏障由细胞滋养层细胞构成，这些细胞融合后形成真正的合胞体，其特点是不存在侧向细胞膜4,5。整个胎盘由多个胎盘小叶组成，每个小叶包含一棵胎儿绒毛树，代表胎盘的一个功能单位。
20世纪60年代发现沙利度胺可导致胎儿畸形后，对胎盘屏障功能的研究进一步加强。由于显而易见的原因，无法对孕妇开展物质转运研究。因此，人们已开发出多种替代模型6,7。其中最有前景且可能最具临床相关性的模型是Panigel及其同事建立的ex vivo人胎盘灌注模型2,3。
许多女性在怀孕期间会接触到各种外源性物质，例如药物或环境污染物8。对于某些在孕期已常规使用的药物，可通过比较母体血液与脐带血中的药物浓度来进行体内研究。然而，目前关于这些物质在胎儿体内的药代动力学和药效学特性及其致畸性的信息通常十分有限。
例如，像海洛因这样的阿片类药物容易穿过胎盘屏障，可能导致胎儿宫内发育受限、早产或自然流产 9,10因此，若在妊娠期间未能做到禁欲，则建议采用美沙酮替代治疗。 ....
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方案
1. 准备灌流系统
- 设置灌注系统，包括水浴箱、灌注腔室、两个氧合柱、两个蠕动泵、两个气泡捕获器、两个流体加热器和一个压力传感器（图1）。根据图2所示示意图，使用硅胶和聚氯乙烯材质的管路将这些组件连接起来。最终形成分别代表胎儿和母体循环的两个回路。
- 开启水浴箱、流体加热器以及灌注腔室的加热功能，温度应维持在37 °C。
- 在水浴箱中预热灌注液（NCTC-135组织培养基用Earle's缓冲液按1:2稀释，Earle's缓冲液成分为：6.8 g/L氯化钠、0.4 g/L氯化钾、0.14 g/L磷酸二氢钠、0.2 g/L硫酸镁、0.2 g/L氯化钙、2 g/L葡萄糖），并补充以下成分：葡萄糖（1 g/L）、右旋糖酐40（10 g/L）、牛血清白蛋白（10 g/L）、肝素钠（2,500 IU/L）、阿莫西林（250 mg/L）和碳酸氢钠（2.2 g/L）；pH值为7.4。
- 依次用以下溶液冲洗胎儿和母体回路的动脉系统：a) 200 ml蒸馏水，b) 50 ml 1%氢氧化钠溶液，c) 1%磷酸溶液，d) 再次使用200 ml蒸馏水（流速：15 - 20 ml/min）。
- 将胎儿端套管（Ø 1.2 mm；钝针应连接至改良的带翼针头输液装置）与胎儿动脉管路连接。
- 用灌注液冲洗胎儿和母体回路的动脉系统，直至所有管路中均充满灌注液（流速：15–20 ml/min....
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结果
图4A展示了小粒径聚苯乙烯颗粒（80 nm）的灌注曲线，这些颗粒可穿过胎盘，而较大粒径的聚苯乙烯颗粒（500 nm）则未被转运至胎儿腔室。每个数据点代表至少3次独立实验中在指定时间点的平均颗粒浓度。聚苯乙烯纳米颗粒的胎盘转运具有尺寸依赖性19。在胎盘灌注3小时后，已有20–30%初始加入的80 nm聚苯乙烯颗粒从母体循环转移至胎儿循环，而500 nm的聚苯乙烯颗粒即使在灌注6小时后仍未出现在胎儿循环中。然而，母体侧500 nm颗粒的浓度有所下降。灌注后组织切片的荧光成像显示，这些颗粒在胎盘绒毛中积聚（数据未显示）。图4B展示了放射性标记的14C-安替比林的典型灌注曲线。安替比林作为一种小分子脂溶性物质，可通过被动扩散穿过胎盘屏障，常被用作评估循环系统完整性的对照。在灌注4–6小时后，胎儿与母体之间的安替比林浓度应达到平衡23。为了评估和比较外源性物质的胎盘转运速率，通常以胎儿与母体药物浓度比值（F/M比值）来表示（图5）。
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讨论
在本文展示的双循环灌注方法之外，还可根据具体研究问题采用其他多种实验设计。特别是开放式胎盘灌注，常用于评估药物在稳态浓度下的清除率3。循环灌注系统也可用于验证内源性或外源性物质是否存在主动转运。在此方法中，需将相同浓度的外源性物质同时加入母体和胎儿循环系统。若存在逆浓度梯度的主动转运，则可能观察到待测物质在其中一个循环系统中的积累现象24。值得注意的是，仅向胎儿循环系统添加待测物质也是可行的，该方法有助于揭示该特定物质穿越胎盘屏障的转运机制25。
该方案随着时间的推移不断发展，不同研究团队之间在灌注流速、灌注液组成、氧合方式和加热条件等方面可能存在差异26,27。尤其是流速可能影响物质经胎盘转运发生的时间点。为控制这一变量，加入一种被动转运的参考化合物（如安替比林）至关重要。待测外源性物质的转运速率可始终与安替比林的转运速率进行比较（F/M比值应高于0.75）26。由于安替比林的转运主要受限于灌注流速和交换表面积，因此该比较可校正实验间灌注流速及灌注叶大小的差异。此外，可在.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本工作由瑞士国家基金会（NRP 64 项目，资助号 4064-131232）提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NCTC-135 培养基 | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | 可用 Sigma 的 Medium 199（M3769）替代 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| 氯化钾（KCl） | 医院药房 | 也可使用 Sigma（P9541） | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4 · H2O） | Merck | 106346 | |
| 硫酸镁（MgSO4 · H2O） | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| 氯化钙（CaCl，无水） | Merck | 102388 | |
| D(+)葡萄糖（无水） | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Merck | 106329 | |
| 右旋糖酐（来自 Leuconostoc spp.） | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Applichem | A1391 | |
| 阿莫西林（Clamoxyl） | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| 肝素钠 | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| 氢氧化钠（NaOH）颗粒 | Merck | 106498 | 注意：具有腐蚀性 |
| 85% 正磷酸（H3PO4） | Merck | 100573 | 注意：具有腐蚀性 |
| 母体气体混合物：95% 合成空气，5% CO2 | PanGas AG | ||
| 胎儿气体混合物：95% N2，5% CO2 | PanGas AG | ||
| 安替比林（N-甲基-14C） | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | 注意：放射性物质（比活度：55 mCi/mmol） |
| 闪烁液（IrgaSafe Plus） | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| 80 nm 聚苯乙烯微粒 | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| 500 nm 聚苯乙烯微粒 | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| 仪器设备 | |||
| 水浴锅 | VWR | 462-7001 | |
| 恒温器 | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | ISM 833 | |
| 气泡捕集器（玻璃） | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| 流体加热器 | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| 压力传感器 + 分析软件 | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| 笔记本电脑 | Hewlett Packard | ||
| 微型气体交换氧合器 | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon 管（内径：1.6 mm；外径：4.8 mm） | Ismatec | MF0028 | |
| 泵用管（PharMed BPT；内径：1.52 mm） | Ismatec | SC0744 | |
| 钝头套管（0.8 mm） | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| 钝头套管（1.2 mm） | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| 钝头套管（1.5 mm） | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| 钝头套管（1.8 mm） | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm 封口膜 | VWR | 291-1212 | |
| 带组织固定装置的灌流室（有机玻璃） | 内部技术部门 | 类似设备可从英国 Hemotek Limited 获得 | |
| 外科缝合材料（PremiCron） | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| 带翼针输液套件（21G 蝴蝶针） | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| 多向停流阀（Discofix C-3） | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| 外科剪刀 | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| 解剖剪刀 | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| 持针器 | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| 解剖镊 | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| 全自动血气分析系统 | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| 多功能微孔板读板仪 | BioTek | Synergy HT | |
| 液体闪烁分析仪 | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| 5.5 ml 闪烁管 | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| 组织匀浆器 | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH 计 + 电极 | VWR | 662-2779 |
参考文献
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L.
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重印与许可
