原代细胞培养是一种用于分析特定细胞群体的有用技术，尤其适用于特定发育阶段的转基因小鼠胚胎。本文中，通过分离和解离胚胎心室，利用抗体偶联磁珠识别并分离内皮细胞，以进行后续分析。
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本文内容
摘要
摘要
细胞培养极大地提升了我们在多种培养条件下评估特定细胞群体的能力。尽管永生化细胞系因其操作简便而具有显著优势，但并非所有潜在的细胞类型都有相应的细胞系可供使用。通过从特定目标区域（尤其是转基因小鼠）分离原代细胞，可以开展更为精细的研究。该基本技术包括解剖目标器官或器官的部分区域（例如 心脏或心脏的特定区域）并将其解离为单个细胞。随后将这些细胞与磁珠共孵育，磁珠上偶联有识别目标细胞类型的抗体。利用磁铁即可分离出目标细胞，再通过短暂的胰蛋白酶孵育使细胞与磁珠分离。分离得到的细胞可根据需要进行培养和分析。该技术最初是为成年小鼠器官设计的，但可轻松缩小规模以适用于胚胎器官，本文即展示了这一应用。由于我们的研究重点是发育中的冠状血管系统，因此希望在特定的胚胎发育阶段研究这一细胞群体。因此，原始方案必须进行修改，以适应胚胎心室体积较小以及在这些发育阶段内皮细胞得率较低的特点。通过采用这种缩小规模的方法，我们对转基因胚胎心室来源的内皮细胞中冠状血管丛的重塑过程进行了评估。
引言
永生化细胞系的出现彻底改变了基础细胞生物学 1目前可用的细胞系来源于多种器官，涵盖了所有主要的细胞类型。然而，已建立的细胞系存在一些局限性。永生化过程显然会改变细胞的行为，特别是在寿命和增殖方面，还可能影响某些非预期蛋白的表达，例如细胞骨架蛋白。 2此外，尽管已有多种不同的细胞系可供使用，但在同一生物体内的单一细胞类型中仍存在显著差异。内皮细胞尤其如此，其行为特征因分布于动脉或静脉，以及所在血管中血流类型的不同而表现出多样性。 3但从发育学角度来看，更为紧迫的问题是，目前绝大多数可用的细胞系均来源于成体组织（参见， 例如 可通过ATCC获得的这些成体细胞系可能无法重现其胚胎前体细胞的动态特性。发育过程中观察到的快速变化的时空基因表达模式也提示，在特定发育阶段某一器官中的内皮细胞，其行为可能不同于同一器官在另一发育阶段的内皮细胞。
与使用商业化的永生化细胞系相比，可从特定的目标组织中分离原代细胞。该技术的优势之一在于，可在特定发育阶段从特定器官甚至器官的某一部分中分离这些原代细胞。此外，还可从多种可用的转基因动物中分离这些原代细胞，从而实现 体外 在避免转染效率等问题的同时，对基因敲除和敲入进行研究。毫不奇怪，已有大量技术文献发表，详细阐述了如何分离特定细胞类型 4,5通常，这些技术包括采集目标区域，解离细胞，标记特定的目标细胞类型，并分离这些细胞以进行后续分析。
为了研究早期胚胎冠状血管内皮细胞群体，我们对先前发表的一种技术4进行了缩放调整，使其适用于更小的器官。通过这种缩小规模的操作流程，我们能够在特定的胚胎发育阶段从胚胎心脏中分离出冠状血管内皮细胞。这些细胞随后可用于传统的内皮细胞实验，例如迁移分析。在早期胚胎细胞系尚未广泛应用之前，使用原代细胞是一种极为宝贵的技术手段。
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方案
1. 准备抗体偶联磁珠
- 解剖前一天，将所选抗体与相应的Dynabeads结合（例如 用于大鼠来源抗体的抗大鼠IgG Dynabeads，4 x 108 beads/ml）操作。对于BD大鼠抗CD31抗体（0.5 μg/μl，用于分离内皮细胞），每25 μl磁珠加入3 μl抗体，终浓度为1.5 μg抗CD31抗体和1 × 107 珠子/25 μl 缓冲液
- 4 °C 条件下将珠子与抗体孵育过夜。
2. 准备胶原板
- 将分离的细胞培养在胶原凝胶上时，其形成小管的速度比仅培养在胶原包被的培养板上更快。因此，胶原凝胶需在解剖前一天晚上制备，具体方法如文献6所述。在冰上、组织培养超净台内，混合以下试剂（足够19孔使用）：206.4 μl 无菌H2O、140.4 μl I型胶原蛋白（4.08 mg/ml）、38.4 μl 10x M199和1.15 μl 5 M NaOH。
- 将20 μl上述胶原凝胶加入384孔组织培养板的各孔中，将培养板置于37 °C组织培养孵育箱中孵育30分钟。
- 每孔加入80 μl DMEM，于37 °C孵育15分钟。吸除培养基后，重复此洗涤步骤两次。
- 最后一次冲洗后，每孔加入80 μl含10% FBS的DMEM，于37 °C孵育过夜。在加入分离细胞前，移除培养基。
3. 切除并消化心脏
- 使用经批准的安乐死方法，在所需胚胎发育天数处死一只定时妊娠小鼠。所有实验均经北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会批准。
- 将小鼠仰卧放置，解剖前用70%乙醇大量喷洒雌鼠腹侧。用镊子提起下腹部皮肤和肌肉，使其远离内脏器官，切开雌鼠下腹部以暴露内脏器官。
- 用镊子夹住宫颈，在镊子远端小心剪断，并开始从腹腔中提起子宫角。在提起子宫角的同时，剪除固定子宫角的任何结缔组织。为完成子宫角的切除，剪断子宫角与输卵管的连接处，使子宫角游离。
- 将子宫角放入含有冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，根据需要进行冲洗。沿中线切开子宫角，暴露附着的胚胎囊。
- 在胎盘与胚胎的连接处切开一个胚胎囊，以避免意外损伤胚胎，并取出胚胎。将胚胎放入另一个含有冷PBS的培养皿中。将装有子宫角的培养皿放回冰上。
- 切除胚胎头部以改善对胸壁的暴露。如需基因分型，剪下尾部并保存于置于冰上的离心管中。
- 将胚胎背部朝下放置，切开胸壁以暴露心脏和肺。为避免损伤心脏，沿肋骨一侧靠近前肢处做垂直切口，再在肋骨底部做水平切口；然后轻轻将胸壁向上和向外拉开。在胚胎发育约第13.5天之前，胸壁是透明的，有助于观察。
- 用镊子小心提起心脏，并剪断下方血管。然后在大血管上方剪断，使心脏游离。如果未剪断肺血管，肺可能随心脏一同被取出。因此，必要时应去除肺等多余组织。
- 将心房和大血管从心室分离并弃去。用剪刀将心室剪成小块（约1 mm3），放入约500 μl胶原酶溶液（1 mg/ml，溶于无菌PBS）中。在所有心室剪碎并放入胶原酶之前，将样品保持在冰上。
- 重复前述步骤，直至从所有胚胎中切除心室，并将每个心脏收集到单独的离心管中。如果所有胚胎基因型相同，可将心脏合并至同一离心管中。单次处理的样品数量可能受限于所用磁力架的容量；本实验使用的DynaMag（123-21D）最多可容纳16个离心管。
- 将剪碎的心室组织置于37 °C条件下振荡消化45分钟。每15分钟轻轻取出样品，用移液器上下吹打，以机械方式解离细胞。
4. 分离内皮细胞
- 将心室-胶原酶溶液通过70 μm滤膜，以去除残留的细胞团块。
- 在400 × g条件下离心细胞10分钟。弃去上清液，加入约200 μl含10% FBS的DMEM培养基，并反复吹打以解离细胞。
- 重复上一步骤一次。在第二次使用含10% FBS的DMEM洗涤后，于400 × g离心10分钟。将细胞重悬于50 μl含10% FBS的DMEM中。
- 在最后一次离心过程中，准备磁珠。
- 将含有抗体和磁珠的Eppendorf管置于磁力架上1分钟。
- 保持试管在磁力架上，吸除上清液。将试管从磁力架上取下，加入约100 μl含10% FBS的DMEM。
- 再次将试管置于磁力架上1分钟，吸除上清液，并用含10% FBS的DMEM洗涤。共重复洗涤3次。
- 最后一次洗涤后，将偶联抗体的磁珠重悬于含10% FBS的DMEM中（每份样品5 μl）。
- 向每份细胞样品中加入5 μl偶联抗体的磁珠。将磁珠-细胞悬液置于4 °C，轻轻摇动孵育30分钟。
- 在超净工作台内，将含有细胞和偶联抗体磁珠的Eppendorf管置于磁力架上1分钟。吸除上清液，将试管从磁力架上取下，用约100 μl含10% FBS的DMEM洗涤。重复洗涤共5次。
- 最后一次洗涤后，将试管置于磁力架上1分钟，吸除上清液，将试管从磁力架上取下。加入约100 μl DMEM。
- 将试管置于磁力架上1分钟，吸除上清液，将试管从磁力架上取下。加入100–200 μl预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将样品在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。
- 将试管置于磁力架上2分钟。小心将含有细胞的上清液转移至新的Eppendorf管中。在400 × g条件下离心5分钟。
- 弃去上清液。将细胞重悬于80–100 μl生长培养基中，并根据预期产量接种至96孔或384孔处理过的培养板中（E14.5–E16.5胚胎心室可获得约450–600个细胞）。对于内皮细胞，使用内皮细胞生长培养基（定义如下）。
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结果
使用一种特异性识别 CD31 的内皮细胞抗体，从胚胎期（E）13.5 天的脑室中分离内皮细胞图1A）和 18.5（图1B-1D）胚胎。当在未经处理的培养皿中培养时，这些细胞保持圆形，若接近汇合则会形成铺路石样形态。图1A）。稀释的胶原蛋白也已被用于包被孔板，内皮细胞可黏附于其上（图1B），它们形成的链状结构少于在胶原凝胶上培养时图1C和图1D）。在含有胶原凝胶的孔中培养的内皮细胞（图1C和图1D）形成细胞间相互作用，并在胶原上生长时开始形成分支的链状结构，而在胶原凝胶上生长时这一过程比在胶原包被的培养板上更快。这些内皮细胞链可被内皮标志物异凝集素（iso-lectin）特异性标记呈阳性图1D）。分离的细胞在培养中可存活长达1周，但已证明对胰蛋白酶消化具有抗性（即使在37℃下作用1小时 37 °C); 因此，它们最适合用于终点实验。
从 E18.5 ...
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讨论
使用原代胚胎细胞可开展新颖的实验，以研究体外（in vitro）发育过程中的关键步骤。然而，细胞分离过程并非易事。分离各类细胞的关键步骤包括：确保细胞在胶原酶消化后充分分散，以及在洗涤过程中保持良好的悬浮状态。在胶原酶消化阶段，通过移液进行机械性解离可显著促进细胞分离，而过滤步骤则可去除细胞团块。这些操作可提高细胞群体的纯度和得率。
从较小的器官中分离细胞时，铺板密度也是一个重要问题。由于内皮细胞成管形成依赖于细胞密度7，我们采用384孔组织培养板以提高铺板密度。即便如此，我们仍需对部分分析方法进行调整，以适应较低的细胞密度（Dyer 和 Patterson，进行中）。因此，如果细胞数量有限，使用更小尺寸的培养孔可能有助于缓解这一问题。
分离原代细胞的另一个局限性在于抗体的特异性。即使是公认的内皮细胞特异性蛋白（如CD31），有时也会在成纤维细胞中表达8。如果收获的细胞数量足够进行流式细胞分选（FAC sorting），则可根据荧光强度将内皮细胞与成纤维细胞...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Andrea Portbury对文稿的审阅，感谢北卡罗来纳大学显微镜服务中心在延时成像方面的协助，以及美国国立卫生研究院（资助号：R01HL061656）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 妊娠期定时小鼠 | 在感兴趣的胚胎阶段进行解剖 | ||
| 抗小鼠 CD31 | BD生物科学 | 553370 | |
| 大鼠IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| 胶原蛋白 | BD 生物科学 | 354236 | |
| PBS（1×） | |||
| I型胶原酶 | 沃辛顿生物化学 | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| 内皮细胞生长培养基 | （按注释中所述在实验室中制备） | 含20% FBS的DMEM μM β巯基–乙醇，50 μ微克/毫升 ECG，以及 1 倍青霉素/链霉素 | |
| β-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 心电图系统 | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384孔培养板 | 格雷纳 | T-3037-6 | 培养板用一层薄的胶原凝胶制备，如所述 6；工作表面积 10 mm2 |
| I型胶原蛋白 | BD | 354236 | 使用终浓度为 1.5 mg/ml |
| M199，10 倍浓缩液 | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | 按说明使用 13 |
| <强>设备 | |||
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ645 | |
| 细胞培养箱 | 赛默飞世尔科技（Thermo） | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| 台式离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75002430 |
参考文献
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
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重印与许可
