生物传感器检测抗生素耐药金黄色葡萄球菌细菌

Summary

溶解性噬菌体生物传感器和抗体有孔玻璃珠，能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感的金黄色葡萄球菌细菌。在噬菌体一个石英晶体微天平传感器的表面上固定由LB膜法，担任广泛葡萄球菌探针。抗体珠认识MRSA。

Abstract

甲结构转化的裂解的噬菌体具有广泛的宿主范围的金黄色葡萄球菌菌株和青霉素结合蛋白（PBP 2a）的抗体的乳胶珠已被用于创建的生物传感器设计（MRSA）和耐甲氧西林敏感（MSSA）S歧视。金黄色葡萄球菌种^1,2。裂解噬菌体噬菌体球体已转换成通过用氯仿接口接触。生物传感器表面上已经移到噬菌体球体单层LB膜技术^（LB）3。创建的生物传感器已经由耗散跟踪石英晶体微天平（QCM-D），以评估细菌噬菌体的相互作用的研究。细菌的旋转椭球体的相互作用导致降低了谐振频率和两个MRSA和MSSA菌株中耗散的能量增加。细菌绑定后，这些传感器被进一步暴露的青霉素结合蛋白的抗体乳胶珠秒。分析与MRSA的传感器响应PBP 2a的抗体珠;，虽然传感器与MSSA检查没有任何反应。这个实验的区别确定一个明确的耐甲氧西林敏感的学之间的歧视金黄色葡萄球菌菌株。同样绑定和未绑定噬菌体表面上抑制细菌的生长，并在水中悬浮。一旦裂解噬菌体被改变成球体，他们保留自己的强有力的催化活性和大量细菌捕获能力。噬菌体和噬菌体的球状体，可以利用抗生素抗性的微生物进行测试和灭菌。其它应用可能包括利用噬菌体治疗和抗菌表面。

Introduction

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已被建议作为必不可少的一个因素，感染及院内爆发^4-8。甲氧西林耐药的认可，常见的方式，如纸片扩散法苯唑西林琼脂屏幕测试，或肉汤稀释量身定制的培养条件下，依靠增强表达的阻力。改建包括利用苯唑西林，潜伏期为30或35°C，而不是37℃，并加入氯化钠中的生长培养基。此外，为了正确检测这些类型的技术，一个很长的潜伏期为24小时，而不是16至18小时。快速的技术鉴定耐甲氧西林的灵敏度（> 96％）的水平适当的技术，如维特克GPS-SA卡，快速ATB金黄色葡萄球菌系统，快速迈思肯面板系统包括自动稀释3-11小时后产生的结果^9-11。 CRYSTAL MRSA ID系统是一种快速的方法，根据承认生长的影响黄色葡萄球菌的存在下，2％NaCl和4毫克每升苯唑西林具有对氧敏感的荧光传感器。声称灵敏度范围91至100％之间，4小时后孵化^12-14。这些表型的方法在其精度是有限的流行株表达异构性的影响。因此，甲氧西林耐药的确认最好的被广泛接受的方法是PCR或DNA杂交mecA基因^15。然而，这种技术需要纯化的DNA，是极其敏感的各种混合物（杂质），其中包括细胞碎片^16。

此外，这些技术需要很长的时间来执行。策略，以确认mecA基因的产品，蛋白PBP 2a中，可以利用，以确定电阻，并可能更可靠的标准测试技术^17。

前面已经表明，可以利用噬菌体12600作为识别探针为包括那些具有^1,2,18甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌菌株。在这项工作中，我们提出了一种新的技术，例如在特定的识别和检测MRSA细菌一起构象的MRSA实时确认。对于这个特定的目的S.金黄色葡萄球菌噬菌体结合蛋白单克隆抗体的广泛的主机（包括MRSA菌株）（PBP 2a的）已被使用。 PBP 2a是细胞壁蛋白，它是MRSA的抗生素的电阻率的原因。然而PBP 2a的抗体是不特定为S金黄色葡萄球菌，因为一些其他细菌的抗生素结合蛋白序列相似PBP 2a的^19,20。因此在这项工作中，S.金黄色葡萄球菌噬菌体和抗PBP 2a的蛋白已被使用。为了能够开发出一种生物传感器，具体新增Cally MRSA的检测和识别设备已动用两个步骤的行动。最初的步骤使用了S。金黄色葡萄球菌噬菌体单层作为传感器探头，而第二个步骤中使用PBP 2a的特异性抗体。因此，加强一眼便认出S。金黄色葡萄球菌的细菌，其他人会敏感抗生素结合蛋白。当从两个步骤中接收到的信号是正的，则表示的特定检测MRSA。

Protocol

1。设置舞台

1. 获取型菌株S。金黄色葡萄球菌 ATCC 12600，S.金黄色葡萄球菌 ATCC 27690和枯草芽孢杆菌 ATCC 6051。耐甲氧西林菌株的金黄色葡萄球菌 - MRSA1，MRSA，MRSA，MRSA MRSA MRSA 5 13 26 34 45，MRSA，B.福氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌 LT2， 炭疽斯特恩耶尔森氏菌enterocolotica，奇异变形杆菌，肺炎克雷伯菌 13882;裂解噬菌体12600。
2. 获得PBP 2a的抗体乳胶颗粒。
3. 准备NZY的介质描述^21。
4. 获得的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中。
5. 准备去离子水为LB膜（LB）单层沉积亚相。

2。噬菌体繁殖和滴定

1. 孵育5毫升过夜培养S.金黄色葡萄球菌 ATCC 12600（3.6×10 ⁸菌落形成单位（CFU）/毫升）与500μl的噬菌体（3×10 ^{9 <}/ SUP> PFU /毫升）500毫升的NZY介质在2升长颈瓶摇床培养箱中37℃过夜。
2. 离心文化在4,424 XG 10分钟，在4°C。
3. 再离心上清在4℃下11,325 xg离心10分钟
4. 通过0.22μm微孔过滤器过滤上清液。
5. 离心滤液在75395×g离心1.5小时。
6. 沉淀溶解于100μl蒸馏水中。
7. 准备的噬菌体悬浮液的10倍稀释液，在NZY培养基中。
8. 板1毫升过夜（ON）的S.文化金黄色葡萄球菌 ATCC 12600到每个2板NZY琼脂，以确保所有的表面被水覆盖。取出多余的文化和30分钟，让表面干燥。
9. 现货板表面上适当的噬菌体稀释样品（10微升），并在^37℃孵育18-24小时。
10. 检查斑块的形成，并计算噬菌体滴度。噬菌体滴度（T）的p的数目的基础上估计的噬菌体悬浮液和稀释倍数（F）的10微升体积（v）条形成的laques（N）的数目。滴度计算公式计算:T = N /（VXF），例如，对于空斑数75在稀释10 ^-7和10微升的体积（10×10 ^-3毫升），滴定度等于75 / （10×10 ^{-3×10 -7）=} 7.5×10 ¹⁰噬斑形成单位（PFU）每ml悬液。

3。黄金固定噬菌体的

1. 清洁金涂层的石英片（60毫米^2）通过等离子蚀刻10分钟，然后在氩气中的灭菌6小时，在UV光下在无菌柜。
2. 加入50μl的1×10 ⁹ PFU / ml的噬菌体悬浮液在无菌培养皿中的每一块在金表面，然后在室温下在潮湿的腔室中孵育过夜。
3. 删除及滴度剩下的噬菌体悬液。
4. 结合的噬菌体件，5倍，用PBS洗涤除去未结合的噬菌体。

4。在干燥的表面固定化噬菌体侵染测试

1. 金黄色葡萄球菌 ATCC 12600 O / N的文化传播到NZY琼脂平板上，并让干燥。
2. 将黄金固定噬菌体到的板面。
3. 观察一个区域的温育12小时后溶解在37℃下，该值指示传染性。
4. 使用黄金覆盖件在对照实验中，没有噬菌体。

5。结合的噬菌体液体催化活性测试

1. 添加ON文化S.黄色葡萄球菌 ATCC 12600到10毫升的NZY在每一个四个300毫升侧臂的烧瓶中（6×10 ⁶ CFU / ml的每个烧瓶中）。
2. 加在两个烧瓶2×10 ⁶ PFU / ml的游离噬菌体。
3. 使用作为对照组的另外两个烧瓶。
4. 监控到的时间过程中，S。 570分钟由金黄色葡萄球菌细胞裂解测量光密度（OD _600）在30分钟的时间间隔为所有烧瓶。
5. 以最终在24小时测量。
6. 重复步骤5.1-5.5，但与对照烧瓶没有噬菌体结合的噬菌体，而不是免费的噬菌体，使用金币和金币。

6。孵化过程中结合的噬菌体亏损

1. 添加50μl的1×10 ⁹ PFU / ml的噬菌体无菌金片的表面上，在培养皿中，置于潮湿的腔，在室温下过夜。
2. 取下悬挂与未结合的噬菌体的黄金表面和滴度。
3. 洗涤5次，用PBS，地点在1毫升的NZY溶液摇床培养箱中在15毫升管结​​合的噬菌体金片在37℃下8小时。
4. 确定如2所述的分离的噬菌体的滴度。

7。噬菌体球体准备

1. 用1毫升的小瓶分光级的氯仿的等体积的结合库存噬菌体12600悬浮液（10 ¹¹ PFU /毫升）的400微升在室温下。
2. 轻轻涡旋噬菌体氯仿暂停一分钟持续时间超过5-6次（间隔5秒）。
3. 宠物的悬浮液稳定，持续30秒，然后移液管顶端相，含有单层制备吸球粒。
4. 径的球状体的悬浮液，用于传输和扫描电子显微镜几微升。
5. 使用剩余的球体悬浮生物传感器制造业。

8。生物传感器的制备

1. 清洁QCM-D传感器在氩气等离子体刻蚀10分钟哈里克PDC-32G等离子清洗机。
2. 用己烷冲洗传感器，以消除任何有机杂质。
3. 准备和清理的电影中所描述的²²平衡低谷。
4. 填写LB槽，一个副相解决方案和清洁槽屏障和稳定的低谷，在20±0.1°C
5. 传播300微升等分的噬菌体12600在水suspensi（10 PFU / ¹¹毫升）到LB副相。
6. 准备噬菌体单层到LB副相溶液通过允许300微升噬菌体12600水悬浮液（10 PFU / ¹¹毫升），运行等分可湿性玻璃棒部分浸没入亚相^22,23倾斜。
7. 稳定10分钟后，制备的单分子层，然后将压缩的速度为30毫米/分钟（45厘米/分），直到一个恒定的压力达到19牛顿/米。
8. 执行垂直的膜沉积于垂直定位的QCM-D传感器的速率为4.5毫米/分钟，，依次浸渍传感器中的单层七次。电子显微镜观察沉积的噬菌体单层前暴露于细菌样本显示层是连续的，均匀的和均匀的（数据未示出）。
9. 重复步骤4.5-4.8噬菌体球体悬浮准备3。
10. MRSA的检测，电子制造噬菌体生物传感器显微镜和椭圆。

9。生物传感器的测试，歧视耐甲氧西林敏感的葡萄球菌

1. 在这个协议中，生物传感器与未改性和改性的噬菌体和噬菌体球体的准备。采用石英晶体微有四个传感器流量室是用来监测结合的细菌的噬菌体固定在QCM传感器表面。 PBP 2a的抗体乳胶珠利用区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感的葡萄球菌。在流模式（50微升/分钟）进行所有的测量都在5 MHz。
2. 建立一个基线水（〜30分钟）的QCM传感器的共振频率。
3. 绘制活甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的细菌细胞在水（10 ⁹ CFU / ml）的通过测试细胞的悬浮液中。
4. 不断监测变化的传感器共振频率和耗能第一泛音，USI使用Q-Soft软件。
5. 当传感器的谐振频率和耗散的变化达到饱和电平，加到PBP抗体共轭乳胶珠（6.77×10 ¹⁰珠/毫升）的悬浮液的流动过程中连续监测频率和耗散。
6. 重复步骤9.2-9.5耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的细菌细胞。
7. 通过大规模的变化，由于细菌结合Sauerbrey方程^{24,25ΔF=ΔMXN} / C，其中C是质量灵敏度常数（C = 17.7纳克为x cm ^{-2 X}赫兹^-1在5 MHz定义的频率变化） 中，m是质量，n是谐波数（n = 1时）。
8. 定义了一个能量耗散的变化（ΔD）从记录的指数衰减振荡（频率和振幅衰减，这使得定量消耗的能量和存储在一个周期内的振荡ê _消散 和电子_存储 ，分别为:ΔD =Ë _消散 / 2 _存储 πE。 ΔD是测量消散单元（DU），DU = 10 ^-6相对单位）。

Results

对所有测试菌株的噬菌体展示催化活性金黄色葡萄球菌 ，MRSA菌株，所指示的噬菌体斑点试验。斑块的大小一般从5毫米到15毫米不等。没有对其他测试（ 表1）文化活动被发现。

一个正常的生长的影响ATCC 12600 金黄色葡萄球菌在37℃摇床培养箱在的NZY介质上显示如图1A（曲线标记的空圈）。细菌的数量增加至3.2×10 ^{6〜4.0×10 8} CFU /毫升（实心圆标记的曲线图1A）示出结果的共培养2.0×10 ⁶ PFU / ml的免费噬菌体同时添加有相同浓度的S.金黄色葡萄球菌 ATCC 12600。噬菌体，固定在金表面上，表现出的催化活性与噬菌体悬浮液中的活性（ 图1A，曲线由自上而下三角形标记）。保持固定化的噬菌体感染金片与噬菌体时，最初是用在生长24小时的实验，然后它被洗涤5次，并存储在PBS中6天，在4℃，...

Discussion

这是众所周知的，细菌病原体的生物传感器探针²⁸可以用作噬菌体。这是表明在这项工作中，可以被用来解决的老问题:快速鉴别抗生素抗性及敏感菌株的噬菌体一起与PBP 2a的抗体。

发现，但那些正常的未改性的金黄色葡萄球菌噬菌体细菌检测与QCM装置​​是不适合的，尽管它们绑定细菌。噬菌体尾部是如此之长，声波不能"达到"约束的细菌噬菌体尾结束。这种情况会导致在"质量缺失"的效果²⁹和无力注册共振频率和耗散的变化表明EM在尽管显著结合的图像（ 图3A和3B）。这个问题很容易解决与球体更换完整的噬菌体，噬菌体氯仿水处理修改。这种治疗导致全功能p哈格与短，粗和非柔性的尾巴（ 图2D，2E，2F）。当噬菌体换成生物传感器中的球体，很容易被检测到MRSA的QCM-D设备。

当噬菌体金表面粒子被束缚在一个正确的方向，及其受体访问主机菌。如果噬菌体的固体表面和干燥的细菌层之间的直接物理接触时，固定化的噬菌体能够注射到宿主细菌（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich， St. Louis， MO	P4417
分光光度级氯仿	Sigma-Aldrich， St. Louis， MO	154733	（99.8% A.C.S.）
己烷-无水	Sigma-Aldrich， 圣路易斯， MO	29609-0	（95%）
乙醇	Pharmco products Inc. 布鲁克菲尔德， CT	64-17-5	190 Proof
设备
PBP 2a 抗体偶联乳胶珠	Denka Seiken Co.， Ltd， Tokyo， Japan	MRSA 筛选测试
S. aureus ATCC 12600、S. aureus ATCC 27690 和 Bacillus subtilis来自	美国典型培养物保藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）
MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B. anthracis Sterne、鼠伤寒沙门氏菌LT2、福氏志贺氏菌、小肠叶菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌 13882;裂解噬菌体 12600	本大学的
机	Beckman Coulter	Optima L-90K 超离心机
KSV 2200 LB 薄膜天平	KSV Chemicals，芬兰
光学显微镜光学系统	CitoViva Technology Inc.，奥本，阿拉巴马
	Q-Sense AB，Västra Frö瑞典隆达	E4
扫描电子显微镜 （SEM）	JEOL USA Inc.，马萨诸塞州皮博迪	JEOL-7000F SEM
透射电子显微镜 （TEM）	JEOL USA Inc.，皮博迪，马萨诸塞	JEOL，JEM 2010
Stericup，预灭菌	Millipore Corporation，马萨诸塞州比尔里卡	SCGPU05RE	0.22 μm，GP Express PLUS 膜
生物测定皿	NUNC A/S，丹麦	240835	尺寸（mm），245 x 245 x 25
移液器	Gilson，Pipetman，法国	P100、P200、P1000
C24 培养箱摇床	New Brunswick Scientific，CT	Classic C24
镀金石英片	奥本大学，阿拉巴		州 自制
培养皿	Fisher Brand，美国	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company，ME	SG403
培养培养瓶	Corning Incorporated，NY	4995	PYREX 250 ml 锥形瓶
仪	Genesys 20。Thermo Spectronic，美国。	4001
等离子清洗机	Harrick Plasma， 美国	PDC-32G
Millipore 净水系统	Millipore	Direct-Q
成像椭升光仪	Accurion， 美国	nanofilm_ep3se
软件	Q-Sense AB， 瑞典	QSoft， QTools