用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

摘要

裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。

摘要

一种结构转化的裂解性噬菌体，具有广泛的Staphylococcus aureus菌株宿主范围，并结合了青霉素结合蛋白（PBP 2a）抗体偶联的乳胶微珠，已被用于构建一种生物传感器，旨在区分耐甲氧西林（MRSA）和甲氧西林敏感（MSSA）的S. aureus菌种^1,2。该裂解性噬菌体通过与水-氯仿界面接触转化为噬菌体球状体。噬菌体球状体单层通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett, LB）技术转移至生物传感器表面³。所构建的生物传感器采用带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D）进行检测，以评估细菌与噬菌体之间的相互作用。细菌与球状体的结合导致MRSA和MSSA菌株均出现共振频率降低和耗散能量升高。在细菌结合后，这些传感器进一步暴露于青霉素结合蛋白抗体乳胶微珠中。经MRSA检测的传感器对PBP 2a抗体微珠产生响应，而经MSSA检测的传感器则无响应。该实验差异实现了对耐甲氧西林与敏感型S. aureus菌株的明确区分。无论结合态还是游离态的噬菌体均能抑制表面及水悬浮液中的细菌生长。一旦裂解性噬菌体转化为球状体，其仍保持强烈的裂解活性，并表现出高效的细菌捕获能力。噬菌体及其球状体可用于耐药微生物的检测与灭菌。其他应用可能包括噬菌体治疗及抗菌表面的开发。

引言

耐甲氧西林菌株 金黄色葡萄球菌 已被认为是导致原发性感染和医院内暴发的重要因素 ^4-8常见的耐甲氧西林检测方法，如纸片扩散法、苯唑西林琼脂筛选试验或肉汤微量稀释法，均依赖特定的培养条件以增强耐药性的表达。这些条件的调整包括使用苯唑西林、在30或35 °C而非37 °C下孵育，以及在培养基中添加氯化钠。此外，为确保这些技术的准确检出，需要24小时的较长孵育时间，而非通常的16至18小时。具有适当准确性的快速检测技术>96%）的敏感性水平用于鉴定耐甲氧西林耐药性，包括自动化微量稀释技术，例如 Vitek GPS-SA 卡、Rapid ATB Staph 系统和 Rapid Microscan Panel 系统，这些方法在 3–11 小时内出具结果 ^9-11. 晶体MRSA鉴定系统是一种基于识别生长情况的快速方法 S. aureus 在含2% NaCl和每升4 mg苯唑西林的条件下，使用氧敏感型荧光传感器进行检测。据称，在培养4小时后，敏感性范围为91%至100% ^12-14这些表型方法在准确性上受到普遍存在的、具有异质性耐药特性的菌株的影响，因此，目前公认最可靠的检测甲氧西林耐药性的方法是针对mecA基因的PCR或DNA杂交技术。 ¹⁵然而，该技术需要纯化的DNA，且对多种混合物（杂质）极为敏感，其中包括细胞碎片¹⁶.

此外，这些技术需要较长的时间才能完成。针对mecA基因产物PBP 2a蛋白的检测策略可用于判定耐药性，与标准检测方法相比可能更为可靠¹⁷。

先前的研究表明，噬菌体12600可作为识别包括耐甲氧西林菌株在内的Staphylococcus aureus菌株的识别探针^1,2,18。在本研究中，我们提出了一种用于特异性识别和检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的新技术，能够实现实时识别细菌并确认其是否为MRSA。为此，我们联合使用了一种宿主谱广泛的S. aureus噬菌体与针对PBP 2a蛋白的单克隆抗体。PBP 2a是一种细胞壁蛋白，是MRSA产生抗生素耐药性的原因。然而，PBP 2a抗体并不特异于S. aureus，因为其他一些细菌也含有与PBP 2a序列相似的抗生素结合蛋白^19,20。因此，在本研究中，我们同时采用了S. aureus噬菌体和抗PBP 2a蛋白的抗体。为了构建能够特异性检测和鉴定MRSA的生物传感器，我们采用了一种具有两步作用机制的装置。第一步使用S. aureus噬菌体单分子层作为传感探针，第二步则使用针对PBP 2a的特异性抗体。因此，第一步可识别S. aureus细菌，而第二步则对抗生素结合蛋白具有敏感性。当两个步骤均产生阳性信号时，即可确认为MRSA的特异性检测。

方案

1. 准备工作

1. 获取模式菌株 S. aureus ATCC 12600 S. aureus ATCC 27690 和 枯草芽孢杆菌 ATCC 6051。耐甲氧西林菌株 S. aureus - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌5、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌13、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌26、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌34、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌45、 B. anthracis 斯特恩, 鼠伤寒沙门氏菌 LT2 志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 13882；裂解性噬菌体 12600
2. 获取与PBP 2a抗体偶联的乳胶微珠。
3. 按所述方法制备NZY培养基 ²¹.
4. 获取磷酸盐缓冲液（PBS）。
5. 准备去离子水作为朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett，LB）单层膜沉积的亚相。

2. 噬菌体的扩增与滴定

1. 在2 L三角瓶中，将5 ml过夜培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600菌液（3.6 × 10⁸ 菌落形成单位（CFU）/ml）与500 μl噬菌体（3 × 10⁹ PFU/ml）加入500 ml NZY培养基中，于37 °C摇床培养箱中振荡培养过夜。
2. 在4 °C条件下，以4,424 × g离心培养物10分钟。
3. 将上清液再次在4 °C条件下以11,325 × g离心10分钟。
4. 使用0.22 μm Millipore滤膜过滤上清液。
5. 将滤液在75,395 × g离心1.5小时。
6. 用100 μl蒸馏水重悬沉淀。
7. 用NZY培养基对噬菌体悬液进行10倍系列稀释。
8. 将过夜（ON）培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600菌液各1 ml涂布于2块NZY琼脂平板表面，确保完全覆盖平板表面。吸除多余菌液，室温静置干燥30分钟。
9. 取适当稀释度的噬菌体悬液10 μl点样于平板表面，于37 ^oC培养18–24小时。
10. 观察噬菌斑形成情况并计算噬菌体滴度。噬菌体滴度（T）根据每10 μl噬菌体悬液（v）在平板上形成的噬菌斑数量（N）及稀释倍数（F）估算。滴度计算公式为：T = N / (v × F)。例如，当稀释度为10^-7、点样体积为10 μl（10 × 10^-3 ml）时，若观察到75个噬菌斑，则滴度为75 / (10 × 10^-3 × 10^-7) = 7.5 × 10¹⁰ 噬菌斑形成单位（PFU）/ml悬液。

3. 金固定的噬菌体

1. 将镀金石英片（60 mm²）在氩气中进行10分钟的等离子体刻蚀清洗，然后在无菌操作台中用紫外光照射6小时以灭菌。
2. 在无菌培养皿中，向每片石英片的镀金表面加入50微升浓度为1 × 10⁹ PFU/ml的噬菌体悬液，并在室温下的湿盒中孵育过夜。
3. 回收未吸附的噬菌体悬液并测定其滴度。
4. 用PBS洗涤已结合噬菌体的石英片5次，以去除未结合的噬菌体。

4. 干燥表面固定化噬菌体感染性的检测

1. 将金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 12600 的过夜培养物涂布于 NZY 琼脂平板上，静置使其干燥。
2. 将固定有噬菌体的金片朝下放置于平板表面。
3. 在 37 °C 培养 12 小时后观察溶菌圈，以确认噬菌体的感染活性。
4. 对照实验中使用未固定噬菌体的覆金片。

5. 检测游离及结合噬菌体在液体中的裂解活性

1. 在四个300 ml侧臂烧瓶中的每一个中加入10 ml NZY培养基，并接种处于对数生长期的S. aureus ATCC 12600（每瓶终浓度为6 × 10⁶ CFU/ml）。
2. 向其中两个烧瓶中加入终浓度为2 × 10⁶ PFU/ml的游离噬菌体。
3. 另两个烧瓶作为对照组。
4. 通过每30分钟测定一次光密度（OD₆₀₀），连续监测所有烧瓶中S. aureus细胞裂解的时间进程，持续570分钟。
5. 在24小时时进行最后一次测定。
6. 重复步骤5.1–5.5，但使用结合了噬菌体的金颗粒代替游离噬菌体，并在对照烧瓶中使用未结合噬菌体的金颗粒。

6. 孵育过程中结合噬菌体的丢失

1. 在无菌培养皿中的金片表面加入 50 μl 浓度为 1 × 10⁹ PFU/ml 的噬菌体，并将培养皿置于湿润环境中，室温孵育过夜。
2. 移除金片表面未结合的噬菌体悬液，并测定滴度。
3. 用 PBS 缓冲液将结合了噬菌体的金片清洗 5 次，然后放入含有 1 ml NZY 溶液的 15 ml 离心管中，在摇床培养箱中 37 °C 振荡孵育 8 小时。
4. 按照步骤 2 中所述方法测定脱落噬菌体的滴度。

7. 噬菌体球状体制备

1. 在1 ml小瓶中，将400 μl的噬菌体12600储备液（10¹¹ PFU/ml）与等体积的分光光度级氯仿在室温下混合。
2. 在1分钟内轻轻涡旋噬菌体-氯仿悬浮液5至6次（每次间隔5秒）。
3. 让悬浮液静置30秒，然后用移液器吸取含有球状体的上层相，用于单层膜制备。
4. 取少量球状体悬浮液用于透射和扫描电子显微镜观察。
5. 使用剩余的球状体悬浮液进行生物传感器的制造。

8. 生物传感器制备

1. 使用PDC-32G Harrick等离子清洗仪，在氩气中对QCM-D传感器进行10分钟的等离子体刻蚀清洗。
2. 用正己烷冲洗传感器，以去除任何有机杂质。
3. 按照文献²²所述方法准备并清洁膜天平的槽体。
4. 向LB槽中加入亚相溶液，并使用槽屏障进行清洁，将槽体温度稳定在20±0.1 °C。
5. 将300 μl噬菌体12600的水相悬浮液（10¹¹ PFU/ml）铺展到LB亚相表面。
6. 通过将300 μl噬菌体12600水相悬浮液（10¹¹ PFU/ml）沿部分浸入亚相的倾斜润湿玻璃棒流下，从而在LB亚相溶液上形成噬菌体单层膜^22,23。
7. 将制备好的单层膜稳定10分钟，然后以30 mm/min（45 cm²/min）的速率压缩，直至达到19 N/m的恒定压力。
8. 以4.5 mm/min的速率将QCM-D传感器垂直浸入和提出单层膜七次，实现垂直膜沉积。在接触细菌样品前对沉积的噬菌体单层膜进行电子显微镜观察，结果显示膜层连续、均匀且均一（数据未显示）。
9. 使用在3中制备的噬菌体球状悬浮液，重复步骤4.5–4.8。
10. 将制备的噬菌体生物传感器用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测、电子显微镜观察和椭圆偏振测量。

9. 耐甲氧西林与敏感型葡萄球菌的生物传感器检测与区分

1. 在此方案中，制备了含有未修饰及修饰噬菌体和噬菌体球状体的生物传感器。采用具有四个传感流路腔室的石英晶体微天平，监测细菌与固定于QCM传感器表面的噬菌体之间的结合反应。使用PBP 2a抗体偶联的乳胶微球来区分耐甲氧西林（MRSA）与甲氧西林敏感的葡萄球菌。所有测量均在流动模式下（50 μl/min）于5 MHz条件下进行。
2. 在水中建立QCM传感器的基线共振频率（约30分钟）。
3. 吸取悬浮于水中的活体甲氧西林敏感型葡萄球菌细胞（10⁹ CFU/ml）通过检测池。
4. 使用 Q-Soft 软件持续监测传感器在第一泛音模式下的共振频率和能量耗散变化。
5. 当传感器的共振频率和耗散变化达到饱和水平时，加入PBP抗体偶联的乳胶微球悬浮液（6.77×10⁷）¹⁰ 珠粒/mL）加入流动相中，同时持续监测频率和耗散。
6. 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞重复步骤 9.2–9.5。
7. 通过细菌结合引起的质量变化，利用Sauerbrey方程定义频率变化 ^24,25 Δf = -Δm xn/C，其中 C 是质量灵敏度常数（C=17.7 纳克 × 厘米^-2 x Hz^-1 在 5 MHz 时）， m 是质量 n 为泛音序号（n = 1).
8. 定义能量耗散变化（ΔD）来自的 记录振荡的指数衰减（频率和振幅衰减），从而量化一个振荡周期内耗散和储存的能量， E_消散 和 E_储存分别：ΔD = E_消散 / 2πE_储存. ΔD 以耗散单位（DU）测量，1 DU = 10^-6 相对单位

结果

噬菌体对所有测试的S. aureus菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株）均表现出裂解活性，噬菌斑点试验结果证实了这一点。噬菌斑大小通常在5至15 mm之间。对其他测试菌株未发现裂解活性（表1）。

S. aureus ATCC 12600 在 37 °C 条件下于摇床培养箱中的 NZY 培养基内正常生长情况如图 1A所示（以空心圆圈标记的曲线）。细菌数量从 3.2 × 10⁶ 增加至 4.0 × 10⁸ CFU/mL。图 1A（以实心圆圈标记的曲线）显示了将 2.0 × 10⁶ PFU/mL 游离噬菌体与相同浓度的S. aureus ATCC 12600 同时加入后共培养的结果。固定在金表面的噬菌体表现出与悬浮状态噬菌体相当的裂解活性（图 1A，以倒三角标记的曲线）。当携带噬菌体的金片首次用于 24 小时生长实验后，经 ...

讨论

众所周知，噬菌体可作为细菌病原体的生物传感器探针²⁸。本研究证明，噬菌体与PBP 2a抗体联用，能够解决一个长期存在的难题：快速区分抗生素耐药菌株与敏感菌株。

然而研究发现，普通的未经修饰的葡萄球菌噬菌体不适合用于QCM设备的细菌检测，即使它们能够结合细菌。噬菌体的尾部过长，导致声波无法“触及”结合在噬菌体尾部末端的细菌。这种情况导致了“缺失质量”效应²⁹，即使电镜图像（图3A和3B）显示存在显著的结合，仍无法检测到共振频率和耗散的变化。这一问题通过用球状体替代完整的噬菌体得以轻松解决，球状体是经氯仿-水处理修饰后的噬菌体。该处理使噬菌体转变为具有短而粗且无柔性的尾部，但仍保持完全功能（图2D、2E和2F）。当生物传感器中使用球状体替代噬菌体后，QCM-D设备可轻松检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。

当噬菌体颗粒以适当的方向结合到金表面时，其受体可与宿主细菌发生接触。如果带有噬菌体的固体表面与干燥的细菌层发...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P4417
分光光度级氯仿	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	154733	（99.8% A.C.S.）
己烷-无水	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州	29609-0	(95%)
乙醇	Pharmco产品公司，康涅狄格州布罗克菲尔德	64-17-5	190 证明
<强>仪器设备
PBP 2a 抗体偶联乳胶微球	日本东京，德卡精工株式会社	MRSA-Screen 检测
S. aureus ATCC 12600 S. aureus ATCC 27690 和 枯草芽孢杆菌 ATCC 6051 来自	美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）；
MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45 B. anthracis 斯特恩, 鼠伤寒沙门氏菌 LT2 志贺氏菌属弗氏志贺菌、耶尔森菌属肠道耶尔森菌、变形杆菌属奇异变形杆菌、克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 13882；裂解性噬菌体 12600	阿拉巴马州奥本市奥本大学的菌种保藏中心
离心	贝克曼库尔特	Optima L-90K 超速离心机
KSV 2200 LB 膜天平	KSV Chemicals，芬兰
光学显微镜光学系统	CitoViva Technology Inc.，阿拉巴马州奥本
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frö隆德，瑞典	E4
扫描电子显微镜（SEM）	JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪	JEOL-7000F 扫描电子显微镜
透射电子显微镜（TEM）	JEOL USA Inc.，美国马萨诸塞州皮博迪	JEOL，JEM 2010
Stericup，预灭菌	默克密理博公司，比勒里卡，马萨诸塞州	SCGPU05RE	0.22 μm，GP Express PLUS 膜
生物测定皿	NUNC A/S，丹麦	240835	尺寸（毫米），245 × 245 × 25
移液器	Gilson，Pipetman，法国	P100、P200、P1000
C24 恒温振荡培养箱	新不伦瑞克科学公司，康涅狄格州	经典 C24
镀金石英片	阿拉巴马州奥本大学		自制
培养皿	Fisher Brand，美国	0875713	100 mm × 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
培养用生长瓶	康宁公司，纽约	4995	PYREX 250 ml 锥形瓶
光学光谱仪	Genesys 20. Thermo Spectronic，美国	4001
等离子清洗机	Harrick Plasma，美国	PDC-32G
Millipore 水纯化系统	Millipore	Direct-Q
成像椭偏仪	美国 Accurion	纳米膜_ep3se
软件	Q-Sense AB，瑞典	QSoft，QTools