使用原子力显微镜测量活细胞的力学性能

摘要

本文演示了一个协议，通过使用原子力显微镜（AFM）的显微表征活细胞的机械性能。

摘要

细胞及细胞外基质（ECM）的机械性能，在许多生物过程中扮演重要的角色，包括干细胞的分化，肿瘤的形成，和伤口愈合。细胞和ECM刚度的变化往往是在组织细胞的生理或疾病变化的迹象。因此，单元的刚度是一个指数来评估细胞培养的状态。在人群中的用于测量细胞和组织的刚度的方法，使用原子力显微镜（AFM）的显微压痕提供了一种方法来可靠地测量活细胞的刚度。这种方法已被广泛地应用于表征微观尺度刚度，为各种材料，包括金属表面的生物软组织和细胞。这种方法的基本原理是，缩进一个细胞与一个选定的几何形状的针尖，并测量所施加的力从原子力显​​微镜悬臂梁弯曲。力压痕曲线拟合赫兹模式l为相应的尖端几何能给材料刚度的定量测量。本文演示程序，利用原子力显微镜的活细胞的刚度特性。关键步骤包括的AFM校准的过程中，力曲线采集，数据分析使用MATLAB例程证明。这种方法的局限性进行了讨论。

引言

的机械性能，特别是刚性，单个细胞和其周围的细胞外基质（ECM）的许多生物过程，包括细胞生长，运动，分裂，分化，和组织的平衡是至关重要的^。1已经证明，主要是由细胞的机械刚度细胞骨架，特别是肌动蛋白和中间纤维和与它们相关联的其他蛋白质的网络²上在体外的网络的肌动蛋白和中间丝的机械性能试验的结果表明，细胞力学很大程度上依赖于细胞骨架结构和预加应力的细胞骨架^3-5刚度的活细胞，然后把作为指标来评价细胞骨架结构^6，肌球蛋白活性⁷和许多其他细胞的过程。更重要的是，在细胞的机械特性的变化也经常发现有密切associated与各类疾病，如肿瘤的形成和转移^。8-10监控的机械刚度活细胞，因此可以提供一种新的方式来监控细胞生理学检测和诊断疾病，以及药物治疗的有效性进行评估。 ¹²

已经开发了多个方法，包括粒子跟踪微流变学^，13-16磁捻流式细胞仪^，17微吸管^18,19和^20-22显微测量细胞的弹性。粒子跟踪微流变学的痕迹注入细胞或细胞内的细胞骨架的基准标记或亚微米的荧光颗粒的热振动²³细胞的弹性和粘性性质从测量粒子位移涨落耗散定理计算^14,23此方法允许同时测量的地方高空间分辨率的机械性能在不同的地方，在一个单元格。然而，注入到细胞中的荧光发色粒子，可能会导致细胞功能的变化，细胞骨架结构，因此细胞力学。微管吸吮方法适用于微量的直径范围从1到5μm至细胞膜的一小片进入移液管吸负压。细胞刚度的计算是由所施加的负压力和细胞膜的变形¹⁸此方法，但是，不能检测刚度整个单元中的非均匀分布。磁性捻流式细胞仪（MTC）施加磁场，超顺磁性珠连接到细胞膜上产生转矩。来自在该方法中的^（17）细胞的刚度，从所施加的转矩之间的关系和细胞膜的扭转变形。这是很难控制的位置磁珠在MTC方法，并且它是也是challengi的ng来表征高分辨率的扭曲变形。显微适用于压头具有良好定义几何冲进入细胞。在细胞的缩进力以及由此产生的压痕往往遵循赫兹模型的预测。的杨氏模量，可以计算出从细胞的力压痕曲线拟合赫兹模型。这种方法已被广泛地应用到测试的组织和细胞的机械性能，尽管它的局限性，如在接触点的确定，赫兹模型的适用性，以及潜在的物理损伤，使细胞的不确定性。在众多的设备在microindentaion ^20，原子力显微镜（AFM）是市售的，并已被广泛应用来表征力学性能的活细胞和组织中^21,24-27。

本文演示了使用一个的庇护MFP3D生物AFM表征细胞力学过程。 AFM不上光年提供高分辨率的地形细胞也已被广泛应用到组织细胞的机械性质。 AFM压痕的原则，在图1中示出。原子力显微镜悬臂梁接近从几微米以上的细胞与细胞接触;缩进的单元格，这样的悬臂偏转达到预选的设定点;和拉相差的细胞。在此过程中被记录，作为其位置的函数，如在图1中所示的悬臂偏转。在与细胞接触之前，悬臂移动介质中，没有任何明显的偏转。缩进时对细胞，悬臂弯曲和偏转信号的增加。被建模为悬臂弹性梁，以使它们的偏转是在该室施加的力成比例。通过设置最大悬臂挠度，施加在样品上的力的最大量值被限制到避免d豪悦国际细胞。的力的部分，从点b，点c在图1中 ，进入细胞的前端缩进，适合赫兹模型，提取细胞的刚度曲线。

图1。 AFM显微插图和解释力曲线顶部面板显示驱动压电扫描器AFM悬臂的运动。悬臂式z和悬臂偏转信号 d的垂直位置被记录在这个过程中。从点a，几微米的单元格上方的悬臂。在接近该单元格，样品压痕δ保持为零，直到它到达b点的前端开始与细胞接触。 b点的坐标中的情节是临界值对数据进行分析，记为（Z _{0，D 0>）。}从b到c的悬臂的悬臂偏转进入细胞内的缩进，直到达到设定点时，它被设置为对象的最大的缩进力和悬臂弹簧常数之间的比值。 ，一旦偏转信号达到预先设定的最大值，然后撤回悬臂从点d，它经常被向下拉由于小费样本粘附细胞，从细胞中分离并返回到其初始位置在e。右边的窗格中示出的缩进和记录的z和D信号之间的关系。在左下面板是一块有代表性的力曲线，以悬臂的最大压痕，其中的弹簧常数测定为0.07N /米，被设定为17纳米，以便最大缩进力施加到样品是1.2 NN。在压痕标记的关键位置。

方案

1。校准的弹簧常数悬臂

1. 根据制造商的指示，加载到AFM的悬臂。任何实验之前，有必要清洁的悬臂支架用乙醇。这将有助于限制在AFM测量细菌污染文化。
2. 校准InvOLS的（逆光杠杆感光度）。此参数描述光电二极管的响应（伏特）每纳米悬臂偏转量。
3. 到样品台上装入干净的载玻片上，然后安装在原子力显微镜头和调整激光束和对应根据制造商的指示。搞针尖于载玻片上。
4. 与压电撤回，重新调整镜子的光电二极管读-2 V.执行力光谱测量触发点（最大光电二极管的响应）+2 V。
5. 与压电撤回，重新调整镜子的光电二极管读-2五执行FORCE光谱测量触发点（最大光电二极管的响应）+2 V 注:这里的电压值是具体 ​​到庇护AFM。此值应根据制造商所提供的规格设置。
   数据采集​​完成后，公司接触区域的力曲线放大。对这个地区进行的线性拟合，求出斜率，这将是在V / nm处。该值的倒数描述的悬臂光电二极管集成的光灵敏度。
6. 0复位镜对准一个自由偏转V。
7. 校准的悬臂弹簧常数。甲热调整方法是用来确定在悬臂²⁸的弹簧常数。
8. 校准InvOLS后，提起扫描仪从样品台不存在任何探针和样品之间的相互作用。
9. 开始捕捉热数据。在此过程中，悬臂梁的热振动是原始记录四。原子力显微镜的软件分析这种热振动，并将其绘制在一个数据窗口中的功率谱。
10. 几秒钟后，数据采集，在最低的频率（基波谐振）的峰确定的弹簧常数为中心的数据段进行拟合。

2。装样

1. 在AFM阶段安装盘加热器配件，如果不是已经配备。
2. 将温度设定到37℃，并等待系统达到一个稳定的热平衡20分钟。
3. 放置在培养皿上的原子力显微镜的阶段，然后将它固定采用与烹调加热器提供钳位。重要的是要除去从孵化器中的盘子，并把它在舞台上，以免损伤细胞之间的时间最小化。长于30分钟测量时，CO ₂的独立的介质，应使用以取代正常的培养基。
4. 应用37℃培养基t的冰山一小滴他AFM悬臂，并降低原子力显微镜头，直到提示刚刚浸没在液体中。
5. 使用顶视图，CCD相机，重新调整的悬臂（在液体中比在空气中会有所不同的取向，由于介质的折射率的变化）上的激光束。
6. 搞针尖在一个干净的培养皿面积。
7. 执行校准InvOLS，如上所述，在液体环境中的悬臂梁的灵敏度。

注:a）如培养细胞水凝胶，校准InvOLS应进行预先对充满了细胞培养基的培养皿的底表面。当切换到细胞样本，特别注意要支付不改变激光束对准的悬臂。二）InvOLS重新校准，每当有一个变化中的激光准直。三）被还建议采取InvOLS，平均价值从几个校准曲线，S因斯每次校准产生不同的InvOLS的。 InvOLS的变化，但是，小的比的平均值。例如，校准布鲁克DNP-10悬臂弹簧常数0.06 N / m的液体的100倍，产生一个的平均InvOLS价值66.3纳米/ V标准偏差仅为0.5纳米/ V。

3。收集细胞压痕力曲线

1. 选择一个单元格缩进。借助光学显微镜，移动载物台的位置，使尖端位于在细胞核周围区域的单元格上方的悬臂。可以通过应用的X和Y扫描仪的偏移量的精确调节的悬臂位置。
   注:AFM悬臂移动样品阶段从样品表面，而选择靶细胞被撤回。保护悬臂从敲到样品，由于样品表面可能并不平坦。
2. 切换到强制光谱模式。设置缩进率提高到10微米/秒，低到足以避免流体动力效应的范围内。
3. 设置偏转触发点，从而限制了最大缩进力，以避免对细胞的伤害。选择相对触发选项，这将纠正任何在偏转信号漂移。 2 NN的最大力量是一个很好的起点，对于大多数样品。然而，此值，应调整根据示例刚度。对于软样品，应使用一个较低的值，以避免过度压痕样品。对于僵硬的样品，应使用高值来产生可测量压痕。
4. 设置足够大，以确保的前端将被完全脱离的细胞之间的力的测量的力的距离。一般，力的距离被设定在5微米。
5. 命令的AFM采取单一的力曲线。
6. 收集至少三力曲线，在不同的地点，在原子核周围地区的每一个细胞中。虽然这是有利于采取多可靠的统计数据，在每个单元上的曲线，过多服用力曲线，可导致细胞刚度的变化，由于应力的AFM探针。
7. 当数据收集完成后，撤回的提示，并重复步骤3.1-3.6尽可能多的细胞，需要一定的样本条件下对细胞刚度良好的统计数据。通常情况下，30个细胞为每个条件测定。

刚度单个细胞内的分布特征，力地图模式。在警队地图模式，设置扫描尺寸，包括该地区的利益，设置一个合适的分辨率设置缩进参数选择单力曲线，AFM然后将光栅跨越定义的样本区域，并采取单一的力量曲线在样品区中的每个像素。

4。数据分析

力曲线记录使用一个自定义的MATLAB程序来计算单元刚度分析。以下是MATLAB程序的简要说明:

1. MATLAB程序标识的接触点的坐标Z0和D0（ 见图1），使用的算法从公布的方法，通过林等^29:
2. 力曲线中的每一个数据点，兴趣点的左侧的执行的数据的线性拟合，赫兹模型适合的权利（使用所选择的点作为初始的接触点），到设定的最大压痕（建议200-300纳米）。
3. 对于每一个点，计算相对误差两者的拟合和总结这些值。
4. 的总拟合误差达到最小的点被选择为初始联系点。
   注:可以减少计算时间，通过实施一个黄金分割的搜索，而不是线性扫描整个部队曲线。
5. 试样变形δ和缩进力F的计算公式为:
   
6. 使用最小二乘拟合，以适应F与δ在后接触区的数据和z≥Z _0，赫兹模型中提取的杨氏模量，E的细胞:
   
   ， 其中，v为泊松比。
   注意:当δ是10％以上的样品的厚度（单元格的高度），所测得的细胞刚度受基板的刚度。核周边区域的厚度通常为几微米的量级。因此，只有第一个200-300纳米的F-δ曲线适合的赫兹的模型。

结果

图2a显示了三个有代表性的塑料表面，聚丙烯酰胺凝胶的杨氏模量每年3,000 17,000霸，分别取自3T3成纤维细胞培养力曲线。经过仔细吞吐量曲线中的接触点，作为细胞变形的功能的缩进力被绘制在图2b中。根据级小于0.3 nN的，金字塔形尖缩进3微米，为3千帕的聚丙烯酰胺凝胶上培养的细胞的一个力。与此相反，需要的力超过1.6 nN的缩进使用相同的尖端，在普通培养皿的细胞生长到500纳米。很显然，从这个图中，细胞培养软聚丙烯酰胺凝胶是软比僵硬的培养皿培养细胞。力δ曲线赫兹模型拟合的第一个段（δ<30纳米），杨氏模量分别为10千帕，1.2千帕，和1.10千帕，这三个细胞。细胞文化视角E盘是100倍，比在聚丙烯酰胺凝胶细胞的围追堵截。梭伦等人也报告了类似的结果^25。他们发现，成纤维细胞积极变硬细胞骨架的刚度匹配的基板，他们坚持。许多其他类型的细胞也有报道变得更硬，更硬的基片³⁰上培养时。

重要的是要注意，压痕可以在细胞中引起塑性变形，这会导致在紫色曲线所...

讨论

AFM的压痕法表征力学性能的活细胞的优点。尽管不那么敏感的磁扭仪和光学镊子，它可以测量的力量piconewton ³²级，原子力显微镜能检测阻力纳米牛顿微微牛顿从几十到几百不等，从样品比较力范围可以应用到使用微量吸管^19的细胞。此范围内的力适合需要建立可测量的变形，在所有类型的细胞^19。高空间分辨率，使得它可以组织中，于单电池³³上的亚微米级特性的非均质性。它也允许活细胞实时测量。可以操作的几个原子力显微镜的模型设计的生物样品的流体环境中都配备了加热样品阶段，它提供了精确的温度控制，使得能够维持生理ENVI在测量过程中的活细胞ronment。 AFM压痕已成功地应用于用于测量类型的细胞^，25,34-36的范围内的机械性能，并已被广泛用于评估细胞与细胞分化相关的机械性能和在各种病变的环境中的变化^。30,37

力曲线计算刚度的一个重要步骤是确定小费首先与细胞接触的地步。接触点中的不确定性可能会影响弹性模量^31。对于刚性材料，偏转信号...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
原子力显微镜	Asylum Research	MFP3D-BIO