我们开发了一种基于ELISA的定量DNA结合检测方法，用于测量转录因子与DNA的相互作用。通过使用共识DNA识别寡核苷酸和特异性单克隆抗体，实现了对RUNX2蛋白的高特异性检测。采用酶偶联抗体底物反应进行比色检测，并实时监测信号变化。
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摘要
摘要
多种DNA结合检测方法，如电泳迁移率变动分析（EMSA）、化学发光检测、基于染色质免疫沉淀（ChIP）的检测以及多孔板检测，常用于测量转录因子活性。然而，这些检测方法缺乏定量性、特异性不足，可能需要使用放射性标记的寡核苷酸，且可能不适用于DNA结合抑制剂的筛选。另一方面，通过采用定量DNA结合酶联免疫吸附检测（D-ELISA），我们展示了核蛋白与DNA之间的相互作用，该作用依赖于RUNX2转录因子与生物素标记寡核苷酸上存在的共识DNA结合序列的特异性结合。本文描述了细胞准备、核蛋白提取以及双链寡核苷酸的设计。将链霉亲和素包被的96孔板用碱性缓冲液固定后，在核苷酸封闭缓冲液中与核蛋白孵育。在对孔板进行充分洗涤后，依次加入特异性一抗和二抗，随后加入辣根过氧化物酶底物并显色。采用终止反应模式或连续动力学监测方法，可对蛋白质与DNA的相互作用进行定量测定。我们讨论了适当的特异性对照，包括使用非特异性IgG、不加蛋白或不加一抗的处理。本文还描述了该检测的应用，包括其在药物筛选中的用途，并讨论了典型的阳性与阴性结果。
引言
DNA结合实验可用于检测转录因子与DNA相互作用的能力。用于检测DNA结合的实验方法包括依赖放射性标记寡核苷酸1的电泳迁移率变动实验（EMSA）以及化学发光实验2。已有报道基于染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方法3以及采用96孔板格式的实验方法4。然而，EMSA是一种非定量实验，且需要使用放射性标记的寡核苷酸。当核蛋白与特定的核苷酸启动子序列结合时，结合复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中发生迁移延迟，可通过抗体“超迁移”验证特异性转录因子的存在。我们开发了一种基于酶联免疫吸附技术的定量DNA结合实验（D-ELISA），可检测RUNX2与RUNX2靶基因中特定启动子元件对应的DNA结合序列之间的相互作用。使用抗RUNX2抗体使该实验具有特异性，且无需放射性标记，从而区别于传统的凝胶迁移实验5。通过与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗可检测结合复合物，HRP可将底物四甲基联苯胺（TMB）转化为有色产物，用于分光光度分析。本实验可引入突变的DNA寡核苷酸作为对照，并可用于检测DNA结合的竞争性或非竞争性抑制剂。该实验还可用于筛选新型抗肿瘤化合物。
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方案
在实验开始前需预先完成多个步骤并配制和储存多种试剂：（1）细胞培养与蛋白质提取，（2）寡核苷酸的制备，（3）96孔板的准备，（4）核提取物的过夜孵育。由于核蛋白需与DNA寡核苷酸进行过夜孵育，整个实验流程需要2天时间。
1. 缓冲液的配制
1.1 细胞核蛋白提取
- 低渗缓冲液：配制 100 ml 低渗缓冲液，向 98.3 ml H2O 中加入 1 ml（1 M HEPES，pH 7.9）、150 μl（1 M MgCl2）和 333 μl（3 M KCl）。终浓度：10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl。低渗缓冲液 + NP40（用于步骤 2.11）：向 9.5 ml 低渗缓冲液中加入 0.5 ml（10% NP40），终浓度为 0.5% NP40。
- 低盐缓冲液：配制 100 ml 低盐缓冲液（用于步骤 2.15），向 73 ml H2O 中加入 1 ml（1 M HEPES，pH 7.9）、25 ml 甘油、150 μl（1 M MgCl2）、666 μl（3 M KCl）和 40 μl（0.5 M EDTA）。终浓度：10 mM HEPES、25% 甘油、1.5 mM MgCl2、20 mM KCl、0.2 mM EDTA....
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结果
只要使用含有三个共识RUNX2结合位点（ACACCA）的序列特异性双链寡核苷酸，D-ELISA方法对指定的DNA结合蛋白就具有高度特异性。识别该蛋白因子的一抗也增强了检测的特异性。二抗共价连接了辣根过氧化物酶（HRP），可将无色底物（四甲基联苯胺）转化为有色产物，便于检测（图1）。因此，为确保DNA结合的特异性，每次实验板中均需设置若干重要的背景对照。这些对照包括检测仅含有以下成分的孔中由二抗-HRP反应产生的比色产物：（1）不含核蛋白；（2）不含一抗；或（3）使用非特异性小鼠IgG替代特异性单克隆抗体。在常规测量中，将无蛋白对照的信号从特异性蛋白信号中扣除，结果以净反应产物表示。此外，当采用计算机辅助药物设计（CADD）发现化合物并将其在DNA结合实验中进行测试时，必须在单独的孔中确定用于溶解化合物的溶剂的影响。通常，药物筛选需使用水、乙醇或二甲基亚砜来溶解化合物。每种溶剂均需在相应的浓度下单独测试。某些药物筛选发现的化合物对DNA结合影响甚微，如维生素D受体配体1α,25-羟基维生素D3所示（图2）。该化合物即使在较高浓度（100 nM至100 μM）下也未抑制DN.......
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讨论
DNA结合实验用于检测转录因子与DNA相互作用的能力。DNA结合实验包括电泳迁移率变动分析（EMSA） 1 基于染色质免疫沉淀（ChIP）的检测方法 3 以及采用96孔板格式的检测方法 4 例如化学发光检测 2. EMSA 是一种非定量方法，使用放射性标记的（32P）寡核苷酸。这些寡核苷酸与核蛋白共同孵育，结合复合物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。相比之下，定量D-ELISA能够检测RUNX2与对应于RUNX2靶基因中特定启动子元件的DNA结合序列之间的相互作用。使用抗RUNX2抗体增强了该检测的特异性，使该方法区别于传统的凝胶迁移实验。 5. 尽管D-ELISA是一种 体外 检测方法无法在活细胞中检测启动子占据情况（染色质免疫沉淀实验可实现），但可用于定量筛选抑制DNA结合复合物的化合物。这些检测方法仅限于DNA相互作用分析，无法预测特定启动子是否被激活或抑制。要明确特定转录因子的转录活性，还需采用其他方法，如启动子-荧光素酶报告基因检测。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
特此感谢马里兰大学格林鲍姆癌症中心转化核心设施的技术支持和仪器使用，尤其感谢Rena Lapidus博士和Mariola Sadowska博士。本检测方法的开发工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）RO1CA108846项目、美国心脏协会（AHA）资助项目GRNT2130014、退伍军人事务部（VA）杰出研究奖（授予A.P.）以及提供给马琳和斯图尔特·格林鲍姆癌症中心的马里兰大学香烟赔偿基金（CRF）资助完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚 dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 抗体 | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab 特异性辣根过氧化物酶标记抗体 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB 底物（四甲基联苯胺） | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| 碳酸钠 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | 用于固定板 |
| 硫酸 | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | 终止液 |
| 多孔板 | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | 链霉亲和素包被，黑色侧壁 |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 |
| 化学品 | 多家厂商 | 实验室级 | |
| 表 1. 试剂 | |||
| 分光光度计：Biotrak II 可见光酶标仪 | Amersham Biosciences | 用于终止反应法 | |
| 分光光度计：Bio-Tek Synergy HT 多功能微孔板读板仪 | Bio-Tek Instruments, Inc. | 用于连续动力学监测 | |
| 表 2. 仪器 |
参考文献
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al.
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重印与许可
