我们开发了一种基于ELISA的定量DNA结合检测方法，用于测量转录因子与DNA的相互作用。通过使用共识DNA识别寡核苷酸和特异性单克隆抗体，实现了对RUNX2蛋白的高特异性检测。采用酶偶联抗体底物反应进行比色检测，并实时监测信号变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
多种DNA结合检测方法，如电泳迁移率变动分析（EMSA）、化学发光检测、基于染色质免疫沉淀（ChIP）的检测以及多孔板检测，常用于测量转录因子活性。然而，这些检测方法缺乏定量性、特异性不足，可能需要使用放射性标记的寡核苷酸，且可能不适用于DNA结合抑制剂的筛选。另一方面，通过采用定量DNA结合酶联免疫吸附检测（D-ELISA），我们展示了核蛋白与DNA之间的相互作用，该作用依赖于RUNX2转录因子与生物素标记寡核苷酸上存在的共识DNA结合序列的特异性结合。本文描述了细胞准备、核蛋白提取以及双链寡核苷酸的设计。将链霉亲和素包被的96孔板用碱性缓冲液固定后，在核苷酸封闭缓冲液中与核蛋白孵育。在对孔板进行充分洗涤后，依次加入特异性一抗和二抗，随后加入辣根过氧化物酶底物并显色。采用终止反应模式或连续动力学监测方法，可对蛋白质与DNA的相互作用进行定量测定。我们讨论了适当的特异性对照，包括使用非特异性IgG、不加蛋白或不加一抗的处理。本文还描述了该检测的应用，包括其在药物筛选中的用途，并讨论了典型的阳性与阴性结果。
引言
DNA结合实验可用于检测转录因子与DNA相互作用的能力。用于检测DNA结合的实验方法包括依赖放射性标记寡核苷酸1的电泳迁移率变动实验（EMSA）以及化学发光实验2。已有报道基于染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方法3以及采用96孔板格式的实验方法4。然而，EMSA是一种非定量实验，且需要使用放射性标记的寡核苷酸。当核蛋白与特定的核苷酸启动子序列结合时，结合复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中发生迁移延迟，可通过抗体“超迁移”验证特异性转录因子的存在。我们开发了一种基于酶联免疫吸附技术的定量DNA结合实验（D-ELISA），可检测RUNX2与RUNX2靶基因中特定启动子元件对应的DNA结合序列之间的相互作用。使用抗RUNX2抗体使该实验具有特异性，且无需放射性标记，从而区别于传统的凝胶迁移实验5。通过与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗可检测结合复合物，HRP可将底物四甲基联苯胺（TMB）转化为有色产物，用于分光光度分析。本实验可引入突变的DNA寡核苷酸作为对照，并可用于检测DNA结合的竞争性或非竞争性抑制剂。该实验还可用于筛选新型抗肿瘤化合物。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
在实验开始前需预先完成多个步骤并配制和储存多种试剂：（1）细胞培养与蛋白质提取，（2）寡核苷酸的制备，（3）96孔板的准备，（4）核提取物的过夜孵育。由于核蛋白需与DNA寡核苷酸进行过夜孵育，整个实验流程需要2天时间。
1. 缓冲液的配制
1.1 细胞核蛋白提取
- 低渗缓冲液：配制 100 ml 低渗缓冲液，向 98.3 ml H2O 中加入 1 ml（1 M HEPES，pH 7.9）、150 μl（1 M MgCl2）和 333 μl（3 M KCl）。终浓度：10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl。低渗缓冲液 + NP40（用于步骤 2.11）：向 9.5 ml 低渗缓冲液中加入 0.5 ml（10% NP40），终浓度为 0.5% NP40。
- 低盐缓冲液：配制 100 ml 低盐缓冲液（用于步骤 2.15），向 73 ml H2O 中加入 1 ml（1 M HEPES，pH 7.9）、25 ml 甘油、150 μl（1 M MgCl2）、666 μl（3 M KCl）和 40 μl（0.5 M EDTA）。终浓度：10 mM HEPES、25% 甘油、1.5 mM MgCl2、20 mM KCl、0.2 mM EDTA。
- 高盐缓冲液：配制 100 ml 高盐缓冲液（用于步骤 2.15），向 47 ml H2O 中加入 1 ml（1 M HEPES，pH 7.9）、25 ml 甘油、150 μl（1 M MgCl2）、26.7 ml（3 M KCl）和 40 μl（0.5 M EDTA）。终浓度：10 mM HEPES、25% 甘油、1.5 mM MgCl2、800 mM KCl、0.2 mM EDTA。
- 10% NP40 去垢剂：将 10 ml NP40 加入 90 ml H2O 中。
- 蛋白酶和磷酸酶抑制剂（在使用前加入低渗缓冲液 + NP40（步骤 2.11）、低盐缓冲液（步骤 2.15）和高盐缓冲液（步骤 2.15））：向每 5 ml 缓冲液中加入 2.5 μl（1 M DTT）和 50 μl 蛋白酶抑制剂（100×），终浓度为 0.5 mM DTT 和 1× 蛋白酶抑制剂。100× 蛋白酶抑制剂储存液混合物包括：氟化钠（丝氨酸/苏氨酸、酸性磷酸酶）、正钒酸钠（酪氨酸、碱性磷酸酶）、β-甘油磷酸钠（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶）、焦磷酸钠（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶）、抑肽酶（丝氨酸蛋白酶）、亮抑蛋白酶肽（氨基肽酶）、E64（半胱氨酸蛋白酶）、亮抑酶肽（丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶）、EDTA（金属蛋白酶）。
1.2 检测板的制备
- 平板固定液：配制 500 ml 溶液时，将 5.25 g 碳酸钠加入 500 ml H2O 中，充分混匀，并调节 pH 至 9.7，得到终浓度为 0.1 M 的碳酸钠溶液。
- 平板封闭液：配制聚 dI/dC 寡核苷酸储备液时，将 1 单位（约 50 mg）聚 dI/dC 溶解于 1 ml 含 1 mM EDTA 的 10 mM Tris/HCl 缓冲液（pH 7.9）中，得到 50 μg/μl 的储备浓度。使用前将其稀释至 1 μg/μl。
1.3 洗涤缓冲液与抗体稀释
注意：链霉亲和素洗涤缓冲液用于在添加物之间洗涤板孔，并用于稀释一抗和二抗。
- 配制 1 L 链霉亲和素洗涤缓冲液：将 2.4 g Tris/HCl、37.5 ml (4 M NaCl)、10 ml (10% BSA)、5 ml (10% Tween-20) 加入 1 L 经 Millipore 无菌过滤的水中，调 pH 至 7.18。4 °C 保存。终浓度：20 mM Tris/HCl、150 mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween-20。
1.4 DNA结合缓冲液
注意：该缓冲液保存在 -20 °C。
- 配制 15 ml DNA 结合缓冲液：加入 180 μl（1 M HEPES，pH 7.9）、300 μl（3 M KCl）、12 μl（0.5 M EDTA，pH 8.0）、7.5 μl（1 M DTT）、3.0 ml（60% 甘油）、300 μl（50 μg/μl poly dI/dC），用去离子/蒸馏 H2O 定容至 12 ml。终浓度为：12 mM HEPES/pH 7.9、60 mM KCl、0.4 mM EDTA、0.5 mM DTT、12% 甘油、1 μg/μl poly dI/dC。
2. 细胞培养与核蛋白分离
注意：准备过程约需3小时。细胞刺激时间取决于具体实验。每次实验所用细胞数量可能不同，所有体积均基于使用3 × 107 个细胞/时间点的典型实验。请根据实验中实际使用的细胞数量调整相应体积6。
- 为进行DNA结合实验的核蛋白制备，使用适当的培养基培养表达RUNX2的人类细胞（内皮细胞、骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞）6。
- 用诺考达唑（0.2 μg/ml，处理16小时）处理未完全融合的细胞，使细胞停滞在G2/M细胞周期边界6。在此条件下，RUNX2蛋白得以稳定，且DNA结合达到最大水平。通过该方法可获得足量的核蛋白用于多个实验，并可从同一批制备样品中比较不同抑制剂的效果。
- 每一步操作前，将离心机预冷至4 °C，并提前将缓冲液置于4 °C预冷20分钟，再进行细胞收集。
- 将细胞置于4 °C预冷，并在冰上进行后续操作。
- 在15 ml聚丙烯圆底离心管中，以1,000 rpm离心5分钟。
- 用冰冷的PBS（不含Ca2+ 和Mg2+ ）洗涤一次。
- 再次离心并弃去PBS上清液。
- 加入500 μl不含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，小心地将细胞沉淀完全重悬。
- 将内容物转移至1.5 ml Eppendorf管中。
- 立即以5,500 rpm离心5.5分钟；弃去上清液，保留细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于500 μl含有0.5% NP40的低渗缓冲液中。加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及0.5 mM DTT（如步骤1.1.5所述）。
- 将样品置于冰上静置30分钟。
- 以13,000 rpm离心10分钟。
- 弃去上清液（含胞质蛋白）。
- 将核沉淀重悬于60 μl低盐缓冲液（已加入步骤1.1.5中的蛋白酶抑制剂和0.5 mM DTT）和60 μl高盐缓冲液（已加入步骤1.1.5中的蛋白酶抑制剂和0.5 mM DTT），总体积为120 μl。先向沉淀中加入60 μl低盐缓冲液并重悬，再加入60 μl高盐缓冲液。涡旋震荡以助于沉淀重悬。
注意：此步骤有助于去除部分核膜蛋白并为裂解步骤做准备：先用低盐缓冲液（重悬沉淀，涡旋），再用高盐缓冲液（涡旋）可优化该步骤。将提取物置于冰上孵育30分钟，并在前10分钟结束时涡旋一次。
- 以12,000 rpm离心15分钟；保留含有核蛋白的上清液。
- 测定蛋白浓度（尽量使样品浓度保持在2-5 mg/ml），按适当体积分装（10 μl/管），并于-80 °C保存。
注意：预计产量：30 × 106 个细胞可获得 120 μl 中含 5 μg/μl 蛋白；5 × 106 个细胞可获得 40 μl 中含 2.2 μg/μl 蛋白。
3. 双链寡核苷酸的制备
- 设计两端具有兼容性半位点的互补寡核苷酸。对于 RUNX2，其序列为：5'-CGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATAC TCG -3'-Biotin（正义链）和 5'-CGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATTGTGGTTAATACG -3'-Biotin（反义链）。
注意：预实验确定，三个 RUNX2 结合位点和单端标记的生物素可产生最可重复的结果。
- 配制5倍浓度退火缓冲液：将300 μl（1 M Tris-HCl，pH 7.6）、30 μl（1 M MgCl2）和10 μl（1 M DTT）加入260 μl H2O中，最终体积为600 μl。
- 向每种单链寡核苷酸（各200 pmol，3 μl）中加入12 μl 5倍浓度退火缓冲液和45 μl H2O，总体积为60 μl（200 pmol/60 μl）。
- 在加热块中于95 °C加热5–10分钟。
- 缓慢冷却至65 °C（将温度设定为65 °C，约需15分钟），然后通过关闭加热块电源（或将样品置于盛有65 °C水的烧杯中，再将烧杯放入冰上，此过程需15–20分钟）缓慢冷却至室温。
4. 96孔板的制备
注意：洗涤缓冲液中不得使用牛奶蛋白。
- 用固定液（0.1 M 碳酸钠）固定酶标板：每孔加入 300 μl。
- 室温下轻轻振荡孵育 2 小时，或 4 °C 过夜（O/N）不振荡。
- 用链霉亲和素洗涤缓冲液（WB）洗涤酶标板 3 次：每次每孔加入 300 μl。
- 加入生物素标记的双链寡核苷酸（每核苷酸含 3 个共识结合位点），振荡孵育 2 小时（每孔 1.25 nmol，100 μl/孔）。
- 用预冷的 WB 洗涤 3 次：每次每孔加入 300 μl，加完后立即将酶标板倒置放入水槽中，并在每次加液后将板边缘在纸巾上轻拍以吸去液体。
注意：不要使用移液器吸头从孔板中移除液体，因为这可能会刮掉链霉亲和素：生物素：DNA 复合物。后续所有洗涤步骤均需如此操作。
5. 与核提取物孵育
注意：请勿使用鲑鱼或鲱鱼精子 DNA 替代聚 dI/dC 封闭缓冲液。避免使用牛奶蛋白封闭板。这两种封闭剂均会导致高背景值。
- 加入含有核提取物（每孔90 μl）的特异性转录因子进行孵育。配制主混合液，包含核提取物（DNA结合蛋白；每孔3-9 μg）和poly dI/dC（从50 μg/μl的储存液中稀释至1 μg/μl），溶于1× DNA结合缓冲液中。总体积根据所需孔数确定（每孔90 μl）。
- 在此步骤中加入潜在抑制剂，如维生素D3（图2）或CADD化合物5221975（图3），或相应稀释的溶剂对照（如乙醇）。
- 将板置于摇床上，4 °C过夜孵育。
- 用WB缓冲液洗涤3次：每孔加入300 μl。
6. 一抗的添加
注意：一抗稀释液应新鲜配制，不建议储存。
- 将RUNX2特异性单克隆抗体（储存浓度1 μg/μl）用链霉亲和素洗涤缓冲液按1:5,000稀释。每孔需加入90 μl，为96孔板每孔设三个复孔，需准备足量稀释抗体。
- 在室温下于摇床上孵育1小时。
- 用WB缓冲液洗涤3次，每次每孔加入300 μl。
7. 加入二抗
注意：如果第二天需要使用，二抗稀释液可在 4 °C 下保存过夜。
- 将Fab特异性亲和纯化-HRP偶联抗体（7.1 mg/ml 原液）用链霉亲和素洗涤缓冲液按1:1,400稀释：每5.0 ml洗涤缓冲液中加入3.5 μl抗体。根据96孔板每孔90 μl的用量，每孔设三个复孔，配制足量稀释液。
- 在室温下于摇床上孵育30分钟。
- 将板倒置于水槽中，用洗涤缓冲液（每孔300 μl）洗6次。
8. HRP 底物与产物显色
- 直接从原瓶中向每孔加入 50 μl TMB 底物。
- 室温避光孵育 10–20 分钟（终止反应法），或直接测定吸光度（连续动力学监测）。
9. 反应测量
- 终止反应方法：进行目视终止反应时，观察颜色由无色变为蓝色，并加入 50 μl 硫酸终止反应。
- 使用 Biotrak II 可见光酶标仪（Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, USA）或类似仪器，在 450 nm 处测定吸光度。
- 连续动力学监测方法：在最后一次洗涤后、即将放入分光光度计前加入底物（不要终止反应）。
- 使用 Bio-Tek Synergy HT 多功能酶标仪（Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA）或类似仪器，在 635 nm 处测定吸光度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
只要使用含有三个共识RUNX2结合位点（ACACCA）的序列特异性双链寡核苷酸，D-ELISA方法对指定的DNA结合蛋白就具有高度特异性。识别该蛋白因子的一抗也增强了检测的特异性。二抗共价连接了辣根过氧化物酶（HRP），可将无色底物（四甲基联苯胺）转化为有色产物，便于检测（图1）。因此，为确保DNA结合的特异性，每次实验板中均需设置若干重要的背景对照。这些对照包括检测仅含有以下成分的孔中由二抗-HRP反应产生的比色产物：（1）不含核蛋白；（2）不含一抗；或（3）使用非特异性小鼠IgG替代特异性单克隆抗体。在常规测量中，将无蛋白对照的信号从特异性蛋白信号中扣除，结果以净反应产物表示。此外，当采用计算机辅助药物设计（CADD）发现化合物并将其在DNA结合实验中进行测试时，必须在单独的孔中确定用于溶解化合物的溶剂的影响。通常，药物筛选需使用水、乙醇或二甲基亚砜来溶解化合物。每种溶剂均需在相应的浓度下单独测试。某些药物筛选发现的化合物对DNA结合影响甚微，如维生素D受体配体1α,25-羟基维生素D3所示（图2）。该化合物即使在较高浓度（100 nM至100 μM）下也未抑制DN...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
DNA结合实验用于检测转录因子与DNA相互作用的能力。DNA结合实验包括电泳迁移率变动分析（EMSA） 1 基于染色质免疫沉淀（ChIP）的检测方法 3 以及采用96孔板格式的检测方法 4 例如化学发光检测 2. EMSA 是一种非定量方法，使用放射性标记的（32P）寡核苷酸。这些寡核苷酸与核蛋白共同孵育，结合复合物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。相比之下，定量D-ELISA能够检测RUNX2与对应于RUNX2靶基因中特定启动子元件的DNA结合序列之间的相互作用。使用抗RUNX2抗体增强了该检测的特异性，使该方法区别于传统的凝胶迁移实验。 5. 尽管D-ELISA是一种 体外 检测方法无法在活细胞中检测启动子占据情况（染色质免疫沉淀实验可实现），但可用于定量筛选抑制DNA结合复合物的化合物。这些检测方法仅限于DNA相互作用分析，无法预测特定启动子是否被激活或抑制。要明确特定转录因子的转录活性，还需采用其他方法，如启动子-荧光素酶报告基因检测。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
特此感谢马里兰大学格林鲍姆癌症中心转化核心设施的技术支持和仪器使用，尤其感谢Rena Lapidus博士和Mariola Sadowska博士。本检测方法的开发工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）RO1CA108846项目、美国心脏协会（AHA）资助项目GRNT2130014、退伍军人事务部（VA）杰出研究奖（授予A.P.）以及提供给马琳和斯图尔特·格林鲍姆癌症中心的马里兰大学香烟赔偿基金（CRF）资助完成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚 dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 抗体 | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab 特异性辣根过氧化物酶标记抗体 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB 底物（四甲基联苯胺） | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| 碳酸钠 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | 用于固定板 |
| 硫酸 | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | 终止液 |
| 多孔板 | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | 链霉亲和素包被，黑色侧壁 |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 |
| 化学品 | 多家厂商 | 实验室级 | |
| 表 1. 试剂 | |||
| 分光光度计：Biotrak II 可见光酶标仪 | Amersham Biosciences | 用于终止反应法 | |
| 分光光度计：Bio-Tek Synergy HT 多功能微孔板读板仪 | Bio-Tek Instruments, Inc. | 用于连续动力学监测 | |
| 表 2. 仪器 |
参考文献
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497(2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21(2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
