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高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

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DOI：

10.3791/50521

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2013年7月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）导入植物中，以实现蛋白的瞬时表达。

摘要

哺乳动物细胞培养是商业化生产人类疫苗和治疗性蛋白质的主要平台。然而，由于其扩增能力有限且成本较高，无法满足全球日益增长的药品需求。植物已被证明是最有前景的替代性药品生产平台之一，具有稳定性高、可扩展性强、成本低和安全性好等优点。近年来病毒载体的发展使得重组蛋白在植物中的快速高效瞬时表达成为可能。为了进一步优化瞬时表达系统的应用，本研究展示了一种简单、高效且可扩展的方法，将含有目标基因的Agrobacterium导入植物组织。我们的结果表明，无论是使用注射器法还是真空法进行农杆菌浸润，均能高效地将Agrobacterium导入叶片，并实现两种荧光蛋白GFP和DsRed的高水平表达。此外，我们还展示了这两种方法各自独特的优点。注射器浸润操作简便，无需昂贵设备，既可以选择在整片叶片中导入单一目标基因，也可以在同一叶片上分别导入多个不同目标基因，因此既适用于实验室规模的重组蛋白表达，也适用于比较不同蛋白或载体的表达产量或动力学特性。注射器浸润的简便性也使其在高中和大学的生物技术教学中具有广泛应用前景。相比之下，真空浸润更为稳定，且易于放大，适用于药品级蛋白的商业化生产。它还能够用于一些不适合注射器浸润的植物种类（如生菜和Arabidopsis）的农杆菌转化。总体而言，注射器浸润与真空浸润相结合，为研究人员和教育工作者提供了一种简单、高效且稳定的瞬时蛋白表达方法，将极大促进药用蛋白的开发并推动科学教育的发展。

引言

自20世纪70年代以来，植物已被探索作为哺乳动物、昆虫和细菌细胞培养系统之外用于商业化生产重组蛋白和蛋白类治疗药物的替代方案1。近年来，基于植物的生物制药表达系统展现出广阔前景，多种针对戈谢病（Gaucher's Disease）2和禽流感H5N13等疾病的新型治疗方法已在临床试验中取得成功。自最初实验以来的数十年间，植物中重组蛋白表达技术的不断完善，使得基于植物的生产系统有望从三个方面改变当前蛋白质生产的主流模式。首先，成本显著降低，因为哺乳动物、昆虫和细菌生物反应器需要高昂的启动成本、昂贵的培养基以及复杂的下游纯化流程4。此外，通过建立稳定的转基因植物品系，植物表达系统在可扩展性方面优于其他表达系统，因为能够以农业规模种植和收获表达目标蛋白的植物5。其次，基于植物的表达系统显著降低了从表达宿主向人类传播人畜共患病原体的风险，在公共安全方面具有明显优势6。最后，植物拥有与哺乳动物细胞相似的真核内膜系统，能够对蛋白质进行正确的翻译后修饰，包括糖基化以及多亚基蛋白的正确组装7。这一能力使植物表达系统优于原核系统（如细菌），因为越来越多的药用重组蛋白（包括单克隆抗体（mAbs））具有复杂的结构，需要广泛的翻译后修饰或组装过程8。

表达重组蛋白的植物系统主要有两种策略。第一种是构建稳定的转基因品系，即将目标蛋白的编码DNA克隆至表达载体中，并导入核基因组或叶绿体基因组。通过该方法，外源DNA可在后代中稳定遗传，从而实现远超其他表达系统的规模化生产潜力。 1将外源DNA导入细胞核基因组通常通过以下方式实现 Agrobacterium tumefaciens 植物组织的感染，或较少情况下通过微弹轰击组织 9随后利用植物激素诱导转基因植物组织（如根和叶）的分化与生长。叶绿体基因组的转化无法通过 A. tumefaciens，但完全依赖于用DNA包被的金或钨微粒，通过弹道轰击进入植物细胞。第二种在植物中表达重组蛋白的方法是瞬时表达。 10在此情况下，携带目的基因的病毒载体被递送 通过 A. tumefaciens 通过一种称为农杆菌浸润（agroinfiltration）的过程，使基因构建体在未整合入植物基因组的情况下，瞬时表达目标蛋白。该基因构建体将指导目标蛋白的瞬时生产，经过短暂的孵育后即可收获并分离目标蛋白。瞬时基因表达具有更高的总体蛋白积累量以及更短的蛋白生产周期优势，通常在农杆菌浸润后约1至2周即可收获植物材料。 11这显著快于稳定转基因植物品系的生成、筛选和验证过程，后者可能需要数月到一年的时间。然而，这也是瞬时表达系统的一个局限性，因为它无法产生可遗传的稳定植物品系，因而不能用于建立可用于大规模商业化生产的种子库。尽管如此，已有方法被开发出来以改进大规模瞬时表达。本文展示了一种瞬时蛋白表达植株的生成方法 Nicotiana benthamiana 利用去构建的病毒载体递送的植物 A. tumefaciens.

两种主要方法正在被开发用于递送 A. tumefaciens 进入植物组织：台式规模渗透 通过 注射器与大规模浸润 通过 真空室。此处描述了这两种方案的使用方法。 N. benthamiana 与中国常见的烟草植物亲缘关系密切的植物作为瞬时表达两种荧光蛋白的宿主植物：来源于水母的绿色荧光蛋白（GFP） Aequorea victoria 来自珊瑚虫（Discosoma）的红色荧光蛋白（DsRed） 12,13. N. benthamiana 是最常用的重组蛋白表达宿主植物，因其易于进行遗传转化，能够快速产生大量生物量，并且种子产量丰富，便于扩大生产规模 14使用该方法的另一个优势是 N. benthamiana 用于蛋白表达的宿主，其优势在于可提供多种表达载体 2,5在本研究中，使用了两种去构建的病毒载体，一种基于烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus, TMV）RNA复制子系统（MagnICON载体），另一种源自菜豆黄矮病毒（bean yellow dwarf virus, BeYDV）DNA复制子系统（双生病毒载体）。 4,11,15-18 ，用于携带GFP和DsRed基因并将其导入 N. benthamiana 细胞 通过 A. tumefaciens 将使用三种DNA构建体通过MagnICON载体实现GFP或DsRed的表达。它们包括5'模块（pICH15879），该模块含有启动子及其他遗传元件，用于驱动目的基因的表达；3'模块（pICH-GFP或pICH-DsRed），含有目的基因；以及编码整合酶的整合酶模块（pICH14011），该酶在表达后可将5'和3'模块整合在一起。 8,15需要三种DNA构建体以利用双生病毒载体进行表达。除了含有目的基因复制子的载体（pBYGFP或pBYDsRed）外，还需一种编码复制蛋白的载体（pREP110），以实现目的复制子的扩增 11,14,16此外，建议加入一种编码番茄丛矮病毒沉默抑制因子p19的载体，以实现目标基因的高水平表达。 11,16.

通过农杆菌浸润法将重组蛋白基因导入植物细胞通常包括三个主要步骤：植物培养、A. tumefaciens 菌液制备和浸润处理。由于每一步骤对该实验的最终成功均至关重要，因此以下分别针对注射浸润和真空浸润方法，对每个步骤提供详细说明。

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方案

1. 植物生长

  1. 将60个泥炭育苗块放入育苗盘中，加入4 L自来水，静置2小时，使泥炭块充分吸水。
  2. 使用播种器在每个泥炭块中播入2粒N. benthamiana种子，用透明塑料罩盖住育苗盘，并将其置于25 °C、84%湿度、16/8小时光暗循环的环境中进行萌发（图1A）。
  3. 播种两周后取下塑料罩，倒掉育苗盘中的多余水分，加入2 L浓度为1.48 g/L的Jack's肥料（图1B）。继续在25 °C、50%湿度、16/8小时光暗循环的环境中培养植株，每2天每盘补充2 L Jack's肥料。
  4. 第4周时，将带泥炭块的植株转移至可容纳6株植物的新育苗盘中，以提供充足生长空间（图1C），继续培养至第6周龄，准备进行农杆菌浸润实验（图1D）。

2. A. tumefaciens 培养物制备

2.1 注射渗透的准备工作

  1. 划线接种 A. tumefaciens 在含有卡那霉素（100 μg/ml）的 LB 琼脂平板上培养含有双生病毒载体 p19、pREP110、pBYGFP 和 pBYDsRed 的 GV3101 菌株。每块平板划线接种一种菌株，于 30 °C 培养 48 小时。
  2. 类似地，在含有羧苄青霉素（100 μg/ml）的LB琼脂平板上划线并培养携带5'模块MagnICON载体（pICH15879）、含有目的基因GFP或DsRed的3'模块（pICH-GFP或pICH-DsRed）以及整合酶（pCH14011）的GV3101菌株。
  3. 从LB琼脂平板上的单个菌落中，将携带双生病毒载体的GV3101菌株接种于含有卡那霉素（100 μg/ml）的3 ml YENB液体培养基（0.75% Bacto酵母提取物，0.8%营养肉汤，用NaOH调节pH至7.5）中，置于15 ml圆底培养管内，在30 °C、300 rpm振荡条件下过夜培养。
  4. 同样，将含有 MagnICON 载体的 GV3101 菌株接种于添加羧苄青霉素（100 μg/ml）的 YENB 培养基中，在 30 °C 摇床中过夜培养。
  5. 测量并记录 OD600 使用分光光度计测定每种液体培养物的值，并利用以下公式计算所需体积（Vsub) 用于传代培养新培养物，起始OD值为600 在含有适当抗生素的10 ml YENB培养基中稀释至0.025的光密度值。
    Vsub （毫升）＝（10 毫升）×（0.025）／OD600
  6. 转移 Vsub （ml）过夜培养物加入到（10 - Vsub) ml 含相应抗生素的 YENB 培养基，分别接种各菌株。将新培养物置于30 °C摇床中，以250 rpm振荡培养过夜，直至OD600 值在1.7-2.0范围内。
  7. 测量并记录 OD600 每种液体培养物的值，并使用以下公式计算所需体积（V无穷大) 用 50 ml 浸润缓冲液稀释，使终浓度 OD600 每种菌株的值为0.12。
    V无穷大 （ml）=（50 ml）×（0.12）/ OD600
  8. 转移 Vinf 将每种培养物各取（ml）加入微量离心管中，在12,000 × g条件下离心2分钟以沉淀细胞，弃去上清液，然后将细胞重悬于10 ml浸润缓冲液（10 mM MES，pH 5.5；10 mM MgSO₄）中4通过短暂涡旋振荡。
  9. 将 pBYGFP + pREP110 + p19 的重悬细胞混合，在 12,000 × g 离心 2 分钟，沉淀细胞后重悬于总共 50 ml 浸润缓冲液中。此 农杆菌 组合用于双生病毒介导的GFP表达。
  10. 类似地，混合以下组合的 农杆菌 细胞，离心后重悬于50 ml浸润缓冲液中。包括：（1）pBYDsRed + pREP110 + p19，用于DsRed的双生病毒表达；（2）pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 + p19，用于GFP与DsRed的双生病毒共表达；（3）pREP110 + p19，作为双生病毒表达的阴性对照；（4）pICH-GFP + pICH15879 + pCH14011，用于MagnICON系统表达GFP；（5）pICH-DsRed + pICH15879 + pCH14011，用于MagnICON系统表达DsRed；（6）pICH15879 + pCH14011，作为MagnICON表达的阴性对照。

2.2 真空渗透的准备工作

  1. 将含有双生病毒载体或MagnICON载体的每种GV3101菌株接种于50 ml灭菌锥形瓶中的15 ml YENB培养基（含适当抗生素），按照上述注射浸润法所述条件过夜培养。
  2. 使用分光光度计测定并记录每种液体培养物的OD600 值，并利用以下公式计算需转接的培养液体积（Vsub），以在含适当抗生素的250 ml YENB培养基中获得起始OD600为0.025的新培养物。
    Vsub (ml) = (250 ml) × (0.025) / OD600
  3. 将过夜培养物中的Vsub (ml)转移至1 L灭菌锥形瓶中，加入(250 - Vsub) ml含适当抗生素的YENB培养基，针对每种菌株按上述注射浸润法所述条件过夜培养新培养物。
  4. 测定并记录每种液体培养物的OD600 值，并使用以下公式计算需稀释于3 L浸润缓冲液中的体积（Vinf），使每种菌株的最终OD600达到0.12。
    Vinf (ml) = (3000 ml) × (0.12) / OD600
  5. 按照注射浸润法所述方法，将每种培养物的Vinf (ml)离心并重悬于浸润缓冲液中，根据注射浸润法所述组合方式混合重悬的菌液。将混合后的Agrobacteria细胞再次离心，并重悬于3 L浸润缓冲液中。

3. 渗透

3.1 注射渗透

  1. 选取四株6周龄、每株具有5片叶子的N. benthamiana植株。从每株植物顶端开始数的前三片叶子将完全浸润于含有不同A. tumefaciens菌株组合的浸润缓冲液中。第四片叶子将分别点状浸润四种菌株组合（用于双生病毒表达）或三种组合（用于MagnICON表达）。每株植物的最后一片叶子将浸润于阴性对照组合中。
  2. 用针头在叶片背面表皮上轻轻划出一个小切口（图2A）。注意：确保不要用力过猛导致叶片穿孔，否则浸润液中的Agrobacteria细胞会通过穿刺处渗透到叶片另一侧。
  3. 用手稳固地握住叶片正面，同时用一只手的拇指在切口处施加轻微的反向压力，使用无针头的注射器将含有Agrobacterium的浸润缓冲液混合物注入切口（图2B）。注意：当Agrobacterium混合物进入叶片细胞间隙时，浸润区域会明显变为更深的绿色（图2C）。
  4. 持续将Agrobacterium混合物注入切口，直至深绿色区域不再扩展。创建新的切口，并重复步骤3.1.2–3.1.4，直到整片叶片完全浸润，前三片叶及最后一片叶整体呈现深绿色为止。
  5. 对于每株植物的第四片叶子，需浸润全部四种（双生病毒载体）或三种（MagnICON载体）菌株组合。每种Agrobacterium菌株组合单独制作一个切口，并分别浸润至对应切口中。
  6. 浸润完成后，将植株移回生长室，并在浸润后2–15天内监测蛋白表达情况。

3.2 真空浸润

  1. 将一个水槽放入真空干燥器中，并转移含有3 L浸润缓冲液的 农杆菌 将菌株转移至试管中。将干燥器连接至 Vacuubrand 隔膜真空泵（图 3A).
  2. 将植物倒置放在干燥器板上（图3B）并将载有植物的培养皿缓缓放入，直至整个叶片和茎系统完全浸入渗透缓冲液中，培养皿置于管子顶部。将真空干燥器O形圈沿边缘放置，盖上真空干燥器盖子至腔室上。图3C).
  3. 打开真空泵，当真空度达到 100 mbar 时开始计时。在 100 mbar 下维持 1 分钟后，缓慢打开干燥器上的放气阀，以允许气体进入 农杆菌 进入水生植物组织的间隙。重复此步骤一次，以确保充分渗透。
  4. 浸润后，将植物从干燥器中取出并恢复直立状态。将植物移回培养室，并在接种后2-15天内监测蛋白表达情况。

4. 荧光蛋白检测与拍照

  1. 从接种后2天开始，将植株移入暗室，用手持式紫外灯照射农杆菌浸润叶片的背面。
  2. 观察GFP的绿色荧光或DsRed的红色荧光。GFP在长波紫外光下发出的信号更强，而DsRed在短波紫外光下荧光更强。
  3. 使用普通数码相机在无闪光灯条件下拍摄荧光叶片的照片。
  4. 观察或拍照结束后，将植株移回生长室。

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结果

1. 通过注射渗透法表达荧光蛋白

为了证明注射器浸润法的有效性 农杆菌 将两种荧光蛋白——GFP 和 DsRed——通过两种不同的去构建植物病毒载体——双生病毒载体和 MagnICON 载体——导入植物组织，检测其表达情况 N. benthamiana。对于 N. benthamiana 完全浸润的叶片 农杆菌 含有双生病毒载体的叶片在紫外光下从接种后2天（dpi）开始即可观察到整个叶区的GFP表达，并在4 dpi时达到表达高峰（图4C）。这种由双生病毒载体介导的早期GFP表达与先前其他重组蛋白的研究结果一致 14,16,18,19相比之下，用含有MagnICON载体的溶液浸润的叶片 农杆菌 组合在接种后5天（5 dpi）才显示出GFP荧光，并在7 dpi时达到最大积累量（图 4D）。在浸润了阴性对照的叶片中未观察到绿色荧光 农杆菌 pREP110 + p19 混合物图 4B<...

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讨论

全球对基于蛋白质的药物需求不断增长，需要开发出更可靠、可扩展、低成本且安全的生产平台。植物已被证明是用于生产药用蛋白的最有前景的替代生产系统之一。近年来，基于病毒的去构建载体的发展使得蛋白在植物中的瞬时表达成为可能，这大大提高了植物表达系统的速度和产量2,10。为进一步优化瞬时表达系统的实用性，我们展示了一种简单、高效且可扩展的方法，用于将含有目标基因的Agrobacterium导入植物组织。我们的结果表明，无论是使用注射器法还是真空法进行农杆菌浸润，均能高效地将Agrobacterium导入植物叶片，并实现两种荧光蛋白GFP和DsRed的高水平表达。

为确保高效的农杆菌浸润和蛋白表达，必须严格控制以下关键参数。若偏离这些参数，可能导致农杆菌浸润效率低下，进而引起目标蛋白表达量降低。

1. 植物发育阶段与健康状况。在本方法中，不同实验室之间最可能产生差异的因素是用于浸润的植物材料。尽管植物在表型上可能相似，但其发育阶段和生理状态会显著影响其表达重组蛋白的能力。影响植物生...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

我们感谢孙 R. 及陈氏实验室的其他学生在植物材料制备方面所做的贡献。同时感谢格林 D. 博士对技术与创新学院（CTI）本科生科研工作的支持。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予陈 Q. 的资助 U01 AI075549 和 1R21AI101329，以及亚利桑那州立大学 CTI 授予陈 Q. 的 SSE 项目资助。Leuzinger K.、Dent M.、Hurtado J. 和 Stahnke J. 是由 SSE 项目资助的本科生。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com 参见文献：Lico 和 Chen 等，2008
DsRedClontech632152www.clontech.com 参见文献：Baird 和 Zacharias 等，2000
MagnICON 载体Icon Geneticsn/awww.icongenetics.com 参见文献：Giritch 和 Marillonnet 等，2006
双生病毒载体作者’s 实验室n/a参见文献：Chen 和 He 等，2011
N. benthamiana作者’s 实验室n/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens 菌株 gv3101作者’s 实验室n/a参见文献：Lai 和 Chen，2012
含羧苄青霉素-100 的 LB 琼脂平板SigmaL0418www.sigmaaldrich.com
含卡那霉素-50 的 LB 琼脂平板SigmaL0543www.sigmaaldrich.com
七水合硫酸镁SigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
蛋白胨Fisher73049-73-7www.fishersci.com
酵母提取物Becton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco 营养肉汤Becton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES 水合缓冲液SigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
羧苄青霉素SigmaC1613-1MLwww.sigmaaldrich.com
卡那霉素Sigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
氢氧化钠Sigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack’s 肥料Hummert InternationalJul-25www.hummert.com
仪器设备
Vacuubrand MD4 真空泵Fisher13-878-113www.fishersci.com
真空空气调节阀FisherNC9386590www.fishersci.com
带 O 型圈的 12 1/8" 干燥器Fisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L 桶Rubber-Maidn/a可使用 Rubbermaid Servn’s Saver 碗（10 杯容量）
230ML 板/架FisherNC9489269www.fishersci.com
泥炭颗粒Hummert International14-2370-1www.hummert.com
育苗盘盖hydrofarm132052www.hydroponics.net
育苗盘hydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo 手动播种器Gro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
四层花架车Hummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml 圆底培养管SigmaCLS430172-500EAhttp://www.sigmaaldrich.com
分光光度计Bio-Rad170-2525www.bio-rad.com
分光光度计比色皿Bio-Rad223-9950www.bio-rad.com
微量离心管USA Scientific1415-2500www.usascientific.com
台式离心机Bio-Rad166-0602EDUwww.bio-rad.com
培养摇床EppendorfExcella E25www.eppendorf.com
紫外灯 型号#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com

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GFP DsRed

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