Method Article

高级别瞬态表达重组蛋白的植物高效的农杆菌

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

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植物提供了一种新的系统，以商业规模生产药物蛋白，更具可扩展性，成本效益和安全比目前的表达范式。在这项研究中，我们报告一个简单方便，且可扩展的方法，引入目标基因农杆菌

Abstract

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哺乳动物细胞培养物是主要的商业化生产人用疫苗和治疗性蛋白质的平台。但是，它不能满足日益增长的全球需求由于其有限的可扩展性和成本高的药品。植物已证明是最有前途的替代，健壮，可伸缩的，低的成本和安全的药品生产平台之一。最近开发的基于病毒的载体，使快速和高层次的重组蛋白在植物中的瞬时表达。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单，高效，可扩展的方法引入到植物组织在这项研究中含有目标基因的农杆菌 。我们的研究结果表明，农杆菌与注射器和真空方法所导致的农杆菌介导的高效引入到两个荧光蛋白的叶子和严谨的生产; GFP和DsRed的。此外，我们展示了这两种方法所提供的独特的优势。注射器浸润简单，不需要昂贵的设备。它也允许灵活地渗透到整个假与靶基因，或在一个叶片上的多个目标基因引入。因此，它可以用于实验室规模的重组蛋白的表达，以及用于比较不同的蛋白质或载体的产率或表达动力学。简单的注射器渗透也表明其效用为主题的生物技术在高中和大学教育。与此相反，真空渗入是更强大的，并可以按比例增加的商业生产药用蛋白。它还提供了能够agroinfiltrate植物物种不适合如生菜和拟南芥浸润注射器的优势。总体而言，结合注射器和真空农杆菌的研究人员和教育工作者提供了一个简单，高效和强大的方法瞬态蛋白表达。这将大大促进药物蛋白和发展，促进科学教育。

Introduction

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自20世纪70年代以来，植物已被探讨，作为替代品的哺乳动物，昆虫，细菌的细胞培养物的商业生产重组蛋白和蛋白质疗法1。以植物为基础的系统，生物制药的表达，表明承诺在最近几年一些新的治疗方法的疾病，如高雪氏病，H5N1禽流感3，在临床试验中显示了成功。主管机制的开发重组蛋白在植物中表达的几十年中，因为这些最初的实验中已经创建了用于植物为基础的系统中，有三个主要理由改变目前的蛋白质生产范式的潜力。首先，有一个显着的成本下降所致哺乳动物，昆虫，细菌的生物反应器需要相当大的启动成本，昂贵的生长介质，下游纯化的复杂工序4。创造稳定的转基因植物线也可以让他们超越其他表达系统的可扩展性蛋白表达植物可以种植和收获的农业规模5。其次，以植物为基础的表达系统中显着地减少从对人类的蛋白质表达的主机发送的人或动物的病原体的危险性，展示在公众安全6的优越性。最后，植物利用类似于哺乳动物细胞的真核细胞内膜系统，可以进行适当的翻译后修饰的蛋白质，包括糖基化和组件的多个亚单位蛋白质7。这种能力使植物为基础的系统，提前基于原核系统中，如细 ​​菌，因为一个更广泛的重组蛋白类药物，包括单克隆抗体（mAbs），有一个更复杂的结构，并需要大量的翻译后修饰或组件8。

有两个主要的适当疼痛在植物中表达的重组蛋白。第一个是一个稳定的转基因品系，克隆到编码目标蛋白的DNA的....

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Protocol

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1。植物生长

  1. 将60泥炭颗粒成传播托盘。加入4升自来水和2小时让泥炭颗粒吸收水分。
  2. 添加2 N.本生种子使用播种机，到每个泥炭颗粒覆盖托盘用一个透明的塑料球，让他们在一个25°C，湿度84％的环境与16/8小时日/夜循环（ 图1A）发芽。
  3. 取下球形播种后两周，从托盘排水，杰克的化肥加2升的浓度为1.48克/升（ 图1B）。继续生长的植物，在25°C，湿度50％的环境与16/8小时日/夜循环。供应杰克的肥料，每2天每盘2升。
  4. 第4周时，泥炭颗粒的植物转移到一个新的的托盘承载六家工厂提供足够的空间进一步增长（ 图1C），直到他们准备好要渗透在6周龄（ 图1D）。

2。 农杆菌文化准备

2.1注射器入渗的制备

  1. 数A.根癌农杆菌菌株GV3101菌株包含矢量geminiviral p19的，pREP110，pBYGFP，含有卡那霉素（100微克/毫升）的LB琼脂平板上pBYDsRed的。连续一株每板48小时，在30℃和成长。
  2. 同样地，条纹和生长在LB琼脂培养基上的菌株GV3101菌株窝藏MagnICON的载体的5'模块（....

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Results

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1。用注射器入渗荧光蛋白的表达

为了演示注射器农杆菌浸润到植物组织中的有效性，我们测试了两个荧光蛋白- GFP和DsRed -表达两种不同的解构植物病毒载体- geminiviral和MagnICON -在N本生 。对于N。本生的叶子被完全渗透与农杆菌的含geminiviral的载体，观察GFP的表达，在整个叶面积在紫外光下从早2 dpi的4 DPI（ 图4C）达到峰值积累。这种早期的GFP表达的geminiviral矢量其他重组蛋白14,16,18,19与先前的结果是一致的。相比之下，叶渗透与MagnICON矢量含有农杆菌的组合显示，GFP荧光仅5 DPI达到其最大accumulati在7 DPI（ 四维图 ）。否绿色荧光观察到从阴性对照土壤杆菌的混合物pREP110叶子浸润+ p19的（ 图4B）或pICH15879 + pCH14011的（数据未示出），.......

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Discussion

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全球蛋白质为基础的药品的日益增加的需求所需要的新的生产平台，健壮，可伸缩的，低的成本和安全。植物已显示出是一个最有前途的替代生产系统生产药用蛋白。近年来，开发的解构的病毒为基础的载体已启动，瞬时表达的蛋白质在植物中，从而大大提高了植物表达系统2,10的速度和产率。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单而有效的和可扩展的方式引入到植物组织中含有目标基因农杆菌 。我们的研究结果表明，农杆菌注射器或真空导致农杆菌介导的高效引进到两个荧光蛋白，绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的植物叶片和强大的生产方法。

以确保efficie的核苷酸注射浸润和蛋白质生产中，必须仔细控制的关键参数如下。这些参数的偏差可能会导致在农杆菌效率低，反过来，低目标蛋白的表达。

1。植物发育阶段和健康。最有可能的变量在该方法中在实验室之间对植物原料进行渗透。虽然植物可能出现表型相似，他们的发展阶段和生理状态会影响他们的能力在表达重组蛋白显着。对植物的生长和蛋白表达水平有显着影响的具体的参数，包括温.......

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Disclosures

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作者没有竞争经济利益。

Acknowledgements

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我们感谢R. Sun和其他学生陈的实验室所作出的贡献，植物材料的产生。我们也感谢D.格林博士对他的支持本科生科研技术和创新学院（CTI）。这项研究是由美国国立卫生研究院资助U01 AI075549和1R21AI101329陈问:和上证授予CTI亚利桑那州立大学的陈问:部分支持。 ，J. M.登特·柳辛格·乌尔塔多和J. Stahnke是由上证所补助金支持的本科生。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
试剂
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com参见参考文献：Lico 和 Chen 等人，2008
年 DsRedClontech632152www.clontech.com 参见参考文献：Baird 和 Zacharias 等人 2000
MagnICON 载体图标遗传学n/awww.icongenetics.com 参见参考文献：giritch 和 Marillonnet 等人 2006
Geminiviral 载体作者's Labn/a参见参考文献：Chen and He， et al 2011
N. benthamianaAuthor's 实验室n/aherbalistics.com.au
根癌农杆菌菌株 gv3101作者's 实验室n/a参见参考资料：Lai 和 Chen 2012
LB 琼脂羧青霉素-100，板SigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB 琼脂卡那霉素-50，板SigmaL0543www.sigmaaldrich.com
硫酸镁 hepa 水合SigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-胰蛋白胨Fisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto 酵母提取物Becton， Dickinson CO.参考图片 212750www.bd.com
Difco 营养肉汤Becton， Dickinson CO.参考 234000www.bd.com
MES 水合物缓冲液SigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
羧青霉素SigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com
卡那霉素Sigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
氢氧化钠Sigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack's 肥料悍马国际Jul-25www.hummert.com
设备
Vacuubrand MD4 真空泵Fisher13-878-113www.fishersci.com
真空空气调节阀FisherNC9386590www.fishersci.com
干燥器 12 1/8"带O型环Fisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L 桶橡胶女仆n/aRubbermaid Servn'Saver Bowl，10 杯将工作
板/架 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
泥炭颗粒悍马国际14-2370-1www.hummert.com
繁殖盘圆顶水力发电厂132052www.hydroponics.net
Propagaiton Tray水力农场138758www.hydroponics.net
Virbo 手动播种机Gro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora 推车 4 架悍马国际65-6924-1www.hummert.com
15 ml 圆底培养管SigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
分光光度计Bio-Rad170-2525www.bio-rad.com
分光光度计比色皿Bio-Rad223-9950www.bio-rad.com
微量离心管USA Scientific1415-2500www.usascientific.com
台式离心机Bio-Rad166-0602EDUwww.bio-rad.com
>培养箱/摇床EppendorfExcella E25www.eppendorf.com
紫外线模型#： UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
物 <<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

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