颅面部发育中的SOX10可视化:使用枫转基因斑马鱼线时间推移共聚焦显微镜

摘要

实验数据的可视化已成为展示结果给科学界的一个关键因素。越来越多的胚胎活延时录制的产生有助于复杂的发育过程中更好地介绍和了解。该协议是一步一步的通过枫蛋白在斑马鱼光转化指南细胞标记。

摘要

脊椎动物palatogenesis是一个非常精心设计和复杂的发展过程，它涉及颅神经嵴（CNC）细胞，收敛性和扩展面部日珥，以及颅面骨骼成熟的迁移。研究颅神经嵴向斑马鱼口感的特定区域一个SOX10的贡献:生成枫转基因斑马鱼线。 SOX10提供枫报告蛋白的谱系限制性的神经嵴，从而使细胞标记更精确的处理比传统的染料或报告mRNA注射。枫是光转换蛋白，由绿色变为红色光激活后，使人们有可能跟随细胞精确。该SOX10:转基因枫线被用来执行谱系分析，划定数控细胞群产生上颌下颌与元素，并说明同源性面部日珥到脊椎动物。本协议描述了一步s到产生SOX10的生存时间推移视频:枫斑马鱼胚胎。筛窦板的发展将成为一个实际的例子。这个协议可以应用于制作转基因斑马鱼任何枫或类似photoconvertible报告蛋白的时间推移共聚焦记录。此外，它可以被用来捕捉颅面结构在斑马鱼突变体不仅正常，而且还发育异常。

引言

口面裂代表了最普遍的颅面畸形，与1/700-1，000分娩的影响^1。早期胚胎颅面部发育受阻可导致形成唇腭裂（CL / P）的。虽然原因综合征型唇裂已经在很大程度上表明，中颜面部的clefting的非综合征形式的遗传和表观遗传基础仍需要发现^2-4。为了了解这些畸形的病因和发病机制，有必要阐明颅面结构的细胞基础上的发展。

在所有的脊椎动物物种颅神经嵴细胞（CNCC）从背神经管迁移到填充咽弓，这将有助于形成颜面部结构。早期胚胎神经嵴发育受阻可导致形成颅面畸形包括CL / P ^5-7。

在广告DITION以斑马鱼和哺乳动物颅面部发育（CNCCs位于同源区域）之间的结构相似性，基因调控网络是高度保守的。还已经表明，CNCCs开发在脊椎动物物种和斑马鱼⁸之间以相同的方式，使斑马鱼的强大有机体为CL / P的发育和遗传基础的研究它有许多优点，包括体积小，快速，前宫内胚胎发育，以及高繁殖率。此外，胚胎是光学透明的，使得它适合于观察的显微镜⁹根据复杂的发育事件。这是一个理想的动物模型进行迁移和颅神经嵴细胞分化的研究。

枫转基因模型^5:扩大先前发表的作品^{8，10，11，}国家会议中心的迁徙模式是使用SOX10中详细描述。枫是一个照片兑换....

方案

1。胚胎收集的光转化

1. 设置至少十对SOX10的:晚上5至下午6时枫转基因斑马鱼。
2. 第二天早上，拉分频器和收集中午前后鸡蛋。他们转移到培养皿中，并把它们放到28.5℃培养箱。
3. 在大约24小时受精后，通过去除死胚清洁的培养皿。检查是否使用了光场显微镜和任何荧光显微镜与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）过滤胚胎¹³的发展阶段。枫将是可见的，通过这个过滤器。
4. 当胚胎达到60 HPF转移5明亮的荧光的胚胎成一个单独的培养皿中，并在必要时dechorionate他们。

2。安装胚胎的光转化的

1. 使用普通荧光显微镜安装胚胎。安装在激光共聚焦显微镜的胚胎是非常有挑战性的。
2. 使用支架ARD E3水或使用下面的食谱准备新鲜E3:
   添加每升蒸馏水DH _{2 O}以下添加以下做出1X E3L:
   0.292克5.0 mM氯化钠
   0.013克0.17MM氯化钾
   0.044克0.33MM _氯化钙 （干燥剂，96％，ACS试剂）
   0.081克0.33毫米硫酸镁_{4（anhydrated）}
   可选:添加200微升0.05％亚甲蓝到1X E3作为杀真菌剂，搅拌。
   介质保持在室温下放置1周。
3. 使用标准的三卡因或使用....

结果

在SOX10:枫转基因株系，迁徙，后迁徙CNCCs被标记荧光绿色。国家会议中心的细胞标记绿色荧光枫复述内源性SOX10表达^5。

在其他应用中，这种动物模型被用来更好地可视化中集依赖颅面结构的发展。具体的结构，也颅面畸形的病理发展，特别是唇腭裂的正常发育已被抓获。已经产生了一系列的斑马鱼的生存时间推移录像在不同的发育时间点。

作为一个例子，胚胎在60个高倍视野，在该成对的小梁已达到形成筛盘，一个阶段被选定。进行单侧靶向光转化导致细胞的最前部分，在筛盘红色标记。首先，正常的延伸和形成的第É筛窦板，观察野生型斑马鱼图宾根（ 见图1和视频1）。与筛骨板的正常发展的理解，这种野生型的参考，然后应用到胚胎，其中正常基因的表达一直波澜不惊比较CNCCs的迁移。

一个specc1lb吗啉击倒斑马鱼胚胎被选为代表性的例子。SPECC1L是牵连的罕见但严重的倾斜面裂的.......

讨论

这里会显示在斑马鱼模型颅面部发育的可视化的新方法。的SOX10:枫转基因斑马鱼线已经被成功地用于描述中集的详细的迁移模式被用来作为模式生物^5。

以前的研究已经用毛地标，如眼靶细胞，并依赖于枫的mRNA注射，光转化试验或笼荧光葡聚糖光转化为^{10，11，14，15}红袜:相比于这10枫转基因株系具有很多优点方法。神经嵴细胞已经贴有枫，符合一个非常特殊的分布，可以用来更精确的地标，建立区域的命运映射。此外，具有枫蛋白质的SOX10启动子的控制下，内源性表达的确保只有神经嵴细胞的光转换，并且只有衍生物将在稍后阶段进行标记，脱压痕的潜在背景^5。

利用这种技术，在斑马鱼中衍生的颅面结构中的任何神经嵴细胞的形成可成功地示出。正常野生型斑马鱼胚胎的发育可以遵循，这野生型可参考比较的胚胎，其中正常基因的表达一直波澜不惊。

潜在的改进包括使用不同的容器中的可视化过程中来解决胚胎。这可以是一个培养皿中，或任何其他半透明托盘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sox10：Kaede 转基因斑马鱼系	MGH		可通过 Liao 实验室培养皿获得
100x15 mm	BD Falcon	351029
皿 35 mmx10 mm	BD Falcon	351008
超纯 低熔点 （LMP） 琼脂糖	Invitrogen
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem	LabTek	154453
微型加载器 200/包	舍尔	E5242956003
尼康 A1R Si 共聚焦Ti系列	尼康	无 目录号
NIS Elements Software AR3.2 64位	尼康	无 目录号