实验数据的可视化已成为向科学界展示研究成果的关键要素。对发育中的胚胎进行活体延时成像，有助于更清晰地展示和理解复杂的发育过程。本实验方案提供了通过光转化斑马鱼中Kaede蛋白实现细胞标记的逐步操作指南。
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本文内容
摘要
摘要
脊椎动物腭的发生是一个高度协调且复杂的发育过程，涉及颅神经嵴（CNC）细胞的迁移、面部突起的汇聚与延伸，以及颅面骨骼的成熟。为了研究颅神经嵴对斑马鱼腭部特定区域的贡献，构建了一种sox10:kaede转基因斑马鱼品系。Sox10可将kaede报告蛋白的表达限制在神经嵴谱系中，从而使细胞标记比传统的染料或报告mRNA注射更为精确。Kaede是一种光可转换蛋白，经光照激活后会由绿色转变为红色，从而实现对细胞的精确追踪。利用sox10:kaede转基因品系进行谱系分析，可明确生成上颌与下颌结构的不同CNC细胞群体，并阐明面部突起在羊膜动物中的同源性。本方案描述了获取活体sox10:kaede斑马鱼胚胎延时录像的操作步骤，以筛骨板的发育作为实际示例。该方案可应用于对转基因斑马鱼中任何kaede或类似的光可转换报告蛋白进行延时共聚焦成像记录。此外，该方法还可用于捕捉斑马鱼突变体中颅面结构的正常及异常发育过程。
引言
口面裂是发病率最高的颅面畸形，每700至1,000例分娩中即有1例受到影响1。胚胎早期颅面发育过程的紊乱可导致唇裂和腭裂（CL/P）的形成。尽管综合征型唇腭裂的病因已有较多阐明，非综合征型口面裂的遗传和表观遗传基础仍有待揭示2-4。为了理解这些畸形的病因和发病机制，有必要在细胞水平上阐明颅面结构的发育过程。
在所有脊椎动物物种中，颅神经嵴细胞（CNCC）从背侧神经管迁移至咽弓，参与口面结构的形成。早期胚胎发育过程中神经嵴发育的异常可导致颅面部畸形的发生，包括唇裂/腭裂（CL/P）5-7。
除了斑马鱼与哺乳动物在颅面发育方面具有结构上的相似性（神经嵴细胞位于同源区域）外，其基因调控网络也高度保守。已有研究表明，无羊膜动物物种与斑马鱼的颅神经嵴细胞（CNCCs）发育方式相同8，这使得斑马鱼成为研究唇腭裂（CL/P）发育与遗传基础的有力模式生物。斑马鱼具有多种优势，包括体型小、胚胎体外发育迅速以及繁殖率高。此外，其胚胎具有光学透明性，便于在显微镜下观察复杂的发育过程9。因此，它是研究颅神经嵴细胞迁移与分化的理想动物模型。
在先前已发表的研究基础上8, 10, 11，本研究利用sox10:kaede转基因模型对神经嵴细胞（CNCC）的迁移模式进行了详细描述5。Kaede是一种光可转换蛋白，经光激活后会由绿色转变为红色，从而实现对CNCC的精确示踪。这种转换过程中肽骨架发生断裂，表明该转换是稳定的，因此可对细胞进行全程追踪直至其最终归宿12。在sox10转录调控下表达kaede的转基因品系显示，羊膜动物的腭部与斑马鱼的筛骨板均通过上颌突（MXP）与额鼻突（FNP）的双侧融合以同源方式形成，且两物种间的Y形融合线具有相似性。
除了其他应用外，sox10:kaede 转基因斑马鱼模型还被用于生成不同发育阶段斑马鱼胚胎的视频，以展示正常和异常颅面结构的形成过程。通过特定细胞群的光转化，可以追踪其发育过程。本方法介绍了一种在斑马鱼中实现颅面结构发育活体成像的技术，便于直观展示这一复杂的发育过程。
本方案旨在以 sox10:kaede 转基因斑马鱼筛板的正常发育为例，分享制作此类视频的经验。该方案还可进一步应用于制作斑马鱼中任何由头部神经嵴细胞衍生结构的时间推移视频。
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方案
1. 光转化用胚胎的收集
- 傍晚5至6点之间，设置至少十对sox10:kaede转基因斑马鱼进行交配。
- 次日早晨，移除隔离板，并于中午左右收集卵子。将卵子转移至培养皿中，并放入28.5 °C的培养箱中孵育。
- 受精后约24小时，通过去除死亡胚胎清洁培养皿。使用明场显微镜以及配备增强型绿色荧光蛋白（EGFP）滤光片的任何荧光显微镜检查胚胎的发育阶段13。Kaede蛋白可通过该滤光片观察到。
- 当胚胎发育至60小时时，将五个荧光强烈的胚胎转移至另一个培养皿中，并在必要时去除卵膜。
2. 胚胎光转化的固定
- 使用普通荧光显微镜安装胚胎。在共聚焦显微镜上安装胚胎极具挑战性。
- 使用标准 E3 水，或按以下配方配制新鲜 E3 水：
每升去离子水（dH2O）中加入以下成分以配制 1x E3L：
0.292 g 5.0 mM NaCl
0.013 g 0.17 mM KCl
0.044 g 0.33 mM CaCl2（干燥剂，96%，A.C.S. 试剂）
0.081 g 0.33 mM MgSO4（无水）
可选：向 1X E3 中加入 200 μl 0.05% 亚甲蓝作为杀菌剂并搅拌。
该培养基在室温下可保存 1 周。 - 使用标准三卡因溶液，或按以下配方配制三卡因溶液：
配制 5 L 的 0.2% 三卡因溶液，混合以下成分：
45 ml Tris-Cl（1 M，pH 9.5）
5 L H2O
10 g 三卡因 - 通过将 3.75 ml 0.2% 三卡因溶液加入 46.25 ml E3 中，配制“成像缓冲液”（50 ml E3，含 0.015% 三卡因）。
- 在 50 ml 玻璃烧瓶中，将 46.25 ml E3 水与 46.35 mg 低熔点（LMP）琼脂糖混合，微波加热至固体颗粒完全溶解。然后向琼脂糖溶液中加入 3.73 ml 0.2% 三卡因，并将装有琼脂糖的玻璃烧瓶置于 50 °C 水浴中保温，待用。
3. 胚胎的制备与封片
- 用1.1.2步骤中配制的E3/0.015%三卡因溶液麻醉胚胎，并将胚胎转移至载玻片腔室中。
- 用纸巾吸去多余的E3溶液，然后将琼脂糖覆盖在胚胎上。
- 使用微载吸头将胚胎完全背侧朝上定位。确保整个胚胎不漂浮在琼脂糖表面，而是将整个身体压入其中。随后将E3/0.015%三卡因溶液倒入已包埋胚胎的琼脂糖上，直至腔室完全充满液体。
4. 调整共聚焦显微镜的软件设置
- 使用20倍空气浸没式物镜（数值孔径0.75；针孔大小20）对胚胎进行聚焦。然后按下显微镜上的L100光源按钮，并在软件中选择通道。打开图标“视图/采集控制/A1设置”，点击共聚焦设置按钮。随后点击“自动”，并选择以下通道，然后关闭窗口：
通道1：DAPI通道—403.4 nm（可使用波长范围为350–410 nm的光源）
通道2：488.0 nm
通道3：561.9 nm
5. 光转化
- 在单击解除联锁按钮并扫描之前，关闭通道1和通道3，并打开通道2。
- 对目标细胞进行聚焦以进行光转化，建议从1帧/秒和高电压（HV）200开始，然后逐步提高帧率/秒，同时相应降低高电压，直至达到1/32帧/秒和高电压约100–120，具体数值取决于背景噪声水平。
- 当胚胎处于焦点时，观察屏幕右侧边缘，抓住绿色边框并将其缩小，使其覆盖光转化的目标区域，然后用鼠标右键点击。区域越小越好，因为光转化是不可逆的。
- 将帧率调至1帧/秒，高电压调至200，然后开始扫描。此时可看到光转化区域的放大图像。
- 通过开启通道1（403.4 nm）对细胞进行光转化。根据区域大小，使用光转化激光照射5至60秒，直至通过GFP通道观察到的绿色Kaede信号几乎消失。
- 当绿色Kaede信号几乎消失后，关闭通道1，打开通道2和通道3，然后在A1扫描区域字段的窗口上单击右键，并点击“恢复原始尺寸”以检查目标细胞是否已完成光转化。
6. 创建Z轴层叠图像
- 在菜单栏中找到“capture Z-series”图标，并在启动前设置Z-stack的上限和下限。设置LUTs。
7. 软件设置 - 设置延时摄影
- 进入 A1Simple GUI 界面并勾选以下设置：
1/32 帧/秒
尺寸 1024
平均 4 或 8 次，具体取决于单次循环中需要采集的 Z 层切片数量 - 进入：view / acquisition controls / ND sequence acquisition，设置时间间隔（8–30 分钟），点击连续采集，然后点击 Z-stack。根据先前测试结果设定边界，开始录制视频。
- 在当天持续向腔室载玻片中补充 E3/0.015% 三卡因溶液。夜间将腔室完全注满，可维持至次日早晨。
- 次日早晨，重新填充 E3/0.015% 三卡因溶液，并检查胚胎是否仍有生命迹象。荧光消失表明胚胎已死亡。在当天持续进行补充和检查。
- 当目标结构已完成形成，或胚胎已死亡时，停止录制视频。
8. 后期处理
- 在工具栏上点击“显示最大强度投影”，然后右键单击图像并创建新文档。此时视频将以最佳质量显示。接着删除不需要的帧并调整LUTs。最后保存为.avi格式。该格式适用于Windows系统。对于Mac系统，请下载软件将其转换为.mov或.wmv格式。
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结果
在 sox10:kaede 转基因品系中，迁移期及迁移后神经嵴来源的细胞（CNCC）被标记为绿色荧光。以绿色荧光标记的 kaede 所示的 CNCC 细胞重现了内源 sox10 mRNA 的表达模式5。
该动物模型被用于更直观地观察神经嵴细胞依赖性颅面结构的发育过程。研究人员已成功记录了特定结构的正常发育过程，以及颅面畸形（尤其是唇裂和腭裂）的病理发育过程。此外，还生成了一系列斑马鱼在不同发育时间点的活体延时视频。
以60小时受精后（hpf）的胚胎为例，此时期成对的神经弓骨已会合并形成筛板。在此阶段对筛板最前部的细胞进行单侧靶向光转化，使其呈现红色标记。首先，在野生型Tuebingen斑马鱼中观察到筛板的正常延伸与形成过程（见图1和视频1）。在明确了筛板正常发育过程的基础上，以此野生型表型作为参照，用于比较在基因正常表达受到干扰的胚胎中神经嵴来源的细胞（CNCCs）的迁移情况。
选择...
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讨论
本文展示了一种用于可视化斑马鱼模型颅面发育的新方法。sox10:kaede 转基因斑马鱼品系已被成功用于详细描述神经嵴细胞（CNCC）的迁移模式，并作为模式生物使用5。
既往研究曾利用眼睛等宏观解剖标志来靶向细胞，并依赖于kaede mRNA注射、光转化实验或笼锁型荧光素葡聚糖进行光转化10, 11, 14, 15。与这些方法相比，sox10:kaede转基因品系具有诸多优势。由于神经嵴细胞已自带kaede标记且具有特定的空间分布，因此可用于命运图谱绘制的定位标志更为精确。此外，在sox10启动子调控下内源性表达kaede蛋白，可确保仅有神经嵴细胞被光转化，且仅其后代细胞在后续阶段被标记，从而降低背景信号的潜在干扰5。
利用该技术，可成功展示斑马鱼中任何由神经嵴细胞衍生的颅面结构的形成过程。可以观察正常野生型斑马鱼胚胎的发育，并将该野生型参照与正常基因表达受到干扰的胚胎进行比较。
可能的改进包括使用不同的容...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Robert Kelsh 慷慨分享斑马鱼 sox10 启动子试剂。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sox10:kaede 转基因斑马鱼品系 | MGH | 通过 Liao 实验室获取 | |
| 培养皿 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| 培养皿 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| 超纯低熔点琼脂糖 (LMP Agarose) | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 型腔室载玻片系统 | LabTek | 154453 | |
| 微量加样器吸头 200/包 | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si 共聚焦 Ti 系列显微镜 | Nikon | 无目录号 | |
| NIS Elements 软件 AR3.2 64 位版本 | Nikon | 无目录号 |
参考文献
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重印与许可
