斑马鱼幼虫收缩过程中的力测量以评估肌肉功能

摘要

力测量可用于揭示发育、损伤、疾病、治疗或化学毒性对肌肉功能造成的影响。在本视频中，我们演示了一种用于测量斑马鱼幼体躯干肌肉在最大收缩期间产生力量的方法。

摘要

斑马鱼幼体为肌肉发育、肌肉疾病及肌肉相关化学毒性研究提供了模型，但相关研究常缺乏对肌肉功能的评估指标。在本视频文章中，我们演示了一种测量斑马鱼幼体躯干肌肉收缩时产生力量的方法。该方法通过将麻醉后的幼体置于充满盐溶液的实验腔室中，将其前端固定于力传感器，后端固定于长度控制器来实现力的测量。通过电场刺激引发等长单收缩，记录其力响应并进行分析。收缩过程中产生的力量可反映整体肌肉健康状况，并特异性地评估肌肉功能。尽管本文以野生型幼体为例描述该技术，但该方法同样适用于基因修饰幼体，或经药物及毒物处理的幼体，可用于表征肌肉疾病模型、评估治疗效果，或研究肌肉发育、损伤及化学毒性。

引言

受精后3至7天的幼年斑马鱼（Danio rerio）幼体 increasingly 被认为是骨骼肌研究中一种有用的模式生物。幼年幼体被用于模拟人类肌肉疾病^1-9，评估药物及治疗策略^10-11，研究肌肉损伤¹²，理解肌肉发育过程^13-16，以及探究与肌肉相关的化学毒性^17-19。这些领域的典型研究通常考察通过基因操作或暴露于有毒物质后，健康肌肉变为异常的程度；部分研究还考察异常肌肉对治疗的反应程度。这些研究成功的关键在于能够准确评估肌肉健康状况。

尽管目前有多种方法可用于评估斑马鱼幼体的肌肉健康状况，但很少有方法能够提供关于肌肉功能的直接信息。通常通过组织学染色^6,8,11、免疫染色^9,15,16,18、光学显微镜^3,13、电子显微镜^3,4,14,16或双折射性^7,9,11来评估其外观以判断肌肉健康状况，但这些技术仅能提供形态学信息。躯干和尾部的位移以及游泳速度^4,17可用于评估运动功能，但由于这些指标还受到神经输入、能量代谢及其他过程的影响，因此并非肌肉功能的直接测量指标。

相比之下，测量收缩过程中的力生成能够直接评估肌肉功能，是反映整体肌肉健康状况的有效指标。该方法的额外优势还包括数据分析简便和结果具有定量性。在本视频文章中，我们提供了测量幼虫肌肉力生成的详细实验步骤，希望更多研究人员能在其研究中采用此方法，以补充现有的肌肉健康评估手段。

该方法的总体目标是测量斑马鱼幼体躯干肌肉收缩过程中的力生成。为实现这一目标，将斑马鱼幼体麻醉后置于充满盐溶液的实验腔室中。幼体前端固定于力传感器，后端固定于长度控制器。通过电场刺激激活肌肉，并调节刺激电流和幼体长度以产生最大单收缩力。诱发等长单收缩，并记录力响应以供分析。

需要明确的是，该技术并不测量幼虫游泳过程中肌肉产生的力。由于幼虫的两端均被固定在设备上，且幼虫始终处于麻醉状态，因此在测试过程中无法自主运动。此外，电场刺激会同时激活所有肌纤维，引发双侧肌肉同步收缩，而这种情况在自然状态下并不会发生²⁰。因此，该技术并非用于测量游泳时实际产生的力，而是用于评估幼虫肌肉产生力的能力。

我们已利用该技术在鱼斑病（nemaline myopathy）的斑马鱼模型中证实了肌肉无力现象²¹，并用于评估抗氧化剂治疗对多发性微小核心病（multi-minicore disease）斑马鱼模型肌肉功能的影响²²。其他研究者也采用类似技术²³来考察环境污染物对肌肉功能的影响¹⁹。

方案

注意：涉及斑马鱼的所有操作均应遵循相关指南、法规及监管机构的要求。本文所示的所有动物使用操作均已获得密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）的批准。

1. 制作缝合环

1. 使用镊子将非无菌缝合线（USP 10/0 单股尼龙线，3 股）分离成三股。
2. 取其中一股开始打双重单结。在完全拉紧结之前停止，形成一个微小的环（直径约 1 mm），而不是打成结。
3. 使用剪刀剪除环两端多余的缝合线。完成后的环示例见图 1。
4. 将环放置在便利贴的粘性面上以备后续使用。这些缝合线环将在力学测试过程中用于固定幼虫。
5. 根据需要重复步骤 1.1–1.4。每只待测幼虫需制备两个缝合线环。

2. 配制测试溶液

1. 配制 Tyrode 溶液：将 7.977 g 氯化钠、0.373 g 氯化钾、0.265 g 二水合氯化钙、0.102 g 六水合氯化镁、0.048 g 一水合磷酸二氢钠、1.000 g 碳酸氢钠和 0.037 g 二水合乙二胺四乙酸二钠盐加入 1,000 ml 纯化水中。
2. 搅拌溶液直至盐类完全溶解。该溶液可在 4 °C 下保存一个月。
3. 取 47.9 ml Tyrode 溶液，加入 2.1 ml 浓度为 4 mg/ml 的三卡因（根据《斑马鱼手册》²⁴ 配制），混匀。将该溶液储存于棕色玻璃瓶中或用铝箔包裹的玻璃瓶中以避光。该溶液应于室温保存，并每日新鲜配制。

3. 将麻醉后的幼虫固定在实验腔内

1. 将测试装置（图 2）放置在体视显微镜的载物台上。
2. 将力传感器和长度控制器的电缆连接至测试装置。打开力传感器。打开长度控制器，使其保持刚性。（注意： 长度控制器可在肌肉收缩过程中拉伸或缩短肌肉标本。然而，本方法中并未使用长度控制器的这一功能。因此，可将长度控制器视为固定在XYZ定位系统上的刚性连接点）。
3. 使用一次性移液管，向实验腔室中加入测试溶液。
4. 用镊子夹住缝合线环的一端尾部，将其悬挂在力传感器管上。将第二个缝合线环悬挂在连接于长度控制器的管上。（注意： 若夹住缝合线环的弯曲部分，可能导致缝合线扭曲并在后续步骤中断裂）。
5. 使用一次性移液管，将一条斑马鱼幼鱼转移至盛有测试溶液的小培养皿中。等待麻醉剂（三卡因）发挥作用（约 1 分钟）。用镊子轻轻触碰幼鱼尾部，确认其对触觉刺激无游泳反应，以验证麻醉效果。
6. 使用玻璃移液管将幼鱼转移至实验腔室中。
7. 用闭合的镊子轻轻推动幼鱼，引导其前部穿过力传感器管上的缝合线环。再将幼鱼前部穿过另一管上的缝合线环。用镊子夹住两个缝合线环的尾端，同时拉动，使线环在卵黄囊或 swimbladder 后方收紧（图 3A）。
8. 用镊子夹住一个缝合线环的尾端并拉动，使幼鱼围绕管旋转 90°，直至其侧面朝上（图 3B）。若线环收紧程度适中，拉动时会存在一定阻力，幼鱼不应轻易旋转；若线环过紧，则幼鱼无法绕管旋转。
9. 使用连接于长度控制器的 XYZ 定位装置，沿 X 轴方向（轴定义见 图 2A）移动长度控制器管，使其位于幼鱼躯干和尾部下方。保持长度控制器管末端与力传感器管之间留有间隙。
10. 将缝合线环绕过幼鱼尾部，并按前述方法收紧线环（图 3C）。可能需要旋转幼鱼后部，使其侧面朝上。剪去缝合线环的尾端（图 3D）。

4. 将幼虫置于实验腔室中

1. 将幼虫移动到距离腔室底部适当的位置，以确保在后续步骤中幼虫位于倒置显微镜物镜的“工作距离”范围内。为此，使用XYZ定位装置沿Z轴缓慢降低带有附着幼虫的管子，直至管子刚好接触腔室底部。然后将管子上移，使幼虫与腔室底部保持适当距离（约100 μm）。
2. 使用连接在长度控制器上的XYZ定位装置，沿Y轴调整长度控制器管，使幼虫的长轴与力传感器管的长轴对齐。

5. 记录最大单收缩期间的力

1. 将测试装置移至倒置显微镜的载物台上。
2. 调节腔室温度至所需值。首先，将水浴循环器、温度计和温度控制器连接到测试装置上。开启必要的组件，并调节温度控制器的设定值，直至温度计显示所需的温度。本文所包含的数据均在 25 °C 下采集，但也可在室温（RT）或 28.5 °C 下进行测量。
3. 将刺激器的电缆连接至测试装置。开启刺激器电源，但在步骤 5.6 之前不要对幼鱼进行刺激。
4. 确保幼鱼与腔室底部平行。通过 40X 物镜观察幼鱼位于两根管端之间的部分。若与底部平行，则幼鱼两端应同时处于焦点范围内。如有需要，沿 Z 轴调节力传感器管，直至两端均清晰聚焦。
5. 确认幼鱼长度短于最优长度。开启视频肌节长度测量系统，并旋转视频摄像头，使条纹与视频画面的边框平行。该系统通过分析用户定义的兴趣区域（ROI）内每一行像素的像素强度变化来监测条纹间距。系统对 ROI 内所有行的测量结果进行平均，并以相当于视频帧率的频率输出结果（≥80 sec^-1）。条纹间距被用作肌节长度的指标。
6. 调节显微镜以聚焦于外周肌纤维，并记录显示的肌节长度。如有必要，使用连接在长度控制器上的 XYZ 定位装置调节幼鱼长度（X 轴），直至肌节长度小于最优值（例如 1.90 μm）。
7. 调节刺激电流以优化单次收缩力。首先，将刺激器的输出电流设为较低强度（例如 100 mA）。刺激器可通过手动或运行自定义 LabVIEW 程序的计算机触发。使用持续时间为 0.2 msec 的电流脉冲引发幼鱼肌肉的一次单收缩。
8. 使用示波器记录力输出，并利用示波器的游标测量单次收缩的峰值力。以 50 mA 为增量逐步增加电流，并在每个电流水平下测量峰值单次收缩力。每次收缩之间等待 30 秒，以防止疲劳。随着刺激电流的增加，峰值单次收缩力通常先增至最大值，随后逐渐下降。幼鱼产生最大力时对应的电流即为最优刺激电流。将电流幅值设定为该最优刺激电流。
9. 使用 XYZ 定位装置调节幼鱼长度（从而调节肌节长度），以引发最大单次收缩力。野生型斑马鱼幼鱼（3–7 dpf）在肌节长度为 2.10 μm 或 2.15 μm 时产生最大单次收缩力。然而，为避免对幼鱼造成过度应变，可将肌节长度设定为 2.08 μm。
10. 引发幼鱼肌肉的一次单收缩。使用示波器记录力响应，并保存记录以供后续分析。

6. 在幼虫处于最佳长度时测量肌肉组织尺寸

1. 将测试装置移回体视显微镜下。
2. 使用目镜标尺，从侧面测量肌肉层的高度。然后，在不改变幼虫长度的前提下，利用缝合环的尾端将幼虫旋转90°，以便从底部观察幼虫。从底部测量肌肉层的宽度。在解剖学标志位置进行测量（例如 泌尿生殖孔）（图 4).
3. 使用显微刀片切断缝合线环，使幼虫从测试装置中释放。

结果

在健康的野生型斑马鱼幼鱼中，肌纤维应相互平行，纤维之间无明显间隙，并具有清晰的横纹（图5A）。不具备这些特征或出现明显损伤（如肌纤维脱离，图5B）的野生型斑马鱼幼鱼应予以弃用。

单条斑马鱼幼鱼的峰值抽搐力与刺激电流关系的代表性曲线图如图所示 图6对于3-7日龄的野生型斑马鱼幼鱼，最佳刺激电流通常在400-600 mA之间，其中3日龄幼鱼所需的刺激电流一般高于6-7日龄幼鱼。

原始力数据（在步骤 5.8 期间采集）需使用数据分析软件进行处理和分析。首先，将力记录的基线设为零。其次，将力传感器的电压输出转换为力（mN）（参见制造商说明书，为力传感器生成校准曲线）。图 7 展示了单个幼虫在最大单收缩过程中采集到的一个代表性力响应。可使用数据分析软件测量力响应的峰值力及其他特征参数。

一组典型的最大抽搐收缩峰力数据如图所示 图8A典型的野生型3至7天幼鱼的峰值抽搐力范围为0.9至1.7 mN，较年长的幼鱼产生的力量高于较年轻的幼鱼。峰值抽搐力的差异可能源于生长和发育等正常生理过程图8）或基因突变相关病理等异常过程^21,22.

通过肌肉横截面积（CSA）进行归一化，可用于确定峰值单收缩力的差异在多大程度上仅仅是由于肌肉组织大小不同所致^21,22。肌肉横截面积可通过以下公式估算：CSA = π(A/2)(B/2)，其中 A 为从侧面观察时肌肉组织的高度，B 为从底部观察时肌肉组织的宽度，并假设横截面为椭圆形。野生型 3–7 dpf 幼鱼的典型 CSA 值范围为 0.027 至 0.034 mm²，其中 3–4 dpf 幼鱼的 CSA 值通常小于 5–7 dpf 幼鱼。最大单收缩条件下归一化的峰值力数据示例见图8B。野生型 3–7 dpf 幼鱼的典型归一化峰值单收缩力值范围为 34 至 51 mN/mm²，其中 4–7 dpf 幼鱼的值通常高于 3 dpf 幼鱼。

图1. 缝合线圈。 箭头指向缝合线圈的尾端。

图 2. (A) 带有标注组件的测试装置。(B) 实验腔室的放大视图。 (a) 带透明底部的实验腔室。(b) 力传感器。(c) 长度控制器。(d) XYZ 定位装置。X、Y 和 Z 轴在右上角定义。(e) 利用热电模块的温度控制系统。管道用于水流以冷却热电模块。(f) 连接到力传感器的不锈钢管。(g) 连接到长度控制器的不锈钢管。(h) 温度计微探针。(i) 跨越腔室长度的铂金平行板电极。铂金板高 2.5 mm，厚 0.255 mm。

图 3. 将幼体固定于实验腔室。 (A) 幼体前端已绑扎，但尚未旋转 90°。 (B) 幼体旋转 90° 后的状态。 (C) 幼体后端已绑扎，但尚未旋转。 (D) 幼体完成旋转且缝合环末端线头已被剪除。

图4. 横截面积估算的测量方法。 肌肉组织分别从(A)侧面和(B)底部观察。红色标线的位置表示泌尿生殖孔的位置。红色标线的长度分别表示从侧面和底部观察时肌肉组织的高度和宽度。

图5. 斑马鱼幼体躯干肌肉系统的侧面观。 (A) 健康组织。 (B) 明显受损的组织。由肌纤维脱离引起的挛缩用星号标记。

图 6. 峰值抽搐力随刺激电流变化的代表性曲线图。 最佳刺激电流为 500 mA。

图7. 单次抽搐收缩的代表性力记录。该收缩由0毫秒时的刺激脉冲引发。峰值力为1.56 mN。

图8. 来自3-7 dpf幼鱼的代表性力学数据。 (A) 最大抽搐收缩的峰值力数据。(B) 标准化为横截面积（CSA）的最大抽搐收缩峰值力数据。较年长的幼鱼（6-7 dpf）从5 dpf开始饲喂含螺旋藻的Hatchfry Encapsulon Grade 0饲料（Argent Laboratories）。每组N=5，数据以均值±标准差表示。与3 dpf幼鱼显著不同的组用(*)表示，与4 dpf幼鱼显著不同的组用(#)表示（ANOVA，P<0.05）。标准化力在3至4 dpf之间的显著增加(B)表明在此期间内在产力能力增强，而在4至6-7 dpf之间力的增加(A)则归因于生长，因为在该时间段内标准化力从4 dpf到7 dpf无明显变化。

讨论

该方法通过测量单次收缩期间产生的力来评估斑马鱼幼鱼躯干肌的肌肉功能。尽管可以在斑马鱼幼鱼中诱导强直性收缩（例如 以每秒200次刺激脉冲、持续0.2秒的条件刺激时，最大强直收缩力仅比最大单收缩力高10-15%。因此，单收缩过程中产生的力量可合理反映肌肉的收缩能力。相较于强直收缩，单收缩更受青睐，因其在缝合结扎处引起撕裂或滑脱的可能性较低。

为了通过该技术获得有意义的数据，应确保每条幼虫均达到最大抽搐力，同时尽量减少实验组之间的变异性。基于这些目标，我们提出以下建议：首先，在将幼虫结扎至力传感器和长度控制器管时需格外小心。若缝合环扎得过紧，缝线会切断肌肉组织；若缝合环扎得不够紧，则幼虫产生的力无法完全传递至力传感器。这两种情况——尤其是后者——会导致对最大抽搐力的低估。其次，由于测试多个实验组可能需要数小时（每条幼虫约20-30分钟），建议在不同组之间交替进行测试，因为幼虫在测试期间会持续发育。

尽管所提及的部分设备对于测量最大抽搐力是必不可少的例如 力传感器、电流刺激器），其他物品并非绝对必要。视频肌节长度系统较为理想，但非必需。作为替代方案，可通过一系列抽搐收缩来确定最佳长度，即调整幼虫长度直至达到最大抽搐力。温度控制系统同样非绝对必要。在测量对温度高度敏感的抽搐动力学参数时，温度控制至关重要；而最大抽搐力对温度的微小变化并不敏感，因此可在室温下进行测量。需要注意的是，无论力测定过程中浴槽内的温度如何，幼虫在实验前均应维持在28.5 °C的最佳生长温度。²⁴ 在进行力学测试之前，需进行准确分期。

幼虫在含有三卡因的台氏液中进行测试。我们使用0.02%（w/v）的三卡因，该浓度为推荐用于麻醉的浓度²⁴，以消除神经系统引发的自发性收缩，从而防止在力量测试过程中产生疲劳。三卡因还可简化绑扎步骤并缩短整体测试时间。然而，我们观察到在测试溶液中添加三卡因会持续使最大单收缩力降低约30%。在蝌蚪尾肌中也观察到类似效应，即在神经肌肉传递被阻断后，三卡因仍可降低肌肉的收缩力，提示三卡因对肌肉具有直接作用²⁵三卡因可能通过降低细胞膜的钠电导性来减少肌肉细胞的兴奋性，这与它在神经细胞中的作用类似。²⁶. 阻断运动神经元激活的其他方法包括 d-筒箭毒碱和α-银环蛇毒素，但与三卡因不同，这些化合物不能透过皮肤，必须直接注射到头部、脊髓或心脏中²⁷个别研究者需评估三卡因是否适用于其特定实验需求。若在测试溶液中添加三卡因，实验间应保持浓度一致，且研究者应验证三卡因的作用在不同实验组间无差异。

我们描述的这种方法适用于3 dpf到7 dpf的幼鱼。尽管肌肉纤维在受精后17小时（即自发尾部运动开始时）已表现出功能活性²⁷，但在3 dpf之前，由于尾部长度过短，难以将幼鱼固定于测试设备上。我们通常不在7 dpf之后对幼鱼进行测试，因为许多疾病模型的存活时间不超过此阶段。如果需要测试5 dpf之后的幼鱼，则应对其进行喂食。我们观察到，未喂食的幼鱼肌肉较小，且产生的最大单收缩力低于已喂食的幼鱼，这可能与卵黄囊的逐渐消耗有关。因此，建议在3–5 dpf之间进行幼鱼测试，以避免外源性喂食带来的额外变量影响。

综上所述，我们描述了一种用于定量且可靠地测量斑马鱼幼体躯干肌肉在最大单收缩过程中产生力量的方法。该方法可用于评估斑马鱼幼体肌肉的整体健康状况，并特异性地提供有关肌肉功能的信息。除了能够提供力量产生幅度的信息外，该技术还可用于研究力量产生的动力学特征，或经改进后用于研究肌肉疲劳²²。尽管本文所述技术针对野生型幼体的应用进行了说明，但该方法同样适用于基因修饰的幼体，或经药物或毒物处理的幼体，可用于表征肌肉疾病模型并评估治疗方法，或用于研究肌肉发育、肌肉损伤以及与肌肉相关的化学毒性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
三卡因粉末	Sigma-Aldrich	A5040
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	223506
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S0751
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297
二水合乙二胺四乙酸二钠盐	Sigma-Aldrich	E5134
设备
非无菌缝合线	Ashaway Line Twine	S30002	USP 10/0 单丝尼龙（3 股）
镊子	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
弹簧剪	Fine Science Tools	15000-08	Vannas
体视显微镜	Leica Microsystems	MZ8	使用 Fostec EKE ACE I 光源照明
力传感器	Aurora Scientific	400A
长度控制器	Aurora Scientific	318B
XYZ 定位装置	Parker Hannifin	3936M
温度计	Physitemp	BAT-12
一次性移液管	Fisher Scientific	13-711-9AM	剪切管端以扩大开口，便于幼体转移
培养皿	Fisher Scientific	08-757-11YZ
玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-8B	剪切管端（并进行火焰抛光）以扩大开口，便于幼体转移
倒置显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Axiovert 100
水浴循环器	Neslab Instruments	RTE-111
温度控制器	Alpha Omega Instruments	Series 800
刺激器	Aurora Scientific	701C	高功率，跟随式刺激器
视频肌节长度测量系统	Aurora Scientific	900B-5A
LabVIEW 软件	National Instruments
示波器	Nicolet Technologies	ACCURA 100
微型刀片	Fine Science Tools	10050-00
微型刀片夹持器	Fine Science Tools	10053-13
数据分析软件（Signo）	Alameda Applied Sciences