对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

摘要

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。

摘要

血管生成是指从已有的血管网络中通过出芽等方式形成新血管的复杂过程。血管生成不仅在器官和组织的正常发育中发挥关键作用，也在许多血管形成失调的疾病中起重要作用，例如癌症、失明以及缺血性疾病。在成年个体中，血管通常处于静息状态，因此血管生成成为新药研发的重要靶点，旨在特异性调控疾病状态下的新血管形成。为了更好地理解血管生成过程，并制定有效的调控策略，需要建立能够准确反映其各个生物学阶段的模型。新生小鼠视网膜是研究血管生成的优秀模型，因为在出生后的第一周内，动脉、静脉和毛细血管逐步发育形成一个血管丛。该模型还具有二维（2D）结构的优势，相较于其他血管网络复杂的三维（3D）解剖结构，更便于分析。通过在出生后不同时间点分析视网膜血管丛，可以在显微镜下观察血管生成的各个阶段。本文展示了一种利用荧光标记的异凝集素（isolectin）和血管特异性抗体对小鼠视网膜血管系统进行染色与分析的简便方法。

引言

血管生成是一个复杂的发育过程，指从已有的血管网络中形成新的血管，该过程受多种信号通路调控。其中最为重要的通路是VEGF通路。缺血细胞会释放VEGF，从而启动邻近血管的血管生成出芽。新生血管出芽前端的内皮细胞为“顶端”细胞，其可产生丝状伪足，朝VEGF来源方向延伸，其后跟随的是不断增殖的“茎”内皮细胞。通过这种方式，活化的内皮细胞向无血管区域迁移并增殖，并在该区域形成新的血管管腔。为了稳定这些管腔以支持血流，内皮细胞会与周细胞和平滑肌细胞相互作用，这些细胞包绕在新生血管周围¹。血管生成对于胚胎及生长组织的血管化至关重要，但也参与多种病理过程，例如癌症；而血管生成缺陷则与缺血性疾病相关。因此，开发有效的药物治疗手段以调控血管生成，成为治疗疾病的重要研究方向。例如，有效的抗血管生成因子可抑制肿瘤生长，而促血管生成策略则可用于治疗缺血性疾病。因此，建立血管生成模型对于深入理解新血管形成的调控机制，以及开发增强或抑制血管生长的新型治疗策略具有重要意义。

血管生成研究的一个基本要素是选择合适的血管模型。许多 体外 已设计出多种模型，用以重现血管生成的基本步骤，如内皮细胞的迁移、增殖和存活 ^2,3 一种常用的方法 体外 检测指标是在Matrigel基质上形成内皮细胞的分支网络，尽管该方法对内皮细胞并非特异，且通常不包含周细胞或平滑肌细胞的支持作用。对 离体 利用小鼠器官培养体系（如拟胚体实验、主动脉环实验和胎鼠跖骨实验）研究出芽式血管生成，可分析内皮细胞在多种辅助细胞共存环境下的血管生成过程。然而，这些实验方法的主要局限性在于缺乏血流以及血管随时间推移发生退化，导致分析时间窗口有限。因此，为了更准确地理解血管生成的调控机制， 在体 需要相应的模型，例如利用小鼠皮下植入的海绵或Matrigel栓塞所建立的模型，以及后肢缺血模型。然而，由于新生血管具有复杂的三维结构，这些模型的分析较为困难。相比之下，斑马鱼胚胎已被证明是可视化整个生物体中血管生成过程的优良模型。 ⁴然而，小鼠在进化上比斑马鱼与人类更为接近，因此在许多情况下小鼠是更优选的模型。因此，出生后小鼠视网膜的血管生成是血管生成研究中一种特征明确且常用的方法。该方法不仅提供了生理性的研究环境，还形成了易于通过适当荧光染料进行可视化的二维血管网络。利用该技术，可对血管网络结构、内皮细胞增殖、出芽、血管周围细胞募集以及血管重塑等过程进行研究。

在新生小鼠视网膜中，视网膜血管的发育发生在出生后的第一周。与人类不同，小鼠出生时视力未发育，视网膜的血管化仅在出生后才开始。视网膜血管从出生后第0天（P0）视网膜中央靠近视神经的区域起始，通过血管生成过程逐步发育，形成高度有序的血管丛，并在约P8时延伸至视网膜周边区域⁵。血管以特征性方式发育：毛细血管丛从视盘逐渐向外周生长，形成规律交替分布的动脉和静脉，并由中间的毛细血管网络连接。视网膜血管系统是研究血管生成的理想模型，因为血管在近乎二维平面上生长，易于识别，因此在视网膜平铺标本中相对容易观察其血管结构⁵。已有研究报道了一种在ex vivo条件下分离新生小鼠视网膜以分析内皮尖端细胞反应数小时的方法⁶。此外，若需更详细地研究整个视网膜血管系统及其相关血管标志物，则需对不同发育阶段的固定视网膜样本进行免疫染色。

本文详细描述了一种我们用于小鼠视网膜血管丛整体染色的可靠且技术上简便的方法，涵盖了从出生后眼球的摘除（另见⁷）到染色步骤，直至显微镜下最终成像的全过程。

方案

所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。

1. 出生后眼球的去核与固定

1. 将人道处死的幼鼠侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。
2. 使用剪刀和镊子摘除眼球。
3. 将剪刀置于摘除的眼球下方，剪断视神经及周围组织，取出眼球，并转移至含有4%多聚甲醛（PFA，用2x PBS配制）的24孔板中，室温放置。
4. 让每只眼球固定10–15分钟，然后转移至冰上预冷的2x PBS中，继续孵育5–10分钟。建议分批进行眼球摘除及后续固定处理，以确保每只眼球的固定程度一致。

2. 新生小鼠视网膜的解剖

1. 使用已剪断以扩大管口的塑料巴斯德吸管，将眼球转移至含有2倍PBS的培养皿中，并置于解剖显微镜下。
2. 用镊子和剪刀去除眼球周围的脂肪组织。
3. 用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，沿角膜和虹膜剪开并弃去。
4. 将镊子插入视网膜与巩膜之间，小心剥离巩膜，注意避免撕裂视网膜。脉络膜层也可一并去除；但如果此步骤可能损伤视网膜，则可保留脉络膜，因其对免疫染色质量无明显影响。
5. 用镊子移除晶状体和玻璃体。
6. 用精细镊子将玻璃体血管聚集到眼球中心，然后迅速从视网膜中心拉出（或用精细剪刀在玻璃体血管基部剪断）。
7. 在洁净的培养皿中用PBS冲洗呈杯状的视网膜。
8. 使用弹簧剪刀从视网膜边缘做4至5条放射状切口，切至约视网膜半径的2/3处，形成“花瓣”状。
9. 用巴斯德吸管吸去PBS使视网膜展平，再用一小块吸水纸吸除残留液体。
10. 缓慢地逐滴加入冰冷（-20 °C）甲醇覆盖视网膜表面，直至完全浸没，随后加足量甲醇彻底淹没样本。此步骤有助于固定视网膜并促进通透化处理，视网膜将变为白色。
11. 使用已剪断以扩大管口的塑料巴斯德吸管，将视网膜转移至2 ml离心管中。
12. 将视网膜在冷甲醇中固定至少20分钟，然后进行免疫染色。本文所用抗体中，仅有VE-Cadherin无法在甲醇固定的视网膜上有效使用；在此情况下，视网膜需在第9步后直接进入免疫染色流程。
13. 如需保存，视网膜可在-20 °C甲醇中储存数月，再进行染色。

3. 视网膜血管的免疫/异凝集素染色

1. 小心移除或倒掉甲醇，并用 PBS 轻轻冲洗视网膜片刻（此步骤中视网膜仍位于上述第 11 步的同一 2 ml 离心管中）。
2. 移除 PBS，用 100 μl 通透/封闭液（PBS + 0.3% Triton + 0.2% BSA）加相应血清（5%）覆盖视网膜（参见 表1）并轻轻振荡1小时。
3. 去除通透/封闭液，加入100 μl选定的一抗溶液，在4 °C下轻柔振荡孵育过夜（见 表1）和/或异凝集素B4，均用破膜/封闭液稀释制备。
4. 去除抗体/凝集素，用含0.3% Triton的PBS（PBSTX）清洗视网膜4次，每次10分钟。
5. 在某些情况下， 例如 使用IsolectinB4-Alexa488或直接标记的一抗染色后，无需使用二抗，视网膜可直接封片（步骤7）。若在步骤3中使用了未标记的一抗，则加入100 μl相应荧光标记的二抗（用PBSTX按1/200稀释），4 °C孵育过夜或室温孵育4小时。
6. 去除二抗，用 2 ml PBSTX 溶液洗涤视网膜 4 次，每次 15 分钟。
7. 使用宽口塑料巴斯德移液管将视网膜转移至载玻片上，并用吸水纸去除多余的PBSTX。取50 μl Prolong封片剂滴加于盖玻片上，将其轻轻覆盖在视网膜上，完成封片。
8. 将载玻片于4 °C冰箱中过夜，确保载玻片平放并避光，以使Prolong封片剂充分固化。
9. 使用共聚焦显微镜或落射荧光显微镜对视网膜进行成像。

结果

解剖后，视网膜应呈现为一朵扁平的花状结构（图1）。根据上述方案，可通过异凝集素B4-Alexa488染色观察内皮细胞，而支持性血管肌细胞则通过抗α-平滑肌肌动蛋白抗体染色显示（图2）。在图2中使用5X物镜的低倍视野可整体展示视网膜血管的组织结构。此外，通过上述方案中提供的不同抗体组合，也可利用抗CD31免疫组化染色观察内皮细胞，而支持性的周细胞则可通过抗NG2（图3）或抗结蛋白（desmin，图4）抗体染色显示。抗结蛋白染色有助于观察周细胞的指状突起，并判断其是否与内皮细胞紧密关联。相比之下，抗NG2染色可清晰勾勒出每个周细胞的细胞核，因此在定量分析血管上周细胞数量时尤为有用。此时可通过高倍物镜（例如 60X）观察视野，计数每视野内的细胞数量来完成定量。如有需要，也可使用其他抗体组合（见表1）；例如，抗IV型胶原抗体可用于显示血管基底膜。对内皮细胞进行染色的视网膜样本，可进一步分析血管生成的关键特征，如血管从视网膜中心...

讨论

本文介绍的方法提供了一种简单且高效的方式，用于获取新生小鼠视网膜整体染色样本的图像，使其成为一种易于定量且具有生理相关性的血管生成模型。最初，由于小鼠眼球体积小且呈球形，解剖操作可能较为困难，因此需要一定的练习以及良好的解剖工具才能获得可靠的结果。使用两倍浓度PBS制备的眼球进行解剖非常重要，因为这会导致眼球轻微失水并降低眼内压，从而有利于解剖操作。良好的视网膜制备至关重要，原因有以下几点：首先，它能维持脉管系统的完整性；其次，若玻璃体血管系统未彻底清除，会降低抗体染色效率，导致背景信号增强和分辨率下降。如果视网膜的PFA固定时间过长，也可能出现此类问题。然而，在进行凝集素染色或大多数抗体染色之前，将视网膜在-20 °C冰箱中以甲醇长期保存数月是可行的。表1中列出了适用于该方法的多种抗体。尽管凝集素染色通常很少出现问题，但它不仅标记内皮细胞，也会标记巨噬细胞。对于整体视网膜的良好免疫染色，抗体的选择至关重要，且染色方案必须根据抗体的特异性和浓度进行调整，尤其是使用多克隆抗体时，不同批次之间可能存在差异。高背景信号通常可通过降低抗体浓度、延长洗涤时间或在洗涤步骤中增加去污剂用量来减少。抗体到货后应分装保存...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
3 ml 塑料移液管	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	用剪刀剪去管尖以制成宽口
BD Falcon 24 孔板	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri 培养皿 TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond 载玻片	VWR	631-0624
盖玻片 22 × 22 mm	VWR	631-1336
Dumont 镊子 #5	World precision instruments	14095
弹簧剪刀，长 10.5 cm，直刃 8 mm	World precision instruments	501235	用于去核操作
Vannas 剪刀，长 8.5 cm，直刃 7 mm，超细尖端 0.025 × 0.015 mm	World precision instruments	500086	用于视网膜解剖
超细 Vannas 剪刀，长 8 cm，直刃 3 mm，超细尖端 0.015 × 0.015 mm	World precision instruments	501778	用于视网膜解剖
crystal clear’ 2 ml 管	Starlab	E1420-2000
试剂
磷酸氢二钠	Sigma	S0876	PBS 试剂
磷酸二氢钾	Sigma	P5655	PBS 试剂
氯化钠	Sigma	S9625	PBS 试剂
多聚甲醛	Sigma	P6148	用 2× PBS 配制，-20 °C 保存
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A7638
曲拉通 X-100	Sigma	T9284
驴血清	Sigma	D9663
山羊血清	Vector	S-1000
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	封片试剂
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	使用稀释比例为 1:200
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	使用稀释比例为 1:200
一抗
抗 NG2（兔多克隆）	Millipore	AB5320	检测周细胞
抗 GFAP（克隆 GA5，小鼠单克隆）	Millipore	MAB360	检测星形胶质细胞
抗 Desmin（克隆 Y66，兔单克隆）	Millipore	04-585	检测周细胞
抗 Collagen IV（兔多克隆）	Chemicon	AB756P	检测血管基底膜
抗 alpha 平滑肌肌动蛋白-Cy3（克隆 1A4，小鼠单克隆）	Sigma	C6198	检测血管平滑肌细胞
抗 Endoglin（克隆 MJ7/18，大鼠单克隆）	BD Pharmingen	550546	检测内皮细胞
抗 CD31（克隆 MEC13.3，大鼠单克隆）	BD Pharmingen	553370	检测内皮细胞
抗 VE-Cadherin（克隆 11D4.1，大鼠单克隆）	BD Pharmingen	550548	检测内皮细胞连接
抗 Alk1（山羊多克隆）	R&D Systems	AF770	检测内皮细胞
二抗
山羊抗兔-Alexa594	Invitrogen	A11012	所有二抗到货后立即分装，并于 -20 °C 保存
山羊抗大鼠-Alexa488	Invitrogen	A11006	所有二抗到货后立即分装，并于 -20 °C 保存
山羊抗大鼠-Alexa594	Invitrogen	A11007	所有二抗到货后立即分装，并于 -20 °C 保存
山羊抗小鼠-Alexa488	Invitrogen	A11029	所有二抗到货后立即分装，并于 -20 °C 保存
驴抗山羊-Alexa594	Invitrogen	A11058	所有二抗到货后立即分装，并于 -20 °C 保存
显微镜
解剖显微镜	Zeiss	Stemi SV6
相机	Zeiss	Axiocam HRc	解剖显微镜用相机
落射荧光显微镜	Zeiss	Axioimager 配 Apotome
相机	Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager 用相机
共聚焦显微镜	Nikon	A1R