小鼠异体共生：详细实验方案

摘要

将两个生物体进行异种共生连接可导致形成共用的循环系统。在本方案中，我们描述了在野生型小鼠与组成型表达GFP的小鼠之间建立异种共生连接的手术步骤。

摘要

异种共生是一种通过手术将两个生物体连接在一起，使其共享血液循环的技术。将两只动物的皮肤缝合可促进炎症部位微血管的形成。异种共生伙伴共享其循环抗原，因此不会产生不良免疫反应。该技术最早由 Paul Bert 于1864年描述¹，后于1933年由 Bunster 和 Meyer 改进，以提高动物存活率²。在本实验方案中，采用改良的 Bunster 和 Meyer 方法，通过手术将两只小鼠连接在一起。动物通过肘关节和膝关节相连，随后缝合皮肤，以提供牢固支撑，避免缝合部位皮肤受力过大。本文详细描述了将一只全身表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠与一只野生型（WT）小鼠进行异种共生连接的过程。手术两周后，将这对小鼠分离，可通过流式细胞术在 WT 小鼠的外周血中检测到 GFP 阳性细胞。这种血液嵌合状态使得研究者能够分析一只动物的循环细胞对另一只动物的贡献程度。

引言

异种共生（parabiosis）是指通过外科手术将两个生物体连接在一起的技术，最早由Paul Bert于1864年描述，旨在建立研究共享循环系统模型，最初的操作包括将两只大鼠的皮肤和肌肉壁连接在一起¹。异种共生可促进炎症部位微血管的形成³，并在生理学研究中具有多种应用，例如研究垂体与性腺之间的激素通讯，以及肾脏在高血压中的作用⁴。该技术还被进一步用于研究前体细胞在新生血管形成中的募集与整合⁵、造血干细胞的迁移⁶、淋巴细胞的迁移行为⁷，以及循环中的炎症细胞或干细胞在肿瘤转移^8,9和神经退行性疾病¹⁰中的作用与动力学特征。

异种共生的一个显著优势在于，配对动物共享循环中的共同抗原，从而允许细胞迁移和新生血管形成，而不会引发免疫反应。重要的是，Weissman 等 研究表明，雄性和雌性小鼠之间的异种共生不会导致抗H-Y抗体的产生¹¹。

在Paul Bert最初描述的实验方案中，两只动物通过皮肤和肌肉壁的连接而结合在一起¹。然而，这种方法对动物造成显著的应激，并因伤口感染导致较高的死亡率。此后，多个研究团队对连体共生技术进行了改进，其中以Bunster和Meyer于1933年提出的方案最为广泛采....

方案

所有动物实验均按照加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会的指南以及美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。以下所述实验程序从开始到结束大约需要45至60分钟。

1. 手术区域的准备

1. 在洁净的动物手术室内进行操作。
2. 设备：异氟烷挥发罐、配备加热垫的Gaymer T型泵。
3. 无菌器械：两把弯镊、精细剪刀、持针器。
4. 整个操作过程中必须佩戴无菌手套。

2. 动物准备

1. 将两只同品系、体重和体型相近的雄性或雌性小鼠放入同一笼中，共同饲养至少两周，以确保其能够和谐共处。优先选用雌性小鼠，因其攻击性较弱。
2. 使用异氟烷挥发罐对动物进行麻醉。将小鼠置于连接异氟烷挥发罐的Posi-Seal诱导室中（4–5% v/v）。麻醉诱导后，将动物转移至脱毛区域，并通过连接异氟烷（1.5–2% v/v）的鼻罩在整个操作过程中维持麻醉状态。使用棉签涂抹眼膏，防止角膜干燥。
3. 将动物置于仰卧位。彻底剃除左侧小鼠的左侧体壁和右侧小鼠的右侧体壁毛发，范围自肘关节上方约1 cm至膝关节下方约1 cm。
4. 用浸有聚维酮碘的擦拭巾对剃毛区域进行2–3次彻底擦拭，随后使用酒精擦拭巾消毒，完成无菌准备。将小鼠置于覆盖无菌垫的加热垫上。
5. 为实现镇痛，按10 mg/kg和0....

结果

将两个生物体进行异种共生（parabiosis）后，预期结果是每个动物的循环系统对共同血液循环作出均等贡献（图2）。通过流式细胞术分析，可轻松验证野生型（WT）小鼠与GFP阳性小鼠在异种共生后血液是否成功达到平衡。本实验中，在手术后2周从小鼠尾部采集静脉血，并分离外周血细胞（以去除红细胞）。随后，对分离得到的造血来源细胞组分进行流式细胞术分析，检测其中GFP阳性细胞与野生型（WT）细胞的存在情况。结果与以往研究一致，来自野生型小鼠的血液显示出嵌合现象，表现为约一半为GFP阳性细胞，另一半为野生型细胞（53% WT细胞和47% GFP细胞）（图3）。

图1. 连体手术：切口位置。 对麻醉动物的体侧进行.......

讨论

本文讨论的联体共生方法技术难度较低，且死亡率低。膝关节和肘关节的连接方式是对Bunster和Meyer技术的重要改进。然而，该手术仍具有侵入性，因此在整个手术过程中必须维持无菌条件。为进一步预防手术部位感染，必须对联体动物使用抗生素组合治疗，并定期进行监测。为确保牢固固定并防止疼痛，连接肘部和膝部的缝合线应环绕关节，而非穿过组织。

作为异氟烷吸入麻醉的替代方法，也可通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪或其他经机构委员会批准的麻醉药物来诱导麻醉。使用异氟烷的优点在于能够快速诱导麻醉，并显著缩短恢复时间。此外，麻醉深度可以得到精确控制。

异种共生（parabiosis）是一种强大的实验方法，可使两只动物的循环系统相互连通并达到平衡，适用于生理学研究。与骨髓移植或细胞注射等常用技术相比，该方法具有多项优势。细胞递送操作有时仅能提供较短的时间窗口来观察移植细胞的作用效果，此外，免疫抑制会增加感染以及后续发病率和死亡率的风险。而通过异种共生，可长期维持嵌合循环状态，从而研究循环因子（如细胞、细胞因子、 等等。）与其来源无关。该系.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷-凤凰	Clipper	NDC 57319-559-06
Posi-Seal 诱导室	分子成像产品公司	AS-01-0530-SM
便携式麻醉系统	分子成像产品公司	AS-01-0007
Gaymer T 泵	Gaymar 工业公司	TP650
加热垫（保温毯）	Kent 科学公司	TP-22G
弯头镊子	Roboz	RS-5101
剪刀	精细科学工具公司（FST）	FST 14063-09
持针器	FST	FST 12501-13
电动剃毛器	Oster	Golden A5