活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白

摘要

活体显微镜是一个功能强大的工具，使活体动物成像的各种生物过程。在本文中，我们提出了用于成像的亚细胞结构，如分泌颗粒，在活体小鼠的唾液腺的动力学的详细方法。

摘要

在这里，我们描述了一个程序，在现场啮齿动物图像的亚细胞结构是基于使用共聚焦活体显微镜的。作为一个模型器官，我们使用活体小鼠的唾液腺，因为它们提供多个优点。首先，他们可以很容易地接触到使访问光学和稳定，以促进由于心跳和呼吸运动伪影的减少。这显著有利于成像和追踪小亚细胞结构。第二，大多数唾液腺的细胞群是来自器官的表面接触。这允许使用共焦显微镜，其具有更高的空间分辨率比已被用于活体成像的其它技术，如双光子显微镜。最后，唾液腺可以容易地控制药物学和基因，从而提供了一种稳健的系统在分子水平上研究生物过程。

在这个研究中，我们侧重于设计遵循在腺泡细胞分泌颗粒的胞吐作用和根尖质膜，其中分泌颗粒熔化后的β-肾上腺素能受体的刺激的动态动力学的协议。具体而言，我们所用的转基因小鼠，其共表达GFP的细胞溶质和膜靶向肽融合荧光蛋白串联番茄。然而，我们用于稳定和图像唾液腺的程序可以扩展到其他小鼠模型并耦合到其他的方法来标记在体内的细胞成分，使各个亚细胞结构，如内涵体，溶酶体，线粒体的可视化，并肌动蛋白细胞骨架。

引言

在过去的二十年活显微镜的出现和使用的荧光蛋白，导致在每一个细胞的过程可以想象的重大突破，从而推动我们的细胞生物学¹的理解。这个领域已经从使用哺乳动物细胞培养是非常强大的模型系统，特别是当它涉及到实验操作中获益良多。然而，他们不经常提供复杂的多细胞生物²生物学的真实再现。这个问题已经开始通过活体显微镜（IVM）的发展来解决已经敞开了大门调查，如神经生物学，免疫学和肿瘤生物学³场关键的生物学问题。迄今为止，大多数基于IVM的研究已经进行了在组织和个体细胞的水平，而不提供关于亚细胞区室的动力学的任何信息。最近，我们的实验室和其他s有开发能力的成像亚细胞结构在活老鼠^{4-7，13-15，}并允许在体内的药理和遗传操作的IVM技术。这种方法已被用于我们研究膜贩运体内 ，更具体内吞作用和胞吐作用调节^6,7。

我们的实验模型系统是基于公开，稳定和麻醉成像啮齿动物的颌下腺唾液腺（SGS）。 SGS集团作为模型器官体外成熟的选择是由于这一事实，即腺体是通过执行一个小手术方便，可以外不影响他们生理和稳定，以减少因心跳和呼吸运动伪影。此外，SGS可以选择性基因通过在唾液腺导管^8,9注射病毒性或非病毒为基础的载体操纵。最后，SGS是偏光epith组成的外分泌腺elial细​​胞，从而形成腺泡和导管，肌上皮细胞和基质细胞的复合物的人口。因为....

方案

第1部分:显微镜及成像设置的制备

1. 任何倒置共聚焦显微镜应适合于IVM。在此研究中在Olympus IX81倒置显微镜，装备有Fluoview-1000激光扫描共聚焦单元被使用。为了达到最佳的分辨率，使用高NA的目标，如浸水UPLSAPO 60x/1.20 NA和油浸计划载脂蛋白60x/1.42 NA建议。油浸目标具有较高的收集效率，尽管它们需要使用的组织和目标之间的盖玻片，它们提供了更好的成像质量内从表面15至20微米的用于图像的区域时。另外，使用的油消除了在更长的成像会为水蒸发的关注。为了保持该温度和湿度，在显微镜应完全封闭并用温水和加湿的空气供给。可选地，动物，显微镜载物台，并且目标必须通过其他方法来加热。例如，化学热垫可以用于动物和阶段，以及专门设计的目标加热器可用于该目的（ 图1A）。客观加热器应在启动程序前的30分钟进行切换。注意:当热垫是使用以保持动物温热纱布具有放置在垫与皮肤之间。对皮肤有烧伤进行监控。
2. 在大多数市售的共焦显微镜的标准级具有用于插入用来容纳滑动，培养皿，并且不同尺寸的板的各种人的开口。为了进行体外成熟，标准的载物台插入35毫米培养皿上下颠倒，覆盖40毫米的玻璃幻灯片，然后在高真空硅脂或胶带（ 图1A）作抵押。自定义插件，也可以由3毫米厚的铝板制造。玻璃表面则cleaned用70％乙醇和刷用的Kimwipe。
3. 制作一个定制的持有人了SGS固​​定（稳定剂）。持有人的目的是为了稳定到位....

结果

在GFP / mTomato鼠标，腺泡显示为明显不同的结构，这表示细胞内GFP和膜定位的串联番茄肽（ 图2中 ，虚线）。在个别腺泡，腺泡细胞通过上述串联番茄肽划定。 GFP是在清晰可见的腺泡细胞内（ 图2中，箭头）的细胞核也检测到。胞质GFP被排除出现约1-1.5微米，直径为暗圆形小泡（ 图2，小图，箭头）的分泌颗粒。为了形象化胞吐的事件，我们专注于富含分泌颗粒质膜的一个区域（ 图3，星号）。皮下注射0.1毫克/千克异丙肾上腺素后，我们观察到增加的GFP荧光的周围的一些分泌颗粒是在靠近质膜（ 图3，绿色箭头）的水平。为previously显示，这些颗粒融合与细胞膜，并聘请厚的肌动蛋白网状结构，保留细胞质绿色荧光蛋白^6。此外，融合与质膜后，上述串联番茄肽扩散进入分泌颗粒（ 图3，红色箭头）的限制性膜。后30〜40秒的分泌颗粒逐渐塌陷和其限制性膜被集成到根尖质膜。

讨论

到目前为止，亚细胞结构已经拍摄主要是在体外 （ 如细胞培养）或体外 （ 即器官培养，组织切片，腺泡制剂）模型系统，往往不复述的完整的活组织⁶的特性。在这方面，这里提出的方法是一个重大的突破，因为它使成像的特定膜运输步骤（ 即调节的胞吐作用）的动力在活小鼠。

这个协议代表具有方面来设计用于体内成像的SG或其他器官的在体腔内^10,11,13-15其他程序显著进步。一些我们以前的研究是在大鼠是更有弹性的外科手术，有较大的机关进行，并且相比，小鼠降低心脏速率。虽然，在小鼠的程序是很难成立，它们提供了几个ADVAntages包括用的疾病模型，转基因和基因敲除动物具有更广谱的可能性。此外，这种方法成功地最小化的运动伪影，提供了更好的控制施加到暴露的器官从而降低风险的压力:ⅰ）降低血流量，ⅱ）损伤的组织架构，以及iii）损害正常功能的器官。这是我们通过消除器官持有人所产生的约束，并引入稳定剂^10,11解决的一个重大问题。 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
异氟烷（Forane）	Baxter	101936-40	化学罩下的手柄
氯胺酮（ketaved）	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	储备液 100 mg/ml
甲苯噻嗪（Anased）	Akorn， Decatur	61311-481-10	储备液 100 mg/ml
新霉素/多粘菌素 B	Bausch 和Lomb	24208-785-55	用于润滑小鼠的眼睛
Carbomer-940	Ashalnd， Inc.	4607-1
D-山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876
三乙醇胺	Sigma-Aldrich	90279	逐滴添加以防止溶液凝固
异丙甾醇	Sigma-Aldrich	16504	需要时在盐水中制备新鲜溶液。库存可以储存在 -20 °C
仪器
异氟烷 V 1.9（蒸发器）	Braintree Scientific	190AF
便携式下吸式台，配备 HEPA 过滤器	危险技术	PDDT
加热灯，型号 HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T 温度计	Braintree Scientific	TW2
作剪刀（11.5 厘米直	World Precision Instruments	5003708-12
#7 弯头镊子	World Precision Instruments	14187
微型剪刀	World Precision Instruments	503365
黑色编织丝缝合线 #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
纱布海绵 2 英寸 x 2 英寸	泰科医疗保健	9022
镜头清洁纸	奥林巴斯	CL-TISSUE （M97） AX6476