活体显微成像是一种强大的工具，能够对活体动物中的多种生物学过程进行成像。本文介绍了一种详细的方法，用于对活体小鼠唾液腺中分泌颗粒等亚细胞结构动态进行成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文介绍一种基于共聚焦活体显微技术对活体啮齿类动物亚细胞结构进行成像的方法。以活体小鼠的唾液腺作为模型器官，因其具有多项优势：首先，唾液腺易于暴露，便于光学设备接近，并可有效固定，从而显著减少由心跳和呼吸引起的运动伪影，有利于对微小亚细胞结构进行成像与动态追踪；其次，唾液腺的大部分细胞群体均从器官表面即可触及，使得能够应用共聚焦显微镜——其空间分辨率高于此前用于此类研究的其他成像技术 体内 成像，例如双光子显微镜。最后，唾液腺在药理学和遗传学上均易于操作，因此为在分子水平上研究生物学过程提供了一个强有力的系统。
本研究聚焦于一种用于追踪腺泡细胞中分泌颗粒胞吐动力学以及分泌颗粒在β-肾上腺素能受体刺激后融合的顶膜质膜动态变化的实验方案。具体而言，我们采用了一种转基因小鼠，该小鼠共表达胞质GFP和一种与荧光蛋白tandem-Tomato融合的膜靶向肽。然而，我们用于稳定和成像唾液腺的实验操作可推广至其他小鼠模型，并可与其他标记方法联用。 体内 细胞组分，从而实现对多种亚细胞结构（如内体、溶酶体、线粒体和肌动蛋白细胞骨架）的可视化观察。
引言
在过去的二十年中，活细胞显微技术的出现以及荧光蛋白的应用，推动了人们对几乎所有可想象的细胞过程取得重大突破，从而深化了我们对细胞生物学的理解 1该领域极大地受益于哺乳动物细胞培养的应用，这类培养体系作为模型系统具有极强的实验可操作性。然而，它们通常无法真实反映复杂多细胞生物体的生物学特性。 2这一问题已开始通过活体显微技术（IVM）的发展得到解决，该技术为神经生物学、免疫学和肿瘤生物学等领域的关键生物学问题研究打开了新的窗口。 3到目前为止，大多数基于活体显微成像（IVM）的研究主要在组织和单个细胞水平上进行，未能提供有关亚细胞结构动态变化的任何信息。近期，本实验室及其他研究团队已开发出能够在活体啮齿类动物中对亚细胞结构进行成像的IVM技术。 4-7, 13-15 并允许进行药理学和遗传学操作 体内该方法已被我们用于研究膜运输 体内，更具体地说，是内吞作用和调节性外排作用 6,7.
我们的实验模型系统基于暴露、固定并成像麻醉状态下啮齿类动物的下颌下唾液腺（SGs）。选择SGs作为体内显微成像（IVM）的模型器官，是因为通过实施简单的外科手术即可轻松获取这些腺体，且能够将其外置而不影响其生理功能，同时可通过固定减少由心跳和呼吸引起的运动伪影。此外，可通过唾液导管注射病毒或非病毒载体，从而对SGs进行选择性的遗传操作8,9
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
第一部分：显微镜及成像装置的准备
- 任何倒置共聚焦显微镜均适用于活体显微成像（IVM）。本研究中使用的是配备Fluoview-1000激光扫描共聚焦单元的Olympus IX81倒置显微镜。为获得最佳分辨率，建议使用高数值孔径（NA）物镜，例如水浸式UPLSAPO 60x/1.20 NA和油浸式Plan-Apo 60x/1.42 NA。油浸物镜具有更高的光收集效率，尽管需要在组织与物镜之间使用盖玻片，但在成像深度位于表面下15–20 μm范围内时可提供更优的成像质量。此外，在长时间成像过程中使用油镜可避免水蒸发问题。为维持温度与湿度，显微镜应完全封闭，并通入温热且加湿的空气；或者通过其他方式对动物、显微镜载物台和物镜进行加热。例如，可使用化学加热垫为动物和载物台保温，使用专用设计的物镜加热器为物镜加热（图1A）。物镜加热器应在实验开始前30分钟开启。注意：当使用加热垫维持动物体温时，需在加热垫与皮肤之间放置纱布，并密切监测皮肤是否出现灼伤。
- 大多数商用共聚焦显微镜的标准载物台均设有开口，用于插入适配不同尺寸载玻片、培养皿和板的各类支架。为进行IVM，将适用于35 mm培养皿的标准载物台插入件倒置，其上覆盖一块40 mm玻璃盖片，并用高真空硅脂或遮蔽胶带固定（图1A）。也可使用3 mm厚的铝板定制加工此类插入件。随后用70%乙醇清洁玻璃表面，并用Kimwipe纸擦拭干净。
- 制作用于下颌下腺（SGs）固定的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在GFP/mTomato小鼠中，腺泡呈现为清晰可辨的结构，表达胞质GFP和膜靶向的串联-Tomato肽（图2，虚线）。在单个腺泡中，腺泡细胞由串联-Tomato肽界定。在腺泡细胞内部，细胞核中也可检测到GFP，且细胞核清晰可见（图2，箭头）。分泌颗粒中不含胞质GFP，这些分泌颗粒表现为直径约1-1.5 μm的暗色圆形囊泡（图2，插图，箭头尖）。为了观察胞吐事件，我们聚焦于富含分泌颗粒的质膜区域（图3，星号）。皮下注射0.1 mg/kg异丙肾上腺素后，我们观察到靠近质膜的一些分泌颗粒周围GFP荧光水平升高（图3，绿色箭头）。如先前研究所示，这些颗粒已与质膜融合，并募集了致密的肌动蛋白网状结构，从而保留了胞质GFP6。此外，在与质膜融合后，串联-Tomato肽扩散至分泌颗粒的限界膜中（图3，红色箭头）。30-40秒后，分泌颗粒逐渐塌陷，其限界膜整合入顶端质膜。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
到目前为止，亚细胞结构的成像主要在 体外 (即 细胞培养）或在 离体 (即 器官培养、组织切片、腺泡制备等模型系统通常无法再现完整活体组织的特征 6在这方面，本文所介绍的方法代表了一项重大突破，因为它能够对特定膜运输步骤的动态过程进行成像即 在活体小鼠中进行的调控性胞吐作用
该方案相较于其他设计用于相同目的的程序，代表了重要的进步 体内 体内腔中应激颗粒或其他器官的成像 10,11,13-15在我们之前的一些研究中，实验是在大鼠身上进行的，因为与小鼠相比，大鼠对手术操作的耐受性更强，器官更大，心率更低。尽管在小鼠中建立实验操作更为困难，但其具有多项优势，包括可使用更广泛的疾病模型、转基因动物和基因敲除动物。此外，该方法成功减少了运动伪影，更好地控制了施加在暴露器官上的压力，从而降低了以下风险：i）减少血流，ii）损伤组织结构，iii）损害器官的正常功能。这一关键问题通过消除器官固定装置所产生的约束并引入稳定器而得以解决。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家牙科与颅面研究所的院内研究项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 异氟烷（Forane） | Baxter | 101936-40 | 在化学通风橱中操作 |
| 氯胺酮（Ketaved） | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | 储存液浓度为 100 mg/ml |
| 赛拉嗪（Xylazine, Anased） | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | 储存液浓度为 100 mg/ml |
| 新霉素/多粘菌素B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | 用于润滑小鼠眼睛 |
| 卡波姆-940 | Ashland, Inc. | 4607-1 | |
| D-山梨醇 | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| 三乙醇胺 | Sigma-Aldrich | 90279 | 逐滴加入，防止溶液凝固 |
| 异丙肾上腺素 | Sigma-Aldrich | 16504 | 根据需要以生理盐水新鲜配制；储存液可保存于 -20 °C |
| 仪器 | |||
| 异氟烷 V 1.9（蒸发器） | Braintree Scientific | 190AF | |
| 配备高效微粒空气（HEPA）过滤器的便携式下排风工作台 | Hazard Technology | PDDT | |
| 热灯，型号 HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T 温度计 | Braintree Scientific | TW2 | |
| 手术剪（11.5 cm 直头） | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 弯头镊 | World Precision Instruments | 14187 | |
| 显微剪 | World Precision Instruments | 503365 | |
| 黑色编织丝线缝合线 #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| 纱布海绵 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| 镜头清洁纸 | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
参考文献
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
