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方法文章

采用解吸电喷雾电离质谱法对生物组织成像

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⸱

DOI：

10.3791/50575

⸱

2013年7月12日

 ,  , 
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

解吸电喷雾电离质谱法（DESI-MS）是一种常温电离方法，可用于对包括生物组织在内的样品进行成像，且样品前处理步骤极少。通过在电离探针下方逐点扫描样品，这种基于喷雾的技术能够提供足够的空间分辨率，以分辨组织切片中感兴趣的分子特征。

摘要

质谱成像（MSI）能够在数百至数十微米尺度上对生物组织进行分析，提供具有最高特异性和空间分辨率的非靶向分子信息。在常温常压条件下进行时，无需样品预处理，从而简化了实验流程，同时保持所获取信息的高质量。解吸电喷雾电离（DESI）是一种基于喷雾的常温质谱成像技术，可在开放空气中直接采样表面，甚至实现活体（in vivo）分析。当与软件控制的样品台联用时，样品在DESI电离探针下方进行光栅扫描，通过时间域将质荷比（m/z）信息与化学物质的空间分布相关联。DESI-MSI输出结果的准确性取决于离子源相对于样品表面和质谱仪进样口的方向与位置。本文综述了如何制备用于DESI成像的组织切片，以及直接影响图像质量的其他实验条件。具体而言，我们描述了采用DESI-MSI对大鼠脑组织切片进行成像的实验方案。

引言

基于质谱的非靶向成像有助于获取化学信息，适用于发现性研究和假设生成类应用。另一方面，对已知目标化学物质进行靶向成像，则可通过特定的方法开发提高检测的灵敏度和选择性。质谱成像（MSI）最常用于组织样本分析，主要采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）1、二次离子质谱（SIMS）2以及常压电离技术，包括解吸电喷雾电离（DESI）3、激光烧蚀-电喷雾电离（LAESI）4,5和液体微液接-表面采样探针（LMJ-SSP）6。在MALDI和SIMS中，样品必须从原始标本上物理剥离，并且需要平整且薄，因为其分析过程需在高真空条件下进行。MALDI需要在样品表面涂覆吸收辐射的基质，这为样品制备增加了额外且繁琐的步骤。SIMS具有最高的横向分辨率，但高能粒子轰击会导致分子发生严重碎裂。因此，常压电离方法填补了对软电离和最小化样品前处理需求的应用空白。然而，迄今为止，所有这些方法仍受限于对样品表面平整度的要求。

解吸电喷雾电离（DESI）利用气流辅助的带电溶剂喷雾照射样品表面，使分析物解吸并离子化7。目前公认的DESI解吸及后续离子化作用的工作模型称为“液滴拾取模型”8-10。DESI探针产生的带电初级液滴撞击样品表面，润湿表面并形成一层薄膜，分析物通过固-液微萃取机制溶解于该薄膜中8。后续液滴的撞击导致动量传递，并使含有从表面萃取物质的次级液滴脱离表面9,10。最终，气相离子被认为通过类似电喷雾电离（ESI）的过程生成，可能遵循离子蒸发模型、电荷残留模型或其他模型11，但DESI中离子形成的确切机制尚未通过实验完全证实12。DESI的灵敏度在很大程度上取决于分析物在喷雾溶剂中的溶解度，因为解吸过程依赖于局部微萃取作用13。

当与软件控制的样品台联用时，样品在DESI电离探针下方进行单向扫描并逐行步进，通过时间域将质荷比（m/z）信息与化学物质的空间分布相关联（图1）。自2006年Van Berkel和Kertesz首次报道DESI-MSI原理性验证实验以来14，该技术已取得显著发展15，已有应用报道涉及脂质分析3,16、药物代谢物17,18、疾病生物标志物19、脑组织3,18,20、肺组织18、肾组织18、睾丸组织18、肾上腺17、薄层色谱板21以及藻类表面22。DESI-MSI获得图像的常规分辨率为100–200 μm，主要由喷雾所提取的有效表面积决定，但已有低至40 μm分辨率的报道23–25。该分辨率水平及操作简便性使DESI-MSI适用于表面积在0.5–5 cm2范围内的生物组织样本的快速、简单分析，从而获取有价值的空间信息，以更深入理解生物学过程26。本文以大鼠脑组织中脂质成像这一典型DESI-MSI应用为例，回顾成功实施此类实验的具体操作步骤。本方案中最关键的两个步骤为组织制备27和DESI离子源优化，如下所述。

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方案

1. 组织切片

  1. 将闪冻的完整组织置于 -80 °C 冰箱中保存，直至进行切片。
  2. 将组织样本置于冷冻切片机中，待其温度平衡后再进行切片（30 分钟）。设置刀片和样本温度为 -30 °C。
  3. 待组织达到相应温度后，用镊子夹取样本，根据所需研究的脑区，切取脑组织的前部或后部，以获得足够的包埋表面即 如果大脑前部为主要关注区域，应将大脑后部固定在卡盘上。
    1. 在样本夹中心处加入约0.5 ml的包埋剂（OCT，Tissue-Tek，Sakura），用镊子夹持样本固定于OCT中，直至其完全凝固。待OCT完全冻结后，将样本夹安装至样品架中。
    2. 建议使用极少量的OCT包埋样本（与常规组织学方法中将样本包埋于OCT块中的做法不同），以尽量减少样本污染。OCT对样本的污染会因离子抑制而对解吸电喷雾电离（DESI）及成像过程产生不利影响。
  4. 用于质谱成像的典型组织切片厚度范围为12–18 μm。在推荐范围内将组织切片至所需厚度。通过将室温载玻片轻轻接触切片，使切片组织贴附于载玻片上。样品固定后，应避免触碰组织切片区域，以免改变其化学物质分布与组成。

注意：建议每张载玻片上放置两个切片，其中一个用于优化，另一个用于成像。如果切片不立即进行成像，应将载玻片置于装有切片盒的-80 °C冰箱中保存，直至准备分析。

  1. 若分析保存的切片，从冰箱中取出载玻片后立即转移至真空干燥器中，静置约15–20分钟使其解冻。在干燥器中放置时间过长会导致样本干燥，降低解吸电喷雾电离（DESI）效率。DESI离子源的优化将在组织样本解冻后进行；然而，为节省时间，可利用样本解冻期间同步启动仪器初始化。
    1. 使用含1%乙酸的乙腈作为DESI溶剂，开启注射泵，流速设为5 μl/min。较低的流速可减小DESI喷雾的撞击斑点尺寸和有效像素大小，但为获得足够的灵敏度，可能需要较高的流速。因此，流速（通常为1–5 μl/min）应根据具体应用所需的灵敏度和分辨率进行优化。确保注射器内溶剂量足以完成整个优化过程和成像分析。
    2. 当观察到溶剂开始从离子源尖端滴出时，开启氮气雾化气体，压力设为160 psi。
    3. 开启连接离子源的高压电源，施加3,600 V电压。
  2. 将载玻片安装至移动载物台上，开始离子源和质谱（MS）参数优化

2. DESI 优化

  1. DESI 系统由一个源探针（见图2）、注射器和泵或替代的溶剂输送系统、压缩氮气、样品平移台及支架组成。在质谱仪已针对目标质量范围和待测分析物完成调谐后，再进行 DESI 源的优化。
    1. 如果尚未开启源组件，请参考第 1.5.1–3 节的操作说明。
    2. 本节讨论的参数适用于生物组织成像。然而，这些参数应根据不同类型的组织或样品进行优化。已有文献报道了用于生物组织成像的其他溶剂、流速、雾化气体压力和电压16-18。
  2. 确保 DESI 源初始状态下不接触载玻片，且未对准组织切片的任何部分。这可以避免探针在初始优化过程中受损，并防止因接触组织样品而污染系统任何部件。
    1. 一个良好的起始位置是：探针尖端距离样品表面 3 mm，距离质谱仪毛细管入口 5 mm，探针与样品表面成 55° 角。DESI 探针的内毛细管应比外毛细管延伸约 1 mm。所有这些参数均需进一步优化。
  3. 质谱仪接口毛细管相对于样品表面应具有约 15° 的收集角度，以实现离子的最佳传输。调节样品台高度，使质谱仪毛细管悬于样品表面上方；毛细管应距离表面 <1 mm，在不接触的前提下尽可能接近。
  4. 将 DESI 探针在 x 方向上与质谱仪毛细管入口对齐，使其处于同一直线上。
  5. 使用额外的组织切片调整 DESI 源的 y 和 z 位置以获得最佳灵敏度。需注意，当 DESI 探针对准某一区域时，最终会解吸并离子化该区域内的所有分析物，导致信号逐渐减弱。因此，应尽快完成此步骤。
    1. 因此，在整个优化过程中，需要在喷雾头下方移动样品，以确保分析的是新鲜样品区域，并保证信号变化源于源参数的优化而非样品耗尽。然而，考虑到组织不同区域化学组成的差异，在整个组织切片范围内直接比较离子强度并不完全准确。脑部丘脑区域具有相对较大的面积且化学组成较为一致，但仍非完全均一。另一种选择是在远离样品的载玻片上用红色记号笔（Sharpie）做标记，其染料为罗丹明 6G（[M]+，m/z 443），该标记可通过 DESI 产生强烈的质谱响应，也可用于优化；但由于样品形态和分析物不同，这些条件可能仍无法完全对应于生物组织的最佳设置。
    2. 建议源探针尖端与毛细管入口之间的 y 方向间距为 ~4 mm，尖端与样品表面之间的 z 方向间距为 ~1.5 mm。不过，这些参数在不同实验装置中会略有差异。
    3. 考虑到探针的几何形状和角度，应注意 y 和 z 方向的位置相互关联，共同影响溶剂及含分析物液滴的有效传输。改变其中一个变量时，通常需要相应调整另一个变量，以保持相同的喷雾撞击位置及其传输角度。
  6. 调整源探针内毛细管相对于外毛细管的伸出距离，以实现最大灵敏度和最小撞击斑点尺寸。注意：进行此调整时，必须确保高压已关闭。
  7. 当观察到信号最强时，可认为源的几何构型已达到最优。
    1. 第 2.5–2.6 节中优化的变量相互关联，因此调整其中一个变量将不可避免地需要重新调整其他变量，以维持必要的源-样品-入口几何关系，或需重新调整第 1.5.1–3 节中讨论的条件。
  8. 此外，在通往质谱仪的传输毛细管周围加装加热元件，可通过促进电离过程中产生的带电分析物液滴的脱溶剂作用来提高灵敏度。本实验中，我们使用缠绕在传输毛细管上的绳状加热器，设定温度为 100 °C。

3. 组织成像

  1. 在成像过程中，样品台带动样品在 DESI 探针和质谱进样毛细管下方移动，其余所有组件保持静止。样品台的运动参数应根据 DESI 冲击羽流尺寸和最佳灵敏度进行选择。
    1. 较大的冲击羽流将导致更高的离子强度，因为更多的样品被解吸；然而在成像过程中，这也会导致更大的像素尺寸，从而降低图像分辨率。
  2. 本实验中使用的平移台为自行搭建，由 LabView 程序控制，可调节给定尺寸图像的光栅扫描速度和行间距。本实验所用的样品台运动控制 VI 程序可在 omnispect.bme.gatech.edu 获取。或者，也可使用商业化的 DESI 源和样品台，例如 Prosolia Inc.（美国印第安纳州印第安纳波利斯）生产的 2D 自动 Omni Spray 源。
    1. 对于脑组织，典型的成像尺寸为 10 × 15 mm，根据所用样品台运动参数，成像过程大约需要 3 小时。
      1. 使用 LabView VI 或等效控制软件设置所需的成像条件，设定样品台扫描速度为 80 μm/sec，行间距为 200 μm。当使用 Omni Spray 源时，应将运动参数设置为扫描速度 100–200 μm/sec，行间距 200 μm。需注意，这些运动参数可根据每个维度所需的像素数量和必要的灵敏度进行调整。
        1. 研究表明，较小的行间距可提高图像质量，而扫描速度的影响相对较小。25 然而必须强调的是，这并不一定意味着图像分辨率的提升，因为分辨率主要取决于冲击斑点尺寸。较慢的扫描速度和更小的行间距将显著延长分析时间，因此必须针对每种类型的组织或样品进行优化。
      2. 当质谱采集设置为每秒 1 次扫描，且图像以每扫描生成 1 个像素的方式构建时，样品台速度决定了 x 方向的像素尺寸，而行间距决定了 y 方向的像素尺寸。尽管由于喷雾扩散，图像的实际像素尺寸大于上述数值，但较慢的运动速度可为分析物的解吸和检测提供更充分的时间。
    2. 在 LabView VI 中指定成像过程中用于记录位置和时间文件的目录路径及文件名。
  3. 在开始质谱数据采集前，计算成像所需的总时间。我们课题组使用的 LabView 程序会自动提供该数值；但如果使用其他样品台控制系统，则必须进行此计算，以便设置质谱仪的数据采集参数。
    1. 当使用 Omni Spray 自动化源和样品台时，图像的每一行作为独立运行进行采集。通过 Omni Spray 控制软件计算每行所需时间及给定成像尺寸所需的行数，并输入至质谱仪软件中。
  4. 确保质谱仪扫描速度为每秒 1 张谱图，并将仪器采集时间设置为与计算所得的总时间一致。
    1. 将谱图扫描速度设为每秒 1 张谱图。
    2. 以 PROFILE 模式采集数据，并确保 m/z 范围适用于目标物种。请注意，与电喷雾电离（ESI）类似，DESI 也会产生多电荷分析物。
    3. 将采集时间设置为与 LabView 提供的总成像时间相匹配。
  5. 将喷雾冲击点定位在待成像区域的左上角。
  6. 同时启动质谱数据采集和样品台运动。
  7. 数据采集完成后，将质谱仪恢复至 STANDBY 模式。
  8. 关闭 DESI 源的高压电源。
  9. 关闭氮气气源。
  10. 关闭注射泵。

4. 图像处理

  1. 质谱数据必须与通过 LabView 保存为文本文件的阶段时间和位置数据“折叠”成二维图像，以关联像素坐标与相应的质谱。本文所示图像使用基于 Matlab 的软件进行处理，该软件可免费获取，网址为：omnispect.bme.gatech.edu。如果使用 Omni Spray 源采集数据，则需使用 Firefly 数据转换软件在 BioMAP 中创建用于图像可视化的数据立方体（www.maldi-msi.org）。
  2. 对于在 Jeol AccuTOF 质谱仪上采集的数据，记录的色谱图必须以 .cdf 格式导出，以便进一步分析。
    1. 在 MassCenter 的 DataManager 中，首先将采集的数据转换为质心数据（工具 → 将采集数据转换为质心数据），然后使用键盘组合 Ctrl+Shift+E 并选择工具 → 导出，将数据以 .cdf 格式导出。
  3. 将原始 .cdf 质谱数据以及位置和时间两个文本文件上传至 OmniSpect 网站。经 Firefly 处理的成像数据可在 BioMAP 中进行可视化。
    1. 可在网站上直接对数据进行进一步处理，包括使用非负矩阵分解法进行统计分析，或绘制特定离子的分布图。
    2. 或者，也可导出原始数据立方体，用于在 Matlab 中进行分析。

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结果

图3展示了一张从未处理的大鼠脑切片获得的代表性质谱图。在正离子模式下，由于磷脂酰胆碱具有较高的电离效率（归因于其带正电荷的季铵盐基团），质谱图中主要信号来自磷脂酰胆碱。组织切片的总离子流图也显示在图3中，可见整个脑切片区域均存在丰富的信号。通过与文献对比，关键检测到的脂质已在表1中标识。

示例脂质的空间分布（图4）展示了不同磷脂酰胆碱分子在脑灰质与白质之间的相对丰度差异。例如，[PC 34:1 + K]+（m/z 798.5364）在小脑皮层（灰质）中信号强度较高，而[PC 36:1 + K]+（m/z 826.5558）则在小脑脚（白质）中信号更强。图4c所示的两种离子复合图像突出了脂质在组织切片中分布的对比性。其他脑内关键脂质的空间分布也列于表1中。这些分布结果与以往研究一致。28-30

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讨论

DESI 源几何结构的优化对于成功的质谱成像实验至关重要。影响系统对准的多个变量直接影响灵敏度和图像分辨率。如果在优化过程中实验者难以获得信号，我们建议使用在载玻片上绘制的红色记号笔斑点作为基准；该染料罗丹明6G（m/z 443）在正离子模式下可产生强信号，可用于初始优化。此外，DESI 中溶剂的选择对灵敏度至关重要，因为分析物的传输和电离依赖于分析物从表面被萃取到所形成液膜中的过程。13 根据分析过程中目标化合物的类别，可选用多种适用于电喷雾电离的溶剂及其混合物，以促进去溶剂化和电离过程。

如前所述，解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）成像的分辨率主要取决于离子源的几何结构。DESI-MSI通常可获得约200 μm量级的分辨率，尽管该值高于基于激光和/或真空环境下的成像方法，后者的分辨率范围约为10–150 μm。5,31 已有报道使用DESI实现高达40 μm的分辨率，24 然而，对于大尺寸生物组织切片的常规成像分析，200 μm的分辨率已足够。DESI离子源内部熔融石英毛细管的质量也会影响成像质量和分辨率。...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国复苏与再投资法案（ARRA）国家科学基金会（NSF）MRI仪器开发项目资助，项目编号#0923179，授予FMF。我们感谢帕克·H·佩蒂生物工程与生物科学研究所组织学核心实验室协调员Aqua Asberry在组织切片方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
Tissue-Tek O.C.T. 化合物Sakura-Finetek4583http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&&subcat=48
乙腈EMDAX0156-6OmniSolv，LC-MS 级
乙酸Sigma Aldrich695092-500 ml
<强>仪器设备
冷冻切片机赛默飞世尔科技CryoStar* NX70任何可用的切片机均可用于组织切片 http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&&groupType=PRODUCT&&searchType=0&storeId=11152&与搜索相关&&ca=cryostar
Omni Spray®DESI 喷雾头Prosolia Inc.也可使用 2-D Omni Spray® 使用成像实验试剂盒而非自行组装实验组件 http://www.prosolia.com/sources.php
高压电源斯坦福研究系统公司PS350/5000V-25Whttp://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
绳式加热器，RTD，控制器Omegahttp://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&加热器
Labview国家仪器公司版本 7.1
平移台Prior ScientificOptiscan IIhttp://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF 质谱仪JEOLJMS-T100LC可使用配备延长毛细管常压接口的任意质谱仪

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 2/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

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Rachel V. Bennet

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