方法文章

采用解吸电喷雾电离质谱法对生物组织成像

DOI：

10.3791/50575

⸱

2013年7月12日

 ,  , 
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

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摘要

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解吸电喷雾电离质谱法（DESI-MS）是一种常温电离方法，可用于对包括生物组织在内的样品进行成像，且样品前处理步骤极少。通过在电离探针下方逐点扫描样品，这种基于喷雾的技术能够提供足够的空间分辨率，以分辨组织切片中感兴趣的分子特征。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

质谱成像（MSI）能够在数百至数十微米尺度上对生物组织进行分析，提供具有最高特异性和空间分辨率的非靶向分子信息。在常温常压条件下进行时，无需样品预处理，从而简化了实验流程，同时保持所获取信息的高质量。解吸电喷雾电离（DESI）是一种基于喷雾的常温质谱成像技术，可在开放空气中直接采样表面，甚至实现活体（in vivo）分析。当与软件控制的样品台联用时，样品在DESI电离探针下方进行光栅扫描，通过时间域将质荷比（m/z）信息与化学物质的空间分布相关联。DESI-MSI输出结果的准确性取决于离子源相对于样品表面和质谱仪进样口的方向与位置。本文综述了如何制备用于DESI成像的组织切片，以及直接影响图像质量的其他实验条件。具体而言，我们描述了采用DESI-MSI对大鼠脑组织切片进行成像的实验方案。

引言

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基于质谱的非靶向成像有助于获取化学信息，适用于发现性研究和假设生成类应用。另一方面，对已知目标化学物质进行靶向成像，则可通过特定的方法开发提高检测的灵敏度和选择性。质谱成像（MSI）最常用于组织样本分析，主要采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）1、二次离子质谱（SIMS）2以及常压电离技术，包括解吸电喷雾电离（DESI）3、激光烧蚀-电喷雾电离（LAESI）4,5和液体微液接-表面采样探针（LMJ-SSP）6。在MALDI和SIMS中，样品必须从原始标本上物理剥离，并且需要平整且薄，因为其分析过程需在高真空条件下进行。MALDI需要在样品表面涂覆吸收辐射的基质，这为样品制备增加了额外且繁琐的步骤。SIMS具有最高的横向分辨率，但高能粒子轰击会导致分子发生严重碎裂。因此，常压电离方法填补了对软电离和最小化样品前处理需求的应用空白。然而，迄今为止，所有这些方法仍受限于对样品表面平整度的要求。

解吸电喷雾电离（DESI）利用气流辅助的带电溶剂喷雾照射样品表面，使分析物解吸并离子化7。目前公认的DESI解吸及后续离子化作用的工作模型称为“液滴拾取模型”8-10。DESI探针产生的带电初级液滴撞击样品表面，润湿表面并形成一层薄膜，分析物通过固-液微萃取机制溶解于该薄膜中8。后续液滴的撞击导致动量传递，并使含....

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方案

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1. 组织切片

  1. 将闪冻的完整组织置于 -80 °C 冰箱中保存，直至进行切片。
  2. 将组织样本置于冷冻切片机中，待其温度平衡后再进行切片（30 分钟）。设置刀片和样本温度为 -30 °C。
  3. 待组织达到相应温度后，用镊子夹取样本，根据所需研究的脑区，切取脑组织的前部或后部，以获得足够的包埋表面即 如果大脑前部为主要关注区域，应将大脑后部固定在卡盘上。
    1. 在样本夹中心处加入约0.5 ml的包埋剂（OCT，Tissue-Tek，Sakura），用镊子夹持样本固定于OCT中，直至其完全凝固。待OCT完全冻结后，将样本夹安装至样品架中。
    2. 建议使用极少量的OCT包埋样本（与常规组织学方法中将样本包埋于OCT块中的做法不同），以尽量减少样本污染。OCT对样本的污染会因离子抑制而对解吸电喷雾电离（DESI）及成像过程产生不利影响。
  4. 用于质谱成像的典型组织切片厚度范围为12–18 μm。在推荐范围内将组织切片至所需厚度。通过将室温载玻片轻轻接触切片，使切片组织贴附于载玻片上。样品固定后，应避免触碰组织切片区域，以免改变其化学物质分布与组成。

注意：建议每张载玻片上放置两个切片，其中一个用于优化，另一个用于成像。如果切片不立即进行成像，应将载玻片置于装有切片盒的-80 °C冰箱中保存，直至准备分析。

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结果

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图3展示了一张从未处理的大鼠脑切片获得的代表性质谱图。在正离子模式下，质谱图中主要成分为磷脂酰胆碱，这是由于其较高的电离效率（归因于带正电荷的季铵基团）。组织切片的总离子流图也显示在图3中，表明在整个脑切片范围内均有丰富的信号。通过与文献比较，关键检测到的脂质已在表1中予以鉴定。

示例脂质的空间分布（图4）展示了不同磷脂酰胆碱分子在脑灰质与白质之间相对丰度的差异。例如，[PC 34:1 + K]+（m/z 798.5364）在小脑皮层（灰质）中信号强度较高，而[PC 36:1 + K]+（m/z 826.5558）则在小脑脚（白质）中信号更强。图4c所示的两种离子复合图像突出了脂质在组织切片中分布的对比性。其他脑内关键脂质的空间分布也列于表1中。这些分布结果与以往研究一致。28-30

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讨论

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DESI 源几何结构的优化对于成功的质谱成像实验至关重要。影响系统对准的多个变量直接影响灵敏度和图像分辨率。如果在优化过程中实验者难以获得信号，我们建议使用在载玻片上绘制的红色记号笔斑点作为基准；该染料罗丹明6G（m/z 443）在正离子模式下可产生强信号，可用于初始优化。此外，DESI 中溶剂的选择对灵敏度至关重要，因为分析物的传输和电离依赖于分析物从表面被萃取到所形成液膜中的过程。13 根据分析过程中目标化合物的类别，可选用多种适用于电喷雾电离的溶剂及其混合物，以促进去溶剂化和电离过程。

如前所述，解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）成像的分辨率主要取决于离子源的几何结构。DESI-MSI通常可获得约200 μm量级的分辨率，尽管该值高于基于激光和/或真空环境下的成像方法，后者的分辨率范围约为10–150 μm。5,31 已有报道使用DESI实现高达40 μm的分辨率，24 然而，对于大尺寸生物组织切片的常规成像分析，200 μm的分辨率已足够。DESI离子源内部熔融石英毛细管的质量也会影响成像质量和分辨率。.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

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本工作由美国复苏与再投资法案（ARRA）国家科学基金会（NSF）MRI仪器开发项目资助，项目编号#0923179，授予FMF。我们感谢帕克·H·佩蒂生物工程与生物科学研究所组织学核心实验室协调员Aqua Asberry在组织切片方面的协助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
Tissue-Tek O.C.T. 化合物Sakura-Finetek4583http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&&subcat=48
乙腈EMDAX0156-6OmniSolv，LC-MS 级
乙酸Sigma Aldrich695092-500 ml
<强>仪器设备
冷冻切片机赛默飞世尔科技CryoStar* NX70任何可用的切片机均可用于组织切片 http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&&groupType=PRODUCT&&searchType=0&storeId=11152&与搜索相关&&ca=cryostar
Omni Spray®DESI 喷雾头Prosolia Inc.也可使用 2-D Omni Spray® 使用成像实验试剂盒而非自行组装实验组件 http://www.prosolia.com/sources.php
高压电源斯坦福研究系统公司PS350/5000V-25Whttp://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
绳式加热器，RTD，控制器Omegahttp://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&加热器
Labview国家仪器公司版本 7.1
平移台Prior ScientificOptiscan IIhttp://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF 质谱仪JEOLJMS-T100LC可使用配备延长毛细管常压接口的任意质谱仪

参考文献

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  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (....

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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勘误

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Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 2/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

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