我们描述了一种利用直接标记的荧光探针，通过三维DNA荧光原位杂交（3D DNA FISH）分析细胞核结构的稳健且多功能的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
3D DNA FISH 已成为分析细胞核三维结构的主要工具，该技术已有多种变异方法发表。本文描述了一种经过优化的实验方案，具有较强的稳健性、良好的可重复性且易于操作。通过使用氨基烯丙基-dUTP进行切口平移，再经染料化学偶联，可制备出荧光强烈的直接标记探针。3D DNA FISH 实验采用冻融步骤实现细胞通透化，并通过加热步骤同时使探针和核DNA变性。该方案适用于多种细胞类型和各类探针（BACs、质粒、fosmids或全染色体涂染探针），并支持高通量自动成像。利用此方法，我们常规性地研究多达三个染色体区域的细胞核定位。
引言
DNA 荧光原位杂交（DNA FISH）能够在细胞周期的所有阶段实现对单个基因位点、染色体亚结构域甚至整条染色体的三维可视化。2D FISH 用于中期研究，而 3D FISH 已被广泛用于探究基因组空间结构与其在间期功能之间的关系（1,2 及其中参考文献）。传统上，共定位研究通过 FISH 检测数十至数百个独立的基因位点来完成。近年来，基于 3C 的高通量技术（如 4C 和 Hi-C）得到快速发展3，使得数以千计不同位点间的分子互作得以研究。尽管基于 3C 的技术与 DNA FISH 可互为补充，但二者并不一定回答相同的问题。基于 3C 的方法提供的是混合细胞群体的总体信号输出，从而得出共定位的概率；相比之下，基于 FISH 的方法通量较低，却能够根据细胞的发育阶段或细胞周期阶段，在单个细胞中分析位点或染色体的空间排列。因此，FISH 仍将是研究细胞核结构与功能关系的重要工具。
成功进行3D FISH实验主要有两个关键因素：1. 获得标记理想的探针；2. 选择适当的细胞处理方法，包括固定以及杂交前和杂交后的步骤，在尽可能保持细胞核形态的同时，使DNA充分暴露以利于探针杂交。高效的探针标记对FISH至关重要。传统上，缺口平移法（nick-translation）被用于引入带有单倍基团（hapten）或荧光素偶联的核苷酸4。类似地，市面上也有商业化的缺口平移试剂盒，可用于直接掺入单倍基团或荧光素，或通过氨基烯丙基核苷酸（aminoallyl nucleotides）与胺反应性染料进行两步标记。后一种方法由于为DNA聚合酶提供了体积更小的分子，从而提高了染料掺入效率。最近还开发出了非酶法DNA标记试剂盒，利用铂与核酸的配位结合实现标记。FISH探针甚至可以直接购买预标记好的产品5。尽管试剂盒和商业探针无疑使用方便，但其成本远高于自行采购组分并在实验室内部制备探针。我们优化了一种低成本的缺口平移方案，用于在多种颜色中直接标记大量不同的BAC探针。我们发现，获得高纯度的BAC DNA至关重要，使用高纯度模板可将每张FISH载玻片所需的探针量降至10–20 ng，而使用不纯模板DNA时所需探针量则高出10–20倍，从而显著节省了成本和时间。使用氨基烯丙基-dUTP（amino-allyldUTP）可灵活地利用现有的胺反应性染料（例如 Alexa Fluor 或 Cy染料）或单倍基团（例如 生物素、地高辛）对探针进行标记。单倍基团标记的探针可通过荧光素偶联的抗体或链霉亲和素进行检测，以放大并可视化信号。通常，明亮的直接标记探针背景染色较低，且避免了信号过度放大，因而能更准确地反映细胞核内定位及基因座形态。
目前存在多种不同的FISH技术，这些技术使用不同的固定剂、预处理方法以及杂交后洗涤步骤，但总体上可分为以下几类：戊二醛固定结合NaOH变性、甲醛固定结合HCl变性，以及甲醛固定结合加热变性6-9。每种方法都有其优缺点。戊二醛固定能较好地保持细胞核结构，但需要使用还原剂以尽量减少由此产生的自发荧光，同时NaOH处理需严格控制，以在充分变性DNA和避免损伤细胞核结构之间取得平衡6。甲醛固定的强度较弱，可能导致细胞核结构发生一定程度的扰动，但通常可获得更强且更稳定的信号，并具有较低的自发荧光9。HCl处理可使DNA脱嘌呤并去除蛋白质，从而有利于探针充分接触DNA，但也可能引入DNA断裂。加热可物理分离双链DNA，实现良好的靶标杂交和强信号，但可能对细胞核结构造成一定扰动8。这些技术对不同蛋白质表位的影响差异较大6,9，因此在进行免疫FISH实验时，需通过实验确定每种蛋白质所适用的最佳实验方案。
尽管目前尚无“完美”的DNA FISH技术，但只要严格控制，各种方法均可发挥重要作用。我们的目标是优化一种稳定且可重复的DNA FISH实验方案，用于研究多种细胞类型中多个基因座的空间定位10，重点改进加热步骤以获得最可靠的信号。结合自动化成像系统的使用，我们旨在提高单细胞核结构分析的通量。
方案
1. 通过缺口平移法生成直接标记的DNA探针
注意： 使用BAC（100–250 kb）制备的直接标记探针始终可产生明亮的信号。若需要较小的探针，可使用含有40–50 kb插入片段的fosmid，甚至含有5–10 kb插入片段的质粒。利用Ensemble或UCSC基因组浏览器鉴定对应于特定基因的BAC或fosmid克隆。通过反复沉淀法制备高质量的BAC DNA，或使用市售试剂盒。制备物中细菌基因组DNA污染越少，每张载玻片所需的探针量就越少。标记过程分两步进行：首先通过缺口平移法引入氨基烯丙基-dUTP，然后进行胺反应性染料的化学偶联。
1.1. 缺口平移法
在切刻平移过程中，使用DNase I产生单链断裂。DNA聚合酶I延伸这些“切刻”的3'端，用新的核苷酸替换原有的核苷酸，从而“平移”切刻位置，由此实现标记核苷酸的掺入。选择氨基烯丙基-dUTP是因为其能被DNA聚合酶I高效掺入，并且具有后续与胺反应性染料或半抗原进行化学偶联的潜力。关键在于必须在DNase I的切刻作用与DNA聚合酶I的平移作用之间达到适当平衡：DNase I过量会导致DNA过度消化，产生低产量和片段过短；而用量不足则无法产生足够的切刻供聚合酶启动平移，导致片段过大且氨基烯丙基-dUTP掺入效率低下。以下方案通常效果良好，但可能需要根据不同批次或不同厂家的DNase I进行滴定优化。
- 在冰上设置标记反应，并在16℃孵育2小时 °C. 这应产生 0.5-1 μg 经 nick-翻译的 DNA，且可进行放大。将 DNase I 用 DNase I 缓冲液按 1:30 稀释（即 0.3 U/μl)。
| 组分 | 储存液浓度 | 体积或用量 |
| BAC DNA | 5-10 μg | |
| NTB缓冲液 | 10x | 5 μl |
| DTT | 0.1 M | 5 μl |
| dNTP混合物 | 10x | 5 μl |
| 氨基烯丙基-dUTP | 0.5 mM | 6 μl |
| DNA聚合酶I | 10 U/μl | 1 μl |
| DNase I | 10 U/μl | 1 μl（1:30稀释液） |
| H2O | 加至50 μl |
- 取1 μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，以检测标记片段的大小。电泳过程中，将反应体系置于冰上保存。成功的缺口平移反应会产生一条弥散条带，大部分片段大小在150 bp至700 bp之间，部分较大片段约为1 kb（关键步骤：参见代表性结果）。如有需要，可加入1 μl新鲜配制的1:30 DNase I稀释液，并在16 °C下孵育15–30分钟。孵育时间取决于BAC DNA的量和质量。
- 将反应体系在75 °C加热10分钟，以灭活DNase I。
- 使用PCR纯化试剂盒对氨基修饰的DNA进行纯化，用100 μl H2O洗脱。
- 通过加入10 μl 3 M NaOAc（pH 5.2）和275 μl乙醇进行乙醇沉淀。在-20 °C放置至少1小时或过夜。在4 °C下以最大转速离心30分钟。用500 μl 70%乙醇洗涤沉淀，并静置晾干。此步骤可去除会干扰标记反应的微量胺类物质。将沉淀按每1次初始反应体系重悬于6 μl H2O中。
- 取1 μl样品，通过微量紫外分光光度法测定氨基修饰DNA的浓度。
1.2. 荧光染料的偶联
探针的荧光标记通过染料的化学偶联实现。Alexa Fluor 琥珀酰亚胺酯染料与经氨基烯丙基-dUTP修饰的DNA上的氨基发生反应，形成共价键，从而产生直接标记的探针。Alexa Fluor 488、555 和 647 染料在此过程中效果良好。
- 将4 μg氨基烯丙基修饰的DNA调整至5 μl体积，95 °C加热5分钟，冰上快速冷却，加入3 μl 0.2 M NaHCO3。
- 室温下将一份胺反应性染料溶解于2 μl无水DMSO中。加入8 μl含NaHCO3的修饰DNA，涡旋混匀，瞬时离心，避光室温孵育1小时。
注意：根据以下方案，胺反应性染料可用于标记多个探针。由于每张载玻片的标记仅需使用10-20 ng探针，1 μg探针足以用于50-100张载玻片。此外，胺修饰的DNA可在-20 °C下保存，用于后续的标记反应。
| DNA 量 | DNA 体积 | 0.2 M NaHCO3 | 染料体积 | 总量 | 足够用于 |
| 4 × 1 μg | 每份 1.25 μl | 每份 0.75 μl | 每份 0.5 μl | 2.5 μl（1/4） | 每份 50–100 张载玻片 |
| 3 × 1.35 μg | 每份 1.67 μl | 每份 1 μl | 每份 0.67 μl | 3.34 μl（1/3） | 每份 65–130 张载玻片 |
| 2 × 2 μg | 每份 2.5 μl | 每份 1.5 μl | 每份 1 μl | 5 μl（1/2） | 每份 100–200 张载玻片 |
| 1 × 4 μg | 5 μl | 3 μl | 2 μl | 10 μl（完整） | 200–400 张载玻片 |
- 加入 90 μl H2O，并使用 PCR 纯化试剂盒纯化标记探针。用 100 μl 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）洗脱。
- 通过微体积全光谱分光光度法（参见图 2），利用 Beer-Lambert 方程测定探针浓度和标记效率（说明详见 Alexa Fluor 活性染料随附的数据表或可在线获取）。每 100 bp 含有 3–6 个染料分子的探针效果良好。标记程度较低的探针可能导致 FISH 信号微弱。或者，可取 5 μl 样品在不含 DNA 染料的 2% 琼脂糖凝胶上电泳，使用磷屏成像仪检测荧光染料的掺入情况。随后用溴化乙锭或其他 DNA 染色替代物对凝胶进行染色，比较标记 DNA 与总 DNA。
2. DNA FISH
通过以下步骤，将目标细胞固定在载玻片上并进行透化处理。随后，在加热板上同时变性细胞DNA和直接标记的探针，并在避光湿润的孵育盒中过夜杂交。
2.1. 第1天
- 探针沉淀
注意：在第一天的某个时间点进行探针沉淀。此步骤可与细胞处理并行操作，无需在当天开始时即刻完成。- 将10–20 ng直接标记的探针、6 μl C0t-1 DNA（6 μg）、1 μl鲑鱼精单链DNA（9.7 μg）混合，并用水调整体积至100 μl。
- 加入10 μl 3 M NaOAc和275 μl乙醇，涡旋混匀。在-20 °C下沉淀至少1小时。
- 在4 °C下以最大速度离心30分钟。用70%乙醇洗涤沉淀，再次离心。干燥沉淀后，加入5 μl去离子甲酰胺重悬。在37 °C、避光条件下以1000 rpm振荡重悬30分钟（可在恒温混匀仪上覆盖铝箔避光）。
- 加入5 μl硫酸葡聚糖混合液，在37 °C、避光条件下继续振荡10分钟。在滴加至盖玻片前，轻轻吹打混匀。
注意：若需联合染色体涂染与BAC探针，可使用商品化的即用型染色体涂染杂交混合液，操作更为便捷。将已沉淀的BAC探针（含C0t1 DNA和鲑鱼精单链DNA）用移液器反复吹打，重悬于10 μl染色体涂染混合液中。在37 °C、300–500 rpm振荡条件下孵育10分钟。每点使用10 μl染色体涂染液/BAC探针混合液。
- 细胞贴附于载玻片
注意：不同细胞类型在载玻片上的贴附能力差异较大。针对每种细胞类型，需通过实验确定最佳沉降时间和细胞密度。为获得一致结果，细胞应保持单细胞悬液状态。
为便于操作，可用疏水笔在载玻片上圈出细胞点样区域，但对于悬浮于PBS中的细胞，此步骤并非必需。疏水屏障可防止悬液在载玻片上扩散，使每张载玻片上最多三个样本保持清晰分隔，并可在免疫FISH中使用极小体积的抗体溶液。此外，当细胞数量较少时，也可将点样区域控制在最小范围。 - 小鼠胚胎肝脏细胞
- 收集每个E13.5小鼠胚胎肝脏，加入约1.5 ml PBS，通过反复吹打重悬细胞。在微量离心机中以3,000 rpm离心2分钟。重复洗涤三次。最后一次洗涤时，通过70 μm滤网过滤细胞。将一个肝脏的细胞重悬于160 μl PBS中，每点使用50 μl。室温下静置沉降2分钟。
- 小鼠胚胎干细胞（ES细胞）
1. 小鼠ES细胞不易直接贴附于载玻片。可在载玻片上用疏水笔圈出点样区域。将20,000–50,000个细胞悬浮于80–100 μl常规培养基中，滴加至圈内，在湿润培养箱中孵育约3小时使其贴附。注意：也可直接在载玻片上培养ES细胞，但会形成细胞集落，可能影响自动化成像。 - 固定细胞
1. 某些实验需使用无法自行贴附于载玻片的固定细胞。使用细胞离心机在300 rpm下轻柔离心3分钟，可保持细胞三维结构完整，并防止细胞脱落。
| 细胞类型 | 悬浮液 | 沉降时间 | 备注 |
| 小鼠胎肝细胞 | PBS | 2 min | 室温放置 |
| 小鼠胚胎干细胞 | 含补充物的DMEM | 4 hr | 37 °C 湿润培养箱中 |
| 小鼠淋巴细胞 | PBS | 2 min | 室温放置 |
| 小鼠P20生殖细胞 | 固定于溶液中 | 细胞离心涂片 | 室温放置 |
- 固定细胞时，将载玻片轻轻浸入4% PFA中（注意：需在通风橱中操作），持续10分钟。将载玻片平放在托盘中进行固定，以最大程度保留细胞（例如，在移液耗材盒盖中加入50 ml 4% PFA）。注意：此步骤不适用于在贴附至载玻片前已固定的细胞。
在后续所有步骤中，使用 50 ml 或 100 ml 的 Coplin 染色缸。在将载玻片移入或移出染色缸时，注意避免刮落细胞。
- 在室温下用 0.1 M Tris-Cl（pH 7.4）淬灭 10 分钟。
- 在含有 0.1% 皂苷和 0.1% Triton X-100 的 PBS 中于室温透化细胞 10 分钟。
- 在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟，室温进行。
- 在 20% 甘油/PBS 中于室温孵育至少 20 分钟。注意： 此时载玻片可保存在含 50% 甘油的 PBS 中，于 -20 °C 保存至少数周。据观察，保存至少一天可增强信号强度9。继续实验前需在室温下用 20% 甘油/PBS 重新平衡。注意： 此为开始沉淀探针的合适时机（参见 2.1.1）。
- 在液氮中进行三次冻融循环。使用小型杜瓦瓶，一次将一张载玻片浸入液氮中，数秒后听到特征性的爆裂声即取出，置于纸巾上解冻。待不透明的冷冻甘油层消失后再次冷冻。可轮流处理最多 15 张载玻片，完成三次冻融循环。
- 在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟，室温进行。
- 在 0.1 M HCl 中室温孵育 30 分钟。
- 在 PBS 中洗涤 5 分钟，室温进行。
- 在含 0.5% 皂苷、0.5% Triton X-100 的 PBS 中于室温透化 30 分钟。
- 在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟，室温进行。
- 在 50% 甲酰胺/2x SSC 中于室温平衡至少 10 分钟。
- 将探针用移液器加至盖玻片上。从容器中取出载玻片，用纸巾轻轻吸干细胞区域周围的多余液体。由于甲酰胺挥发迅速，需注意避免细胞干燥。对于具有两个或三个细胞区域的载玻片，将 10 μl 探针按位置对应加至 22 mm × 50 mm 的盖玻片上。将盖玻片倒置覆盖在载玻片的细胞区域上。用橡胶胶水密封，并使其完全干燥。后续所有步骤均需避光。
- 将载玻片置于加热板上精确加热至 78 °C，持续 2 分钟（例如 使用倒置加热块，关键步骤：参见讨论部分）。在加热板上覆盖遮光物（如纸板箱等），以在变性过程中避光。
- 在避光、湿润的密闭容器中 37 °C 过夜孵育。为保持湿度，可在避光盒内放置浸湿的纸巾。
2.2 第2天
- 准备好装有适当温度溶液的考林瓶，用于后续洗涤步骤。在所有后续操作中应尽可能避免光照。咖啡罐可作为考林瓶良好的避光盖。
- 剥去橡胶胶水，将载玻片放入2x SSC溶液中，直至盖玻片松动并脱落。
- 在45 °C条件下，用50%甲酰胺/2x SSC溶液洗涤15分钟。将水浴锅盖上盖子以避光。
- 在63 °C条件下，用0.2x SSC溶液洗涤15分钟。
- 在45 °C条件下，用2x SSC溶液洗涤5分钟。
- 在室温下，用2x SSC溶液洗涤5分钟。
- 在室温下，用PBS溶液洗涤5分钟。
- 在室温下，将载玻片置于含DAPI（5 μg/ml溶于2x SSC）的考林瓶中染色2分钟。
注意：DAPI 溶液可在 4 °C 避光保存 2 个月。
- 在室温下用 PBS 脱色 5 分钟。
- 为盖玻片封片，将封片剂滴加到盖玻片上。每个细胞区域使用 10 μl，单个区域使用 22 mm × 22 mm 的盖玻片，两个至三个区域使用 22 mm × 50 mm 的盖玻片。尽可能吸干细胞区域周围的 PBS，但注意不要使细胞干燥。将盖玻片倒置覆于载玻片上，并用指甲油封固。
结果
本文所述方案（概览见图1）已成功用于将DNA FISH与高通量图像采集相结合，以分析基因组结构。高质量探针的制备对实验成功至关重要（见讨论部分）。图2展示了FISH探针的两个重要质量控制步骤。缺口平移反应后，应可见DNA弥散条带，大部分片段大小介于150至700 bp之间（图2A）。化学偶联后，可通过光谱分析检测荧光染料在探针中的掺入情况（图2B）。
使用优质探针时，遵循DNA FISH实验方案通常可获得背景低且信号明亮的DNA FISH结果。我们已在多种不同细胞类型中成功应用该方案，适用于落射荧光显微镜或共聚焦显微镜。使用落射荧光显微镜进行自动成像时，需要FISH信号清晰、易于识别且背景信号低（图3），而共聚焦显微镜则需要更强的信号。图4A展示了典型的处理后图像。可获取FISH信号的核内坐标，并计算基因组区域之间的空间关系（示例见图4B）。我们还利用共聚焦显微镜获取的图像序列，对染色体区域内的FISH信号进行三维建模（视频1）。
图 1. 探针标记与 DNA FISH 实验流程。 探针制备步骤以蓝色表示。DNA FISH 实验步骤以黑色表示，详细步骤以绿色标出。
图2. 通过切刻平移法标记探针及标记探针的质量控制。A） 显示在加热灭活DNase I之前的理想涂布条带的凝胶图（第1道：DNA ladder，第2和第3道：切刻平移后的BACs）。片段大小应在150–700 bp范围内。在成功的切刻平移反应中，通常还会在约1 kb处观察到额外的涂布条带。B） 标记探针的微量全光谱分析。在260 nm处可见DNA吸收峰，同时出现对应于探针所标记荧光染料吸收波长的第二个峰：Alexa Fluor 488为495 nm，Alexa Fluor 555为555 nm，Alexa Fluor 647为650 nm。图中显示了三个标记效率良好的探针：荧光染料的吸收峰高度与DNA峰相近或更高。通常，Alexa Fluor 647的吸收值高于Alexa Fluor 555，而后者又高于Alexa Fluor 488。此外，Alexa Fluor 488在260 nm处也有一定吸收，因此该探针的第一个峰高于其他探针。标记效率差的探针，其荧光染料吸收峰比DNA吸收峰低2–3倍。若荧光染料峰比DNA峰高出两倍以上，则通常含有未结合的游离染料，可能在FISH实验中造成背景信号。
图 3. MetaCyte 3D FISH 成像软件界面截图，显示典型的三色 FISH 实验结果。 屏幕分为多个区域。A) 由 Metafer/MetaCyte 载玻片扫描系统捕获的原始视野（FOV）图像。B) 已识别细胞核的图像画廊，这些图像经过图像处理和FISH信号分割。每幅画廊图像上可显示多种类型的数据。本示例中，每个图像左上角显示细胞编号，右上角及图像下方两侧显示各种等位基因间和基因座间距离。C) 载玻片名称及分析中识别出的细胞核数量。D) 载玻片示意图，标示系统扫描的区域。E) 扫描区域的放大图。白色斑点代表每个视野中识别出的细胞核。F) 处理后的数据。本示例中显示绿色信号（上方）和红色信号（下方）之间的最大等位基因间距离。所示数据来自小鼠 P20 生殖细胞。探针位于不同染色体上，覆盖 Hbb 和 Hba 基因以及一个组蛋白基因簇。点击此处查看高清大图。
图 4. 处理后的图像示例及获得的位置数据。A) E13.5 小鼠胎肝细胞的处理后图像，细胞使用覆盖 Myc 和 Kcnq1 基因（分别称为 myc 和 KvDMR，显示为绿色和红色）且位于不同染色体上的 BAC 探针进行染色。B) 表示 600 个细胞核中相同位点等位基因间距离分布的 Tukey 箱须图。为校正细胞核大小的差异，等位基因间距离以细胞核半径的分数形式（距离/半径）表示。ES 细胞核的半径约为 5 μm。红色探针之间的距离显著小于绿色探针之间的距离（***：p<0.01，非配对 t 检验）。数据来自10。
视频 1. 染色体区域内两个位点的三维建模。位于小鼠 7 号染色体两端附近的两个 BAC 探针被标记（红色和远红，（伪彩色显示为白色）），并与全染色体涂染探针（绿色）共同杂交至小鼠 ES 细胞。点击此处观看视频。
讨论
3D DNA FISH 已成为分析细胞核内空间排列的广泛认可工具。尽管 FISH 能提供直观且直接的结果，但与所有技术一样，使用者必须了解其局限性。DNA FISH 面临一个固有的问题，即需要相对剧烈的处理才能使染色质对 FISH 探针可及，而这种处理最终会破坏细胞核结构——这正是需要分析的对象。已有多种策略被用于平衡可及性与结构保存之间的矛盾。在本文所述的方案中，通过冻融法对细胞进行透化处理，并在探针杂交前进行加热变性，从而使染色体 DNA 可被探针接触。Solovei, et al. (2002) 分析了类似处理后的结构变化，发现染色质结构域的平均位移为 300 nm，这将结构分析的分辨率限制在基因组中约 1 Mb 的区域8。虽然这一分辨率并不高，但对于分析核内定位而言是一个合理的尺度。
FISH 分析的一个更实际的考虑是，图像采集和核距离测量是耗时的过程，限制了可分析的细胞核数量。为了研究罕见事件，我们旨在进行高通量自动化成像。随后，在设置适当对照的情况下，可比较足够数量的样本，从而对空间关系进行可靠的统计分析。我们通常对每个数据点分析 600 个细胞核，并确定细胞核体积内所有 FISH 信号的三维坐标。这些数据占用存储空间极小，且允许在后续任意时间点分析等位基因间和等位基因内距离，或径向位置。此外，自动化处理可以以研究者盲法方式进行，从而大大降低无意识偏倚的可能性。
为了实现此类高通量分析，我们的目标是建立一种快速且高效的DNA FISH操作方法。我们发现此处描述的方案具有极高的稳健性，能够持续产生强荧光信号且背景低。只要对细胞贴附到载玻片的步骤进行适当调整，该方案适用于我们尝试过的所有细胞类型。此外，除一个例外情况外，我们使用的所有BAC均可转化为明亮的探针。我们还成功在DNA FISH之后通过抗体染色检测了多种核蛋白。尽管某些蛋白的染色效果良好，但我们建议将其结果与传统的免疫荧光（IF）进行比较，以确保免疫荧光染色模式在IF与DNA免疫FISH之间的一致性（参见11）。
通常，我们发现用不同颜色标记的探针产生的结果相同。但在选择标记染料时，应考虑以下几点：首先，荧光染料的颜色必须能够被所使用的显微镜良好检测；其次，不同荧光染料发射光的波长应足够不同，以避免信号渗漏到其他通道，这取决于显微镜的滤光片配置；第三，在我们的实验条件下，某些颜色的染料比其他颜色更稳定地产生强信号。我们始终使用 DAPI（蓝色）作为复染剂，因此 Alexa Fluor 555（红色）、488（绿色）和 647（远红）是探针标记的良好选择。在我们的成像系统中，Alexa Fluor 555（红色）产生的信号最亮，其次是 Alexa Fluor 488（绿色）。Alexa Fluor 647（远红）的缺点是人眼无法直接观察，因此在显微镜下观察时无法看到信号。因此，若进行双色 FISH，我们推荐使用红色和绿色染料的组合。
可能出现两个主要问题：细胞从载玻片上脱落以及信号微弱。细胞在载玻片上的贴附效果因细胞类型不同而存在很大差异，因此需要确定最适合的细胞沉降或接种方案。我们曾成功使用带正电荷的载玻片或聚-L-赖氨酸（Poly-L-lysine）包被的载玻片（购买后可直接使用），但发现细胞通常在聚-L-赖氨酸包被的载玻片上贴附得更好。此外，我们还发现，当细胞密度过高时，整个区域可能以片状剥落；而密度过低则会妨碍自动化成像。因此，如果样本并非十分珍贵，应尝试接种不同数量的细胞以确定最佳密度。若细胞特别容易脱落，可使用疏水屏障笔画圈，然后通过移液器小心地将溶液直接加到载玻片上进行FISH操作。这种方法可显著减少试剂用量，但在处理多张载玻片时耗时明显更长。
信号弱通常是由于探针质量差所致，因此投入时间制备高质量的探针非常值得。应使用纯净的BAC DNA作为起始材料，可通过反复沉淀或市售试剂盒获得。细菌基因组DNA的污染会对探针质量产生负面影响，因此在细胞裂解及裂解液过滤过程中需谨慎操作，以将污染降至最低。然而，无需使用外切核酸酶步骤来消化线性DNA，因为这会显著降低产量。探针的有效标记至关重要。此步骤最重要的质量控制是切口平移后检测片段大小（参见代表性结果）。通常情况下，条带呈均匀“涂抹”状几乎总能获得荧光强烈的探针。但我们发现，偶尔某些BAC无法被加工成高质量探针，此时需要选择另一个不同的BAC。另一个关键步骤是热变性。若温度过低，DNA将仅部分变性，从而影响探针杂交效果；若温度过高，则会对细胞核结构造成不必要的破坏。根据我们的经验，在倒置加热金属块上使用78 °C为理想折中温度，但具体温度可能因所用加热金属块的不同而有所差异。
我们使用Vectashield封片剂获得了良好的效果，但发现SlowFade Gold的背景更低，且能更长时间地保存荧光信号。我们不推荐使用固化型封片剂，因为发现其会影响三维结构，并随时间推移形成气泡。
总之，结合此处描述的 DNA FISH 实验方案，具有高荧光强度的直接标记探针为核结构的稳健、快速分析提供了一种高效的解决方案，可广泛适用于多种生物学问题的研究。
披露
本文的制作部分由卡尔蔡司（Carl Zeiss）和美达斯（MetaSystems）赞助。
致谢
本工作由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）和惠康信托基金（Wellcome Trust）资助。我们感谢西蒙·沃克（Simon Walker）在成像方面的协助，以及菲利克斯·克吕格尔（Felix Krueger）在生物信息学分析方面的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| NTB缓冲液 | 步骤 1.1.1（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） | ||
| DTT | Invitrogen | D-1532 | 步骤 1.1.1 |
| dNTPs | Bioline | BIO-39025 | 步骤 1.1.1（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） |
| 氨基烯丙基-dUTP | Ambion | AM8439 | 步骤 1.1.1 |
| DNA聚合酶I | 新英格兰生物实验室 | M02095 | 步骤 1.1.1 |
| DNase I 重组 RNase-free | 罗氏 | 4716728001 | 步骤 1.1.1 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | 步骤 1.1.4，1.2.3 |
| NaOAc | VWR | 27653 | 步骤 1.1.5，步骤 2.1.1.2 |
| NaHCO₃ | Sigma | S5761 | 步骤 1.2.1 |
| 用于微阵列应用的 Alexa Fluor 活性染料十联装 | Invitrogen（Molecular Probes） | A32750, A32756, A32757 | 步骤 1.2.2 |
| DMSO（无水） | Sigma Aldrich | 276855 | 步骤 1.2.2 |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | Life Technologies | S33102 | 步骤 1.2.4（溴化乙锭的替代方法） |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | 第 2.1.1.1 步（Cot-1 DNA 可自行大量制备，效果同样良好） |
| 鲑鱼精单链DNA | Sigma | D7656 | 步骤 2.1.1.1 |
| 去离子甲酰胺 | Sigma | F-9037 | 步骤 2.1.1.3（健康危害） |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma生命科学 | D8906 | 步骤 2.1.1.4（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） |
| XMP 染色探针 | MetaSystems | 000000-0528-837 | 步骤 2.1.1.4 |
| 多聚-L-赖氨酸包被的载玻片 | Sigma Aldrich | P0425 | 步骤 2.1.2 |
| 疏水笔（ImmEdge） | Vector Laboratories | H-4000 | 步骤 2.1.2 |
| 70 μm筛网（小鼠f–仅适用于肝细胞 | BD Falcon | 352350 | 步骤 2.1.2.1 |
| PFA | Sigma Aldrich | P6148 | 步骤 2.1.3（易燃，腐蚀性，急性毒性，健康危害）（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） |
| Tris-Cl | 步骤 2.1.3（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） | ||
| 皂苷（来自皂荚树皮） | Sigma Aldrich | 47036 | 步骤 2.1.4、2.1.11（急性毒性），（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 步骤 2.1.4、2.1.11（急性毒性，对环境有害） |
| 10 x PBS | Life Technologies（GIBCO） | 70011-036 | 步骤 2.1.4、2.1.5、2.1.6、2.1.8、2.1.10、2.1.11、2.1.12、2.2.7、2.2.9 |
| 甘油 | Fisher Scientific | G/0650 | 步骤 2.1.6 |
| HCl | VWR | 20252 | 步骤 2.1.9（急性毒性，腐蚀性） |
| 甲酰胺 | Sigma Aldrich | 47670 | 步骤 2.1.14、2.2.3（健康危害） |
| SSC | 步骤 2.1.14，2.2.2-2.2.6，2.2.8（参见下方“FISH 缓冲液与反应混合液”列表） | ||
| 盖玻片 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | 步骤 2.1.15 |
| 盖玻片 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | 步骤 2.1.15 |
| 橡胶水泥 | Marabu | 2901 (10 000) | 第2.1.15步（易燃，危害健康，对环境有害） |
| DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | 步骤 2.2.8（健康危害） |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | 第2.2.10步（封片介质） |
| 透明指甲油 | 任何供应商 | 步骤 2.2.10 | |
| 设备 | |||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | 步骤 1.1.6、1.2.4（微量分光光度法） | |
| Typhoon FLA 7000 磷光成像仪 | GE Life Sciences | 步骤 1.2.4 | |
| Coplin 瓶 | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | 步骤 2.1.3 及后续步骤 |
| 液氮杜瓦瓶 | 任何供应商 | 步骤 2.1.7 | |
| 带黑色盖子的底座（避光室） | Simport | M920-2 | 步骤 2.1.17 |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | 步骤 2.2.3（或使用 37 ℃ 摇床） °C 室） |
| 成像与图像处理 | |||
| Metafer - 成像自动化平台 | MetaSystems | 自动化成像软件 | |
| MetaCyte - 自动化间期FISH分析 | MetaSystems | 自动化成像软件 | |
| Axio Imager Z2 直立式显微镜 | 蔡司 | 用于自动成像的落射荧光显微镜 | |
| IX81 共聚焦显微镜（FV1000） | Olympus | 共聚焦显微镜 | |
| Bitplane，版本 7.3 | Imaris | 图像分析与3D建模软件 | |
| 科学影像，第4.1版 | Huygens | 图像分析与去卷积软件 | |
| FISH 缓冲液和反应混合物 <表格 边框="1"> | |||
| 名称 | 成分 | 评论 | |
| 10 x NTB缓冲液 | 0.5 M Tris-HCl，pH 7.5 | ||
| 0.05 M MgCl₂ | |||
| 0.5 mg/ml BSA | |||
| dNTP混合液 | 0.5 mM dGTP | 储存 50 μl 分装于 -20 °C | |
| 0.5 mM dATP | |||
| 0.5 mM dCTP | |||
| 0.125 mM dTTP | |||
| 4 % PFA | 称取 4 g/100 ml PFA 溶于 PBS 中，加热至 62 °C. 用 NaOH 调节 pH 至 7.0，以溶解残留的 PFA。 | 将 50 ml 分装液储存于 -20 °C，切勿再次冷冻 | |
| 2% 皂苷溶液 | 每100 ml PBS中加入2 g皂苷，充分搅拌溶解。用NaOH溶解并调节pH至7.0。用ddH2O定容至1 L，高压灭菌。 | 将 5 ml 分装液储存于 -20 °C | |
| 20 x SSC | 称取 175.3 g NaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠，加入 80 ml ddH2O 中。溶解后用 NaOH 调节 pH 至 7.0，用 ddH2O 定容至 1 L，高压灭菌。 | ||
| 硫酸葡聚糖混合液 | 20% 硫酸葡聚糖溶于 2 × SSC 缓冲液中；涡旋混匀后，在摇床上过夜混合。 | 储存 500 μl 分装于 -20 °C |
参考文献
- Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26, 11-24 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26, 10-18 (2002).
- Hewitt, S. L., Yin, B., et al. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).
- Solovei, I., Cavallo, A., et al. Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH. Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).
- Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. FISH: A Practical Approach. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Krueger, C., King, M. R., et al. Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status. PLoS One. 7, e38983(2012).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).
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