方法文章

一种多功能自动化平台微尺度细胞刺激实验

DOI：

10.3791/50597

⸱

2013年8月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微观尺度细胞刺激实验，我们已经开发了一个自动细胞培养和审讯平台。该平台提供简单，功能多样，培育和刺激小的细胞群体，并恢复裂解分子分析和精确的控制。该平台非常适合使用珍贵的细胞和/或试剂的研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

培养的细胞在体外分析中研究复杂的生物系统提供了重要的洞察。常规方法和设备，用于在体外分析中非常适合研究毫升尺度的量（≥0.1毫升）中的大量的细胞（≥10 5）。不过，也有许多情况下，它是必要或适当的缩减培养规模，降低消耗细胞的利息和/或他们的文化，刺激，或加工所需的试剂。不幸的是，传统的方法不支持精确和可重复操作的微观尺度的文化，基于微流体的自动化系统目前过于复杂，专门用于日常使用的大多数实验室。为了解决这个问题，我们已经开发出一种简单和通用的技术平台，为自动化的文化，刺激和复苏在微观尺度量小的细胞群体（100 - 2,000细胞）（1 - 20微升）。该平台由一组纤维连接蛋白涂层的微毛细管（"细胞灌注腔"），内微观尺度的文化是建立，维护和刺激;数字微流体（DMF）设备配备"转移"微毛细管（"中央枢纽"），航线细胞和试剂并从灌注室;一个高精度的注射器泵，权力灌注室和中心位置之间的材料运输和一个电子接口，它提供控制材料运输，这是协调和自动化通过预先确定的脚本。作为一个例子，我们使用的平台，以便研究转录反应引起的免疫细胞与细菌的挑战时。使用的平台使我们能够减少细胞和试剂的消耗，尽量减少实验实验变异，再直接动手劳动。的优点在于它赋予，以及它的可访问性和多功能性，邻的乌尔平台，应使用在各种各样的实验室和应用程序，并在促进细胞和刺激可只在有限数量的分析证明是特别有用的。

引言

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维持在文化研究的细胞体外分析的基本原则和复杂的生物系统和人类健康的分子机制提供了宝贵的洞察。文化，刺激和收集细胞进行分析，利用培养皿，酶标板，传统的方法是大量人口毫升规模培养体积的细胞（≥10）（≥0.1毫升）的研究设计。但是，也有许多实例中，只有有限数量的细胞（ 例如，原代细胞），或小的细胞群体是可取的（ 例如，在人口减少细胞到细胞的变异），或很难获得所需的试剂或昂贵（ 如纯化细胞分泌的因素）。这样的问题可以顺利解决文化尺寸的缩减，减少消费，这有利于增加所需试剂在体外分析1,2。不幸的是，传统的设备和方法不支持微观尺度的文化和基于微流体的自动化系统目前可用3-11过于复杂，专门用于日常使用的大多数实验室的精确和可重复的操作。

在这份报告中，我们描述了一个简单而灵活的技术平台，为自动化的文化，刺激和恢复小的细胞群体（100 - 2,000细胞）在微观尺度册（1 - 20微升）的组装和使用。采用模块化设计，该平台架构（ 图1）:一组纤维连接蛋白涂层的微毛细管（"细胞灌注腔"模块）作为该网站的建立，维护和刺激微观尺度的文化和数字微流体（DMF ）12,13设备配备"转移"微毛细管（"中央枢纽"模块）14,15航线细胞和试剂从灌注室。二甲基甲酰胺使用户单独处理多个液滴同时不改变的移动设备的硬件的情况下改变或重新排序的操纵（ 即重新配置检测体处理列车）。其巨大的灵活性是显而易见的，其最近出现的一项关键技术在广泛的应用，包括细胞培养16,17，酶化验18,19，20,21免疫测定，DNA分析，22,23，蛋白处理，24,25我们的中心枢纽和临床标本的处理。26,27利用DMF装置所固有的灵活性，进一步增强它通过添加微细的接口，它提供了契机，开展了专门的外设操作的一个子集（ 如细胞培养）模块，而不是在DMF中的移动设备本身。列车以这种方式处理的条块分割也简化了设计解放军TForm的架构（无需修建的DMF装置，可以进行所有的处理步骤），并促进其演变为新功能（简单地集成新的必要的外设模块）。是由电润湿力的DMF装置13,28内的电极所产生的顺序激活，运输到，从运输的中心轮毂内的细胞和试剂，于灌注室是由一个高精度的注射器产生的压力变化泵。所有这些流体运动控制，通过一个简单的电子接口，通过使用预先确定的脚本和自动化​​。

作为一个有代表性的例子中，我们演示了如何使用该平台的研究转录反应引起的免疫细胞细菌挑战时（ 图2）。这些实验平台上开展，使我们能够与小数量的细胞（〜1,000 元实验，TAL条件），减少实验的实验变异，节约试剂，并重新直接动手劳动。给定的优点，它赋予，以及它的可访问性和多功能性，该平台应该找到实验室和应用程序中使用各种各样的，并证明在促进细胞和刺激可只在有限数量的分析特别有用。

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方案

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这是一般的协议被设计为支持应用程序的平台，各种各样的研究，具体代表本报告中描述的研究方面分离出来，在括号中。 图2说明了具有代表性的研究，使用的协议进行。请注意，在协议中，所有的"指示"命令通过使用预先确定的脚本自动化。还要注意的是第2步就可以进行并行步骤1（ 例如，在步骤1.7和1.8），并往往是绕过该步骤2.1（因为的图案/涂层DMF装置板可水洗，并重新使用;见步骤5.2） 。

1。组装和填充细胞灌注室

  1. 大衣灭菌（高压灭菌的）微毛细管（熔融石英，外径679微米，534微米的id，长15厘米）与纤连蛋白，通过指示画出一个无菌的纤连蛋白溶液（30微升的50微克/毫升的注射器泵的内表面）到每个微细管，温育（37℃，2小时），指令注射泵以退出该溶液，并让微毛细管干燥（6小时，室温（RT））。
  2. 将每根纤维连接蛋白涂层的微毛细管（灌注室）聚碳酸酯管（外径为500μm，内径为100μm）和管的多端口的注射器泵，使用CapTite的配件（6灌注腔室，8端口注射器泵）。
  3. 使用胶带，固定每个灌注腔体设置为所期望的温度（37℃）的热块。
  4. 沉浸在水库中的灌注腔室的开口端（microcentifuge管或微量滴定板的孔）的含细胞（P388D.1小鼠巨噬细胞）悬浮于新鲜的生长培养基（RPMI-1640，10％胎牛血清，500单位/ ml青霉素，500微克/ ml链霉素）在所需的浓度（10 6细胞/ ml）。
  5. 指示注射泵以绘制细胞（10微升，10 4个细胞），其次是足够的爱到每个灌注室r键将液塞（约4.5厘米）固定到散热块上的一节。
  6. 使细胞附着到纤连蛋白涂覆的内表面的灌注室（37℃，1 - 2小时）。在此期间，从细胞储层灌注腔室的开口端传输到一个新的含有新鲜的生长培养基中的储层。
  7. 坚持期后，指示注射器泵送液体插头（空调媒体和未婚细胞），浪费，提取新鲜培养基（10微升），并按照在坚持与足够的空气来定位新的液体插头（新鲜中等）细胞。
  8. 继续开展中小型交流（ 即重复步骤1.7）定期（每2小时），直到细胞群体有足够的平衡和扩展（16 - 24小时的微观尺度的文化产生的种群〜1,000个细胞/室）。

2。制作的的DMF设备和组装集线器架构

    正如前面描述的14,29，图案46的铟锡氧化物（ITO）电极（液滴的致动的驱动程序），通过光刻和蚀刻，和5μm的聚对二甲苯-C和50的外套与DMF中的移动设备的底板上纳米的聚四氟乙烯AF。 DMF中的移动设备的顶板，通过涂布形成一个无图案的ITO玻璃基板有Teflon-AF，如上。
  1. 使用金属压缩帧，固定到与保持板之间的间距为400μm的凹部的聚合物铸件14,30，此间距与致动电极的大小（2.5毫米2），结合在DMF中板，定义的液滴体积（2.5μl的每个电极）。需要注意的是DMF组件，可以通过简单的装置24。
  2. "插入"特氟龙涂层转移到DMF板之间的空间中的微毛细管（外径360微米，内径100μm; 3.5 - 4.0厘米长），定位每个公司同源的致动电极的边缘延伸。
  3. 到对面的连接D每个传输微毛细管加贴CapTite的的拟合。
  4. 接合电连接器与电源电压的ITO电极。电极激活序列是通过使用计算机控制的电子界面，运行预先确定的脚本自动化。
  5. 可选:将组装的DMF轮毂上配备了电荷耦合器件（CCD）摄像机（DCR-HC96（索尼，日本）），以便跟踪液滴的显微镜（SZ-6145TR（奥林巴斯，日本））的平移阶段31

3。将连接灌注钱伯斯DMF集线器和刺激细胞群体

  1. 删除从介质油藏灌注室（见步骤1.6）的开口端，并把它们插入（见步骤2.4）的二甲基甲酰胺集线器转移微毛细管的端部贴到CapTite配件。
  2. 指示注射器泵送液体插头（空调媒体），在灌注室浪费。
  3. 研究所构作的DMF集线器画刺激（ 大肠杆菌生物粒子在100微克/毫升的新鲜培养基中的Pluronic F127 0.1％w / v的）从一个板上水库和提供适当大小的液滴（10微升），每个转印微细。主板上的水库是由圆筒状的隔室（1.5×1.5厘米），并通过管道连接到DMF集线器。
  4. 指示绘制刺激转让微毛细管插入注射器泵，并按照与足够的空气灌注室的细胞群定位插头。
  5. 培养的细胞与刺激（37℃，1 - 4小时）。可选:新鲜的刺激（ 即重复步骤3.2-3.4）定期交流。

4。终止刺激并恢复细胞裂解液分析

  1. 可选:如果刺激后需要花多长时间，交换刺激含有液体插头新鲜培养基（ 即重复步骤3.2 - 34，以新鲜培养基刺激），并继续孵化和交流需要。
  2. 交易所的液体灌注室洗涤缓冲液（前奏曲直接的裂解模块缓冲区B）（ 即重复步骤3.2 - 3.4，以洗涤缓冲液的刺激），孵化（5分钟）插头。
  3. 交易所液体插头（洗涤缓冲液）裂解液（前奏直接裂解模块缓冲A与0.1％的Pluronic F127 W / V）（ 即重复步骤3.2 - 3.4，裂解液代替刺激），孵化（5分钟） 。
  4. 指导的注射器泵，送液体插头（细胞裂解液）的DMF集线器。
  5. 拆卸的DMF枢纽，删除的DMF装置的顶板（注意不要倾斜板横盘整理，因为这可能会导致液滴混合），并收集裂解的Pipetman使用或注射器为平台（基因表达谱分析通过定量PCR）。

5。清洁平台硬件重新使用

  1. 浸入转印微毛细管和CapTite的管件在10％的漂白剂（在水中的体积/体积）和10分钟，在RT，以及与去离子水和干燥的，用氮气冲洗。
  2. DMF中的移动设备板浸入10％的漂白剂在RT和10分钟，用异丙醇冲洗，然后用去离子水和干燥用氮气在160℃下烘烤10分钟。
  3. 的注射器泵的聚碳酸酯管，和DMF的移动设备的聚合物铸造和压缩帧，可以重新使用无清洗。微毛细管灌注室每次实验后丢弃。

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结果

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自动化平台作为示范，我们用它来 ​​开展一项研究中，人口较少的免疫细胞生长在微观尺度的文化，挑战与细菌，裂解为平台促炎症反应的分析（ 图2 ）。

每6个细胞的灌注腔10 4免疫细胞（P388D.1小鼠巨噬细胞）的生长培养基中再悬浮于10μl接种。 〜500个细胞粘附期（37℃，2小时）和介质的交换后，仍然连接到每一个腔室（ 图3A）的内表面，通过分析，复制微米文化（细胞通过释放螯合剂处理和计数测量通过血球和光镜）。进一步在37℃下温育16小时，在2小时的时间间隔交换介质，扩大了的细胞群〜1,000个细胞每室（ 图3B）（如测得的第复制微尺度文化，如上所述）粗略分析。在四个六个灌注室，细胞群体的挑战与E.大肠杆菌的细菌（pHrodo生物粒子），悬浮在生长培养基，感染复数（MOI）为20（ 即每个单元有20个生物粒子，被质疑在人口平均）交付。在剩下的两个腔室，细胞群收到一个模拟的挑战（ 即生长...

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讨论

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我们已经开发了一个简单而灵活的自动化平台，为微大规模细胞培养和刺激实验。该平台使我们的工作与小培养体积和细胞群（1 - 20μl和100 - 2,000细胞， 每室），文化的尺寸可以进一步降低通过使用较小直径的微毛细管。工作在这些尺度的常规研究，并降低了成本，使需要使用珍贵的试剂和/或细胞的可行性研究。平台上执行的实验也显示较少的可变性，推测可能是由于细胞和体液处理自动化平台的精确度和可重复性。

当前配置的平台，吸引细胞和媒体使​​用off-board水库（离心管或微孔板）播种，平衡，扩大细胞群在灌注室。这是一个简单的方式来解决之间的不匹配生长培养基中的要求（ 例如上述的代表性的实验中消耗700微升）和DMF中的移动设备的能力，活动板水库（各24微升）。然而，这样的配置必须实验中的人工干预，两个水库（​​步骤1.6）之间进行切换和连接灌注室DMF枢纽（步骤3.1）。将来的配置可能包括大容量（ 如 1毫升）上板水库，这将使所有材料的路由通过DMF枢纽，从而消除实验中人工干预的需要。

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披露

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作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢罗纳德·F.壬子和Michael S. BARTSCH的为他们贡献的设计和开发的DMF设备和DMF枢纽。这项研究是完全由实验室的定向研究和发展方案在桑迪亚国家实验室的支持。桑迪亚国家实验室是一个多程序管理和经营的桑迪亚公司是洛克希德·马丁公司的全资附属公司，根据合同DE-AC04 94AL85000的美国能源部下属的国家核安全管理局的实验室。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Prelude 直接裂解模块NuGEN1400-24
台盼蓝 （0.4% w/v）GIBCO15250-061
细胞剥离器Cellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR 检测Applied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR 检测Applied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR 检测Applied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR 检测Applied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDHTaqMan qRT-PCR 检测Applied BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
聚对二甲苯 C 二聚体特种涂层系统28804-46-8
特氟龙-AF杜邦AF1600
聚酰亚胺胶带ULINES-11928
氧化铟锡 （ITO） 涂层玻璃基板 Delta TechnologiesCB-40IN-1107
DMF 集线器 特氟龙涂层熔融石英微毛细管Polymicro TechnologiesTSU100375
灌注室微毛细管Polymicro TechnologiesTSP530700
管材和微毛细管配件桑迪亚国家实验室
聚碳酸酯管Paradigm OpticsCTPC100-500-5
8 端口精密注射泵，配备 30 mm （500 μl 容量） 注射器汉密尔顿公司54848-01
聚对二甲苯-C 气相沉积仪特种涂层系统PDS 2010 Labcoter 2
高压函数发生器Trek615A-1 615-3
MVX10 显微镜奥林巴斯可选（有助于跟踪 DMF 集线器上的液滴）
QIClick 数字 CCD 相机QImagingQIClick-F-CLR-12可选（有助于追踪 DMF hub 上的液滴）

参考文献

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