可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位 在支架上进行细胞培养时对微环境条件进行监测。这种方法的优势在于,可在不干扰实验的情况下对三维细胞结构进行实时监测。
可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位 在支架上进行细胞培养时对微环境条件进行监测。这种方法的优势在于,可在不干扰实验的情况下对三维细胞结构进行实时监测。
在合适的支架上以三维形式培养细胞被认为能更好地模拟 体内 微环境并增强细胞间相互作用。所形成的三维细胞结构在研究分子事件和细胞间相互作用方面,通常比二维条件下的类似实验更具相关性。为了在整个支架中实现具有高细胞活力的有效三维培养,必须严格控制培养条件(如氧气和pH),因为在三维结构内部可能存在分析物浓度梯度。本文描述了制备生物相容性pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器的方法,及其与聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)电纺支架的整合过程,以及后续用于哺乳动物细胞培养的准备步骤。这种pH响应型支架可作为工具,用于测定三维细胞结构内的微环境pH值。此外,我们详细介绍了将pH响应型纳米传感器递送至由电纺PLGA支架支持生长的哺乳动物细胞胞内环境的方法。这些位于细胞质中的pH响应型纳米传感器可用于在实验过程中实时监测细胞内pH(pHi)。
组织工程中的一个关键策略是使用生物相容性材料制备支架,其形态需类似于待替换的组织,并能够支持细胞的生长和功能1,2。支架通过促进细胞黏附和增殖提供机械支撑,同时允许细胞在三维细胞结构的孔隙中迁移。支架还必须允许细胞营养物质的质量传递,并不妨碍代谢废物的排出3。
静电纺丝已成为一种有前景的聚合物支架制备方法,能够支持细胞生长4-6。所生成的无纺静电纺丝纤维适合细胞生长,因其通常具有多孔结构,可促进细胞间相互作用以及细胞在三维细胞构建体间隙中的迁移7。在培养期间监测细胞活力,并确保整个三维构建体中细胞活力得以维持,具有重要意义。例如,氧浓度和pH等培养条件需严格控制,因为在三维构建体内可能存在分析物浓度梯度。可采用生物反应器或灌注系统来模拟in vivo的间质流条件,从而增强营养物质传递和代谢废物清除8。通过实时评估细胞微环境,可回答此类系统是否能够确保稳定的微环境条件这一问题。
可实时监测的关键微环境参数包括:温度、细胞培养基的化学成分、溶解氧和二氧化碳浓度、pH 值以及湿度。在这些参数中,温度最易于通过in situ探针进行监测。对于其余所列参数的监测方法通常需要取出部分样品,因而会干扰细胞培养并增加污染风险。目前正致力于开发连续、实时的监测方法。现有的监测手段通常依赖于物理探针直接插入细胞结构中,例如pH监测仪或氧探针。然而,这类侵入性方法可能损伤细胞结构并干扰正在进行的实验。对三维结构内分析物浓度的非侵入式监测,有望实现对营养物质消耗等环境因素的实时监控9。这将有助于评估营养物质向结构深层区域的输送情况,并判断代谢废物是否被有效清除10,11。为解决侵入性问题而设计的系统通常采用灌流培养室,使培养基流经培养容器和外部传感器,以监测pH、氧和葡萄糖水平12。目前,人们越来越关注开发可直接集成到培养容器中的传感器,这类传感器无需取样即可实现in situ监测。
为解决微环境条件的原位(in situ)和无创监测中存在的上述不足,我们已将分析物响应型纳米传感器整合到电纺支架中,以制备出自报告支架13。此前已有研究制备了通过监测荧光活性来发挥传感功能的支架,其中传感元件或是通过静电纺丝形成的聚合物支架本身,或是将分析物响应性染料在支架成型前掺入聚合物中实现14,15。然而,这些传感装置可能因其他分析物的干扰而产生错误的光学输出信号。采用如本方案所述的比率型传感装置,有望消除这些潜在的不利影响,并提供针对目标分析物的特异性响应。
本文所展示的静电纺丝支架由合成共聚物聚(乳酸-共-乙醇酸)制备而成) (PLGA),因其具有美国食品药品监督管理局(FDA)批准的资质,且具备可生物降解性和生物相容性,并有支持多种细胞类型生长与功能的既往记录而被选用16-18制备的比率型分析物响应纳米传感器对 pH 具有响应性。该纳米传感器将两种荧光染料包埋于生物相容性溶胶-凝胶基质中,其中一种染料 FAM 对 pH 响应,另一种染料 TAMRA 因不受 pH 影响而作为内参标准。此外,由于 FAM 与 TAMRA 的荧光发射光谱无明显重叠,可对两者的荧光信号进行独立检测。通过测定两种染料在特定波长下的荧光发射强度比值,可获得不受其他环境因素干扰的 pH 响应信号。这种自报告支架可实现对 pH 的重复性评估 关键词:比率型纳米传感器,pH 响应,FAM,TAMRA,溶胶-凝胶基质,荧光染料,内参标准,自报告支架 原位 并且能够实时进行,而不会破坏已构建的3D模型。我们已证明,这些支架能够支持细胞的黏附与增殖,并对目标分析物保持响应性。工程化构建体中酸性代谢产物的动力学特性目前仍研究不足,因此,采用pH响应性支架将有望显著推动此类研究。19此外,将自报告支架用于组织工程应用,为全面理解、监测和优化三维模型组织构建物的生长提供了可能 体外 无创且实时地。
pH 响应型纳米传感器还被递送至培养在电纺 PLGA 支架上的成纤维细胞的细胞内环境。通过检测染料荧光发射的比值来监测细胞内 pH(pHi),并将其与整合了 pH 纳米传感器的自报告支架进行比较。将纳米传感器递送至三维环境中培养的细胞,可实现对构建物深部分析物浓度的无损监测。因此,纳米传感器可能成为一种可行的成像工具,用于对三维构建物中细胞行为进行无损、长期的分析。对三维构建物内单个细胞的分析物浓度进行筛查,可确保细胞获得充足的营养物质和氧气浓度。对过程参数的监测有助于建立标准化技术,以有效促进氧气和营养物质的质量传递。将纳米传感器递送至细胞内环境,并将其整合到聚合物支架中,这两种方法可结合使用,从而在组织生长过程中同时评估细胞活力以及支架在三维构建物中的性能。这可能增进对这类构建物的理解,并推动具有生物学相关性的组织替代物的制备进程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
概述
第1节描述了pH响应型纳米传感器的制备,以及利用荧光光谱法表征纳米传感器对pH的响应,并通过扫描电镜(SEM)表征其尺寸。
第2节描述了静电纺丝聚合物支架的制备,以及利用扫描电子显微镜(SEM)对其形貌和尺寸进行表征。第2节还介绍了自报告支架的制备,即在静电纺丝支架中引入pH响应型纳米传感器所形成的支架。通过SEM对所得的自报告支架进行表征,以评估静电纺丝纤维是否发生任何形态学变化。通过共聚焦显微镜评估由所掺入纳米传感器产生的自报告支架的荧光信号。
第3节描述了在电纺支架和自报告支架上进行细胞培养的方法。首先对支架进行灭菌处理,以备细胞培养使用;随后评估支架,以确定灭菌过程以及细胞培养是否会影响自报告支架的荧光性能。该方案还介绍了将纳米传感器递送至生长在电纺支架上的细胞的方法。使用溶酶体示踪染料(Lysotracker dye)确认纳米传感器未被摄入细胞的酸性区室中。
1. pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备与分析
1.1 pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备
注意:该步骤应在通风橱中进行。
1.2 纳米传感器对 pH 的响应
1.3 纳米传感器的扫描电镜观察
2. PLGA支架的制备与分析
2.1 静电纺丝制备PLGA支架
2.2 静电纺丝制备pH响应性PLGA支架
2.3 PLGA支架与pH响应性支架的扫描电镜观察
2.4 pH 响应支架的校准
3. 在PLGA支架和pH响应性PLGA支架上进行细胞培养
注意:以下操作应在细胞培养柜中进行。
3.1 细胞培养用PLGA支架的制备
3.2 纳米传感器递送至培养在PLGA支架上的细胞
3.3 纳米传感器在哺乳动物细胞内的定位
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所制备的pH响应型纳米传感器的粒径分布通过扫描电镜(SEM)进行表征,对成像的纳米传感器群体进行测量,发现其纳米尺寸范围为240–470 nm图1A)。获得较窄且相对较小的直径与采用Stöber法制备纳米颗粒的结果一致。研究发现,在纳米颗粒合成过程中使用碱性pH环境 即 采用Stöber法制备的纳米颗粒可较好地控制粒径,而在酸性条件下制备则导致粒径分布较宽。采用所述方法制备的PLGA电纺纤维的代表性扫描电镜(SEM)显微照片如图所示 图1B 表明所制备的PLGA支架由无纺纤维构成,纤维呈纳米级尺寸,且极少出现串珠状结构或断裂。 图1C 证明在PLGA溶液中以5 mg/mL的浓度添加纳米传感器后,所得纤维与对照样品相当 图1B扫描电镜显微照片提供了纳米传感器与纤维表面结合的证据,但纳米传感器也可能被包埋在支架纤维内部。可结合扫描电镜和/或共聚焦显微镜对这些支架/纳米传感器复合支架进行降解研究,以确定其对纳米传感器性能的影响。
通过共...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
组织工程旨在创造可用于替代的生物替代物,既可作为 体内 像 体外 组织模型及在组织替代疗法中用于修复、替换、维持或增强特定组织或器官的功能。多年来,人们一直使用合成替代物来替代或辅助修复受损组织,但这些材料常因与宿主组织整合不良和/或发生感染而失败,最终导致排斥反应或需要再次手术。在植入前于实验室中构建活体组织,可能有助于实现完全整合,并减少再次手术的需求。然而,要实现这一目标,必须具备适当的 体外 在三维结构中细胞的扩增与操控应与组织的适当物理刺激相结合 体外这可以通过多种方式实现,其中之一是继续深入研究相关的基本生物学问题,同时开展针对合成替代物生产过程中所涉及的工程与制造问题的研究。本方案旨在为后一问题的解决做出贡献。
所述PLGA支架的预期用途是为哺乳动物细胞提供临时支撑,以协助其生长形成具有生物学意义的结构。将分析物响应型纳米传感器整合入PLGA支架中,可在组织生长过程中实时监测三维结构内局部分析物的浓度变化。采用pH响应型支架可判断支架降解和细胞生长过程中产生的酸性副产物是否被有效清除出三维结构内部...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
感谢英国生物技术和生物科学研究理事会(BBSRC)的资助(资助编号 BB H011293/1)。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 | Fisher | 32221 | |
| 无水二甲基甲酰胺(DMF) | Sigma | 270547 | |
| 50%(v/v)氨水溶液 | Alfa Aesar | 35574 | 用纯水稀释至30%(v/v) |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(和6-)羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| 磷酸二氢钠(0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| 磷酸氢二钠(0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| OptiMem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| 氮气 | BOC | ||
| 二氯甲烷(DCM) | Sigma Aldrich | 320269 | |
| 三氟乙酸(TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS-SP | 配备氩离子和氪离子激光器以及63X 0.9NA水浸物镜 | |
| 紫外光源 | UVLS28 UVP, USA | ||
| 磁力搅拌器 | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH计 | Jenway model 3510 | ||
| 旋转蒸发仪 | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| 离心机(纳米传感器用) | Hermle Z300 | ||
| 离心机(细胞培养用) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| 涡旋振荡器 | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| 超声破碎仪 | FB11021 Fisherbrand | ||
| 铝箔 | 诺丁汉大学 | ||
| 35 mm细胞培养皿 | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml注射器 | Becton Dickenson | ||
| 3T3成纤维细胞 | 欧洲细胞培养物保藏中心 | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| 甲酸吡啶鎓 | Sigma Aldrich | P8535 | |
| 台盼蓝 | Sigma Aldrich | T8154 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma Aldrich | S9638 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可