用于三维细胞培养的自报告支架

摘要

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位 在支架上进行细胞培养时对微环境条件进行监测。这种方法的优势在于，可在不干扰实验的情况下对三维细胞结构进行实时监测。

摘要

在合适的支架上以三维形式培养细胞被认为能更好地模拟 体内 微环境并增强细胞间相互作用。所形成的三维细胞结构在研究分子事件和细胞间相互作用方面，通常比二维条件下的类似实验更具相关性。为了在整个支架中实现具有高细胞活力的有效三维培养，必须严格控制培养条件（如氧气和pH），因为在三维结构内部可能存在分析物浓度梯度。本文描述了制备生物相容性pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器的方法，及其与聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架的整合过程，以及后续用于哺乳动物细胞培养的准备步骤。这种pH响应型支架可作为工具，用于测定三维细胞结构内的微环境pH值。此外，我们详细介绍了将pH响应型纳米传感器递送至由电纺PLGA支架支持生长的哺乳动物细胞胞内环境的方法。这些位于细胞质中的pH响应型纳米传感器可用于在实验过程中实时监测细胞内pH（pHi）。

引言

组织工程中的一个关键策略是使用生物相容性材料制备支架，其形态需类似于待替换的组织，并能够支持细胞的生长和功能^1,2。支架通过促进细胞黏附和增殖提供机械支撑，同时允许细胞在三维细胞结构的孔隙中迁移。支架还必须允许细胞营养物质的质量传递，并不妨碍代谢废物的排出³。

静电纺丝已成为一种有前景的聚合物支架制备方法，能够支持细胞生长^4-6。所生成的无纺静电纺丝纤维适合细胞生长，因其通常具有多孔结构，可促进细胞间相互作用以及细胞在三维细胞构建体间隙中的迁移⁷。在培养期间监测细胞活力，并确保整个三维构建体中细胞活力得以维持，具有重要意义。例如，氧浓度和pH等培养条件需严格控制，因为在三维构建体内可能存在分析物浓度梯度。可采用生物反应器或灌注系统来模拟in vivo的间质流条件，从而增强营养物质传递和代谢废物清除⁸。通过实时评估细胞微环境，可回答此类系统是否能够确保稳定的微环境条件这一问题。

可实时监测的关键微环境参数包括：温度、细胞培养基的化学成分、溶解氧和二氧化碳浓度、pH 值以及湿度。在这些参数中，温度最易于通过in situ探针进行监测。对于其余所列参数的监测方法通常需要取出部分样品，因而会干扰细胞培养并增加污染风险。目前正致力于开发连续、实时的监测方法。现有的监测手段通常依....

方案

概述

第1节描述了pH响应型纳米传感器的制备，以及利用荧光光谱法表征纳米传感器对pH的响应，并通过扫描电镜（SEM）表征其尺寸。

第2节描述了静电纺丝聚合物支架的制备，以及利用扫描电子显微镜（SEM）对其形貌和尺寸进行表征。第2节还介绍了自报告支架的制备，即在静电纺丝支架中引入pH响应型纳米传感器所形成的支架。通过SEM对所得的自报告支架进行表征，以评估静电纺丝纤维是否发生任何形态学变化。通过共聚焦显微镜评估由所掺入纳米传感器产生的自报告支架的荧光信号。

第3节描述了在电纺支架和自报告支架上进行细胞培养的方法。首先对支架进行灭菌处理，以备细胞培养使用；随后评估支架，以确定灭菌过程以及细胞培养是否会影响自报告支架的荧光性能。该方案还介绍了将纳米传感器递送至生长在电纺支架上的细胞的方法。使用溶酶体示踪染料（Lysotracker dye）确认纳米传感器未被摄入细胞的酸性区室中。

1. pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备与分析

1.1 pH 响应性溶胶-凝胶纳米传感器的制备

注意：该步骤应在通风橱中进行。

1. 在圆底烧瓶中，将5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（FAM-SE）（1.5 mg）....

结果

所制备的pH响应型纳米传感器的粒径分布通过扫描电镜（SEM）进行表征，对成像的纳米传感器群体进行测量，发现其纳米尺寸范围为240–470 nm图1A）。获得较窄且相对较小的直径与采用Stöber法制备纳米颗粒的结果一致。研究发现，在纳米颗粒合成过程中使用碱性pH环境 即 采用Stöber法制备的纳米颗粒可较好地控制粒径，而在酸性条件下制备则导致粒径分布较宽。采用所述方法制备的PLGA电纺纤维的代表性扫描电镜（SEM）显微照片如图所示 图1B 表明所制备的PLGA支架由无纺纤维构成，纤维呈纳米级尺寸，且极少出现串珠状结构或断裂。 图1C 证明在PLGA溶液中以5 mg/mL的浓度添加纳米传感器后，所得纤维与对照样品相当 图1B扫描电镜显微照片提供了纳米传感器与纤维表面结合的证据，但纳米传感器也可能被包埋在支架纤维内部。可结合扫描电镜和/或共聚焦显微镜对这些支架/纳米传感器复合支架进行降解研究，以确定其对纳米传感器性能的影响。

通过共.......

讨论

组织工程旨在创造可用于替代的生物替代物，既可作为 体内 像 体外 组织模型及在组织替代疗法中用于修复、替换、维持或增强特定组织或器官的功能。多年来，人们一直使用合成替代物来替代或辅助修复受损组织，但这些材料常因与宿主组织整合不良和/或发生感染而失败，最终导致排斥反应或需要再次手术。在植入前于实验室中构建活体组织，可能有助于实现完全整合，并减少再次手术的需求。然而，要实现这一目标，必须具备适当的 体外 在三维结构中细胞的扩增与操控应与组织的适当物理刺激相结合 体外这可以通过多种方式实现，其中之一是继续深入研究相关的基本生物学问题，同时开展针对合成替代物生产过程中所涉及的工程与制造问题的研究。本方案旨在为后一问题的解决做出贡献。

所述PLGA支架的预期用途是为哺乳动物细胞提供临时支撑，以协助其生长形成具有生物学意义的结构。将分析物响应型纳米传感器整合入PLGA支架中，可在组织生长过程中实时监测三维结构内局部分析物的浓度变化。采用pH响应型支架可判断支架降解和细胞生长过程中产生的酸性副产物是否被有效清除出三维结构内部.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	Fisher	32221
无水二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma	270547
50%（v/v）氨水溶液	Alfa Aesar	35574	用纯水稀释至30%（v/v）
TEOS	Sigma	13190-3
3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）	Sigma	A3648
5-（和6-）羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（FAM-SE）	Invitrogen	C1311
6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯（TAMRA-SE）	Invitrogen	C1171
磷酸二氢钠（0.2 M）	Sigma Aldrich	S-9638
磷酸氢二钠（0.2 M）	Sigma Aldrich	S-0876
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
胰蛋白酶/EDTA	Sigma Aldrich	T4174
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P0781
PBS	Sigma Aldrich	D8537
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
FBS	Source Bioscience	Batch-213-101992
L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
OptiMem	Invitrogen	11058-021
LysoTracker Red	Invitrogen	L-7528
Draq5	Biostatus Ltd	DR50050
氮气	BOC
二氯甲烷（DCM）	Sigma Aldrich	320269
三氟乙酸（TFA）	Sigma Aldrich	T6508
共聚焦显微镜	Leica TCS-SP		配备氩离子和氪离子激光器以及63X 0.9NA水浸物镜
紫外光源	UVLS28 UVP, USA
磁力搅拌器	SB161-3 Jencons-PLS
pH计	Jenway model 3510
旋转蒸发仪	Buchi Rotary Evaporator R200
离心机（纳米传感器用）	Hermle Z300
离心机（细胞培养用）	Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
涡旋振荡器	Whirlimixer Fisherbrand
超声破碎仪	FB11021 Fisherbrand
铝箔	诺丁汉大学
35 mm细胞培养皿	Iwaki	3000035
10 ml注射器	Becton Dickenson
3T3成纤维细胞	欧洲细胞培养物保藏中心
PLGA	Lakeshore Biomaterials	7525 DLG 7E
甲酸吡啶鎓	Sigma Aldrich	P8535
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S9638
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S5136
HCl	Sigma Aldrich	320331