方法文章

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

DOI：

10.3791/50615

⸱

2013年9月3日

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1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

通讯作者： Wolfgang E. Thasler <Wolfgang.Thasler@med.uni-muenchen.de>

本文内容

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摘要

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本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。

摘要

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肝脏是一种具有卓越再生能力的器官，执行多种功能，如解毒、代谢和维持内环境稳定。因此，肝细胞是大量研究问题的重要模型。特别是人肝细胞在药代动力学、毒理学、肝脏再生及转化医学研究领域尤为重要。本方法介绍了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离肝细胞，该方法由 Seglen 1 首次描述。

既往，肝细胞的分离主要采用机械法。然而，研究表明酶消化法更具优势，因为分离后的肝细胞能够保持其结构完整性和功能。本文所述方法借鉴了先前用于大鼠肝脏的分离技术，并将其改进应用于人肝组织，可获得大量活性达77±10%的肝细胞。该方法的主要差异在于血管插管的操作过程。此外，本方法也可推广应用于其他物种的肝脏，只要其肝脏或血管尺寸与人肝相近即可。

引言

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可通过机械法或酶解法从肝脏制备肝细胞悬液。用于制备完整肝细胞的机械法包括将肝脏强行挤压通过纱布 2，将肝组织块与玻璃珠在Kahn振荡器中振荡 3，使用带有松散研杵的玻璃匀浆器 4,5 等等。 多年来，机械法因会造成细胞膜损伤以及分离出的肝细胞功能丧失而逐渐不再受青睐 6,7因此，目前酶消化法是分离肝细胞的主要方法。

Berry 和 Friend8通过门静脉向大鼠肝脏灌注胶原酶和透明质酸酶，利用酶解法分离肝细胞，使该方法得到显著改进。这种灌注过程利用肝脏血管系统，使酶能够与大多数细胞密切接触，从而使肝细胞的得率提高了6倍8。此外，该方法获得的细胞保持了其结构完整性，内质网几乎未转化为游离囊泡，且无线粒体损伤8。

该方法由Seglen进行了改进1，他首创了一种两步灌注法用于肝细胞的分离。在此方法中，先用无Ca2+的缓冲液灌注大鼠肝脏，随后用含Ca2+的胶原酶缓冲液进行灌注1。第一步去除Ca2+有助于破坏桥粒结构，而第二步加入Ca2+则是胶原酶发挥最佳活性所必需的1,9。

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方案

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1. 灌注液与分离液的制备

  1. 根据表1配制肝脏组织灌流和肝细胞分离所需的溶液。溶液可保存在4 °C直至使用。
  2. 使用0.22 μm滤器对所有溶液进行无菌过滤。
  3. 所有与肝脏接触的溶液均应保持无菌。

2. 灌注设备与溶液的准备

  1. 肝脏组织灌注设备的安装应如图1所示。
  2. 水浴温度应根据具体实验条件设定为适当温度，以确保溶液到达肝脏组织时温度为37 °C。本实验中，水浴设定为41 °C，用于加热溶液1、2、3以及夹套玻璃冷凝器。溶液4应于另一独立水浴中预热至37 °C后再使用，以减少胶原酶活性的损失。
  3. 肝脏灌注开始前不久，打开装有95% O2/5% CO2混合气体的气瓶调节阀，向氧合装置通气（图1E）。

3. 肝脏灌注

  1. 应从病理学家处获取一块尽可能保留完整格利森囊、理想情况下仅有一个切面的肝组织用于灌注。
  2. 将该肝组织置于含有带孔滤膜的布氏漏斗中（图1B）。
  3. 使用溶液1对灌注系统进行预冲。
  4. 以低流速将带有橄榄状尖端的弯头灌注套....

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结果

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灌注装置设置

应根据图1设置肝脏灌注所需的设备。

人肝细胞分离后的存活率与得率

分离的人肝细胞平均存活率为77±10%，肝细胞平均得率为13±11×10⁶个肝细胞/克肝脏，数值以均值±标准差表示。获得上述平均值所依据的肝细胞分离实验共648次，时间为1999年1月至2012年12月。

合适的灌注参数

为了成功完成肝脏的灌注和冲洗，所使用的套管数量应根据肝脏的重量进行调整（图2A）。一般来说，对于重量在20 g以下至80 g以上的肝脏，应使用4-8根套管。应根据肝脏重量选择合适的灌注速率，以实现成功的肝脏灌注（图2B 和 C）。研究发现，平均灌注速度为 44 ml/min 的导管-1 适用于不同肝脏重量，因此若使用更多导管，应.......

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讨论

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本方案可分离获得高活力和高纯度的人肝细胞。为达到此效果，起始所用肝组织必须合适。肝组织应除一个切割面外，其余各表面均保留完整的格利森囊。另一个重要因素是所用胶原酶的批次，不同批次的胶原酶消化后所得肝细胞的活力可能存在显著差异11。因此，应预先测试不同批次的胶原酶，并大量获取能产生最高细胞活力的批次。最后，需根据所获细胞的产量和活力确定合适的消化时间。例如，高活力但低产量可能提示消化时间不足，而高产量但低活力则可能表明消化时间过长。

该方法可进行调整，以从同一块肝脏组织中分离出非实质细胞和肝细胞。一种方法是直接利用第一次离心步骤（步骤 4.6）后的上清液进行非实质细胞的分离12。另一种方法是在经尼龙网过滤后（步骤 4.5），取出用于肝细胞分离所需的细胞悬液等分试样，然后将剩余的细胞悬液进行额外的蛋白酶消化步骤，再进行非实质细胞分离，以提高非实质细胞的得率13。若希望以牺牲肝细胞产量为代价获得更高产量的非实质细胞，可对该方法进行修改：在步骤 3.10 中仅使用胶原酶而不使用蛋白酶和胶原酶联合消化，并将所得的细胞悬液用于非.......

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披露

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本方案的优化工作部分由Hepacult GmbH提供的资助支持。Wolfgang Thasler博士是Hepacult GmbH的创始人之一，并仍担任该公司董事会成员。Maresa Demmel的部分工作由Hepacult资助。Maria Hauner受雇于Hepacult GmbH。Hepacult是该大学衍生出的一家生物技术公司，提供经知情同意且开放获取的人肝细胞，用于科研目的。

致谢

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本研究得益于人体组织与细胞研究基金会，该基金会为科研提供了人体组织。本工作的经费由联邦教育与研究部（项目名称：虚拟肝脏网络，项目编号：0315759）和Hepacult有限公司提供支持。我们还要感谢格罗斯哈德恩医院组织库的技术助理采集肝脏样本，以及细胞分离核心设施的技术助理完成肝脏灌注和肝细胞分离工作。特别感谢Natalja Löwen在视频中演示了该实验操作。最后，我们感谢Natalja Löwen和Edeltraud Hanesch为图1及视频示意图中的各图绘制插图。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
气泡捕集器Gaßner Glastechnik 
玻璃夹套冷凝管Gaßner Glastechnik 
41 °C 水浴锅Julabo35723-H24/EG 
37 °C 水浴锅GFL1083 
压缩气体钢瓶（95% O2/5% CO2）Linde 
透气性导管Neolab2-4440 
蠕动泵IsmatecIP65 
手术刀Feather320010 
镊子Omnilab5171014 
1 L 锥形瓶Schott Duran2121654 
5 L 锥形瓶Schott Duran2121673 
烧杯Schott Duran2110654 
200 ml 离心管Becton Dickinson352075 
结晶皿Omnilab5144063 
带球头的弯头灌注套管Ernst Kratz GmbH1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL 
微血管夹Ernst Kratz GmbH 
Büchner 漏斗Carl RothHT38.1 
210 μm 尼龙筛网Neolab4-1413 
70 μm 尼龙筛网Neolab4-1419 
0.22 μm 无菌滤器Peske99505 
500 ml 瓶Schott Duran2180144 
1 L 瓶Schott Duran2180154 
血细胞计数板Peske06-0001 
1.5 ml 管Eppendorf0030 120,086 
50 ml 锥形管BD Biosciences352070 
冰桶Neolab1508454 
无菌巴斯德移液管Brand747715 
电动移液器（Pipette boy acu）Integra155017 
制冷离心机Eppendorf5810R 
层流柜KendroHera safe-KS9 
吸引器（低流量手术抽吸泵）AtmosC361 
实验室燃气灯IntegraFire Boy eco 
一次性实验服Paperlynen GmbHMD0202414 
带面罩的外科口罩Kimberly-Clark48247 
外科头罩Barrier42072 
乳胶手套Semper CareCE0321 
胶原酶（批号 NB 4G）Serva17465 
二水合氯化钙Merck2382 
EGTASigmaE4378 
氯化钠Roth9265.2 
HepesRoth9105.3 
氯化钾Serva26868 
白蛋白Biomol01400-2 
葡萄糖Serva22700 
碳酸氢钠Serva30180 
0.4% 台盼蓝溶液Lonza17-942E 
冷保存液Hepacult GmbH 

参考文献

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  1. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  2. Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem.

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA 0.1mM

to:

EGTA 1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate 0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate 5mM

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Glisson

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