本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。
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摘要
摘要
肝脏是一种具有卓越再生能力的器官，执行多种功能，如解毒、代谢和维持内环境稳定。因此，肝细胞是大量研究问题的重要模型。特别是人肝细胞在药代动力学、毒理学、肝脏再生及转化医学研究领域尤为重要。本方法介绍了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离肝细胞，该方法由 Seglen 1 首次描述。
既往，肝细胞的分离主要采用机械法。然而，研究表明酶消化法更具优势，因为分离后的肝细胞能够保持其结构完整性和功能。本文所述方法借鉴了先前用于大鼠肝脏的分离技术，并将其改进应用于人肝组织，可获得大量活性达77±10%的肝细胞。该方法的主要差异在于血管插管的操作过程。此外，本方法也可推广应用于其他物种的肝脏，只要其肝脏或血管尺寸与人肝相近即可。
引言
可通过机械法或酶解法从肝脏制备肝细胞悬液。用于制备完整肝细胞的机械法包括将肝脏强行挤压通过纱布 2，将肝组织块与玻璃珠在Kahn振荡器中振荡 3，使用带有松散研杵的玻璃匀浆器 4,5 等等。 多年来，机械法因会造成细胞膜损伤以及分离出的肝细胞功能丧失而逐渐不再受青睐 6,7因此，目前酶消化法是分离肝细胞的主要方法。
Berry 和 Friend8通过门静脉向大鼠肝脏灌注胶原酶和透明质酸酶，利用酶解法分离肝细胞，使该方法得到显著改进。这种灌注过程利用肝脏血管系统，使酶能够与大多数细胞密切接触，从而使肝细胞的得率提高了6倍8。此外，该方法获得的细胞保持了其结构完整性，内质网几乎未转化为游离囊泡，且无线粒体损伤8。
该方法由Seglen进行了改进1，他首创了一种两步灌注法用于肝细胞的分离。在此方法中，先用无Ca2+的缓冲液灌注大鼠肝脏，随后用含Ca2+的胶原酶缓冲液进行灌注1。第一步去除Ca2+有助于破坏桥粒结构，而第二步加入Ca2+则是胶原酶发挥最佳活性所必需的1,9。
鉴于上述已发表的研究工作均在大鼠中进行，本文旨在展示一种经过改进的操作流程，可用于从人肝脏中分离出高活力的肝细胞。使用人肝细胞对于转化医学研究以及验证基于动物模型的实验结果仍然具有重要意义。本研究中使用的人肝组织均通过人类组织与细胞研究基金会（Human Tissue and Cell Research Foundation）的伦理审批获取，该基金会为政府监管下的非营利性机构10。在病理学家取走用于诊断所需的组织后，从剩余组织中收集肝组织样本。病理学家所切取的组织为肝脏切除术后切除边缘的形态学上健康的组织。
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方案
1. 灌注液与分离液的制备
- 根据表1配制肝脏组织灌流和肝细胞分离所需的溶液。溶液可保存在4 °C直至使用。
- 使用0.22 μm滤器对所有溶液进行无菌过滤。
- 所有与肝脏接触的溶液均应保持无菌。
2. 灌注设备与溶液的准备
- 肝脏组织灌注设备的安装应如图1所示。
- 水浴温度应根据具体实验条件设定为适当温度，以确保溶液到达肝脏组织时温度为37 °C。本实验中，水浴设定为41 °C，用于加热溶液1、2、3以及夹套玻璃冷凝器。溶液4应于另一独立水浴中预热至37 °C后再使用，以减少胶原酶活性的损失。
- 肝脏灌注开始前不久，打开装有95% O2/5% CO2混合气体的气瓶调节阀，向氧合装置通气（图1E）。
3. 肝脏灌注
- 应从病理学家处获取一块尽可能保留完整格利森囊、理想情况下仅有一个切面的肝组织用于灌注。
- 将该肝组织置于含有带孔滤膜的布氏漏斗中（图1B）。
- 使用溶液1对灌注系统进行预冲。
- 以低流速将带有橄榄状尖端的弯头灌注套管插入肝组织切面上较大的血管中。随着血液从肝脏中冲洗出来，在灌注良好的区域组织颜色会变浅。不同大小肝脏所使用的套管数量见图2A。所选套管规格应能紧密贴合血管，以确保套管固定到位。较小的血管应保持开放，以便灌注缓冲液从肝组织中流出。
- 根据肝脏大小，将蠕动泵的流速提高至110–460 ml/min之间（图2B），平均每根套管流速为44±16 ml/min（图2C）。具体流速选择应根据肝组织情况而定，以使肝组织出现轻微膨胀为宜。在某些情况下，可能需要使用微血管夹闭合部分开放的血管，以实现上述轻微膨胀效果。当整个肝组织颜色明显变浅时，表明灌注效果良好。
- 灌注过程中应用浸有生理盐水的纱布覆盖肝组织，以保持其湿润。
- 用1 L溶液1进行灌注，以彻底冲洗出肝组织中残留的血液。
- 更换灌注液为溶液2，继续灌注10分钟。
- 切换灌注液为溶液3，灌注0.5 L。
- 更换灌注液为含0.1–0.15%胶原酶的溶液4（表2）。
- 此步骤应采用循环灌注方式持续9–12分钟，或直至肝脏消化充分；此时肝组织在格利森囊下应呈现轻微裂解，并在用手术刀钝端探查时感觉质地变软。
4. 肝细胞的分离
- 关闭蠕动泵，并将导管从肝组织中取出。
- 将肝组织放入含有 100–200 ml 溶液 5 的结晶皿中。
- 小心去除格利森氏囊，并轻轻振荡以释放细胞。若存在灌注不良的区域，可使用手术刀切开这些区域，以释放其中的细胞。在操作过程中根据需要添加更多的溶液 5。
- 继续添加溶液 5，直至总体积达到 500 ml。
- 将细胞悬液过滤两次：首先通过 210 μm 尼龙筛网，然后通过 70 μm 尼龙筛网。接着，将细胞悬液倒入 200 ml 离心管中。
- 在 4 °C 条件下，以 72 g 离心 5 分钟。吸除上清液，并在 200 ml 溶液 5 中轻柔重悬细胞沉淀。
- 重复步骤 4.6 的洗涤操作共三次。最后一次离心后，将细胞重悬于冷保存液中（见材料列表）。用于台盼蓝排斥法检测细胞得率和活力时，细胞浓度应约为每毫升 200 万至 500 万个肝细胞。
- 进行台盼蓝排斥法检测时，取适量稀释的细胞悬液（约 200 万至 500 万个细胞/ml）0.1 ml，加入含有 0.5 ml 台盼蓝溶液（0.4% 台盼蓝溶于磷酸盐缓冲液（PBS））和 0.4 ml PBS 的微量离心管中。充分混匀细胞悬液后，取少量加载至血细胞计数板，在显微镜下以 100 倍放大观察。在显微镜下，死细胞被染成蓝色，而活细胞则未着色。计数血细胞计数板上每个 1 mm2 网格内的活细胞数和总细胞数。可通过以下公式计算细胞活力（%）、活细胞得率（每毫升冷保存液中的百万肝细胞数，或每克肝脏组织中的百万肝细胞数）。
注：本例中，台盼蓝稀释倍数为10，血细胞计数板校正因子为10,000。
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结果
灌注装置设置
应根据图1设置肝脏灌注所需的设备。
人肝细胞分离后的存活率与得率
分离的人肝细胞平均存活率为77±10%，肝细胞平均得率为13±11×10⁶个肝细胞/克肝脏，数值以均值±标准差表示。获得上述平均值所依据的肝细胞分离实验共648次，时间为1999年1月至2012年12月。
合适的灌注参数
为了成功完成肝脏的灌注和冲洗，所使用的套管数量应根据肝脏的重量进行调整（图2A）。一般来说，对于重量在20 g以下至80 g以上的肝脏，应使用4-8根套管。应根据肝脏重量选择合适的灌注速率，以实现成功的肝脏灌注（图2B 和 C）。研究发现，平均灌注速度为 44 ml/min 的导管-1 适用于不同肝脏重量，因此若使用更多导管，应...
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讨论
本方案可分离获得高活力和高纯度的人肝细胞。为达到此效果，起始所用肝组织必须合适。肝组织应除一个切割面外，其余各表面均保留完整的格利森囊。另一个重要因素是所用胶原酶的批次，不同批次的胶原酶消化后所得肝细胞的活力可能存在显著差异11。因此，应预先测试不同批次的胶原酶，并大量获取能产生最高细胞活力的批次。最后，需根据所获细胞的产量和活力确定合适的消化时间。例如，高活力但低产量可能提示消化时间不足，而高产量但低活力则可能表明消化时间过长。
该方法可进行调整，以从同一块肝脏组织中分离出非实质细胞和肝细胞。一种方法是直接利用第一次离心步骤（步骤 4.6）后的上清液进行非实质细胞的分离12。另一种方法是在经尼龙网过滤后（步骤 4.5），取出用于肝细胞分离所需的细胞悬液等分试样，然后将剩余的细胞悬液进行额外的蛋白酶消化步骤，再进行非实质细胞分离，以提高非实质细胞的得率13。若希望以牺牲肝细胞产量为代价获得更高产量的非实质细胞，可对该方法进行修改：在步骤 3.10 中仅使用胶原酶而不使用蛋白酶和胶原酶联合消化，并将所得的细胞悬液用于非...
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披露
本方案的优化工作部分由Hepacult GmbH提供的资助支持。Wolfgang Thasler博士是Hepacult GmbH的创始人之一，并仍担任该公司董事会成员。Maresa Demmel的部分工作由Hepacult资助。Maria Hauner受雇于Hepacult GmbH。Hepacult是该大学衍生出的一家生物技术公司，提供经知情同意且开放获取的人肝细胞，用于科研目的。
致谢
本研究得益于人体组织与细胞研究基金会，该基金会为科研提供了人体组织。本工作的经费由联邦教育与研究部（项目名称：虚拟肝脏网络，项目编号：0315759）和Hepacult有限公司提供支持。我们还要感谢格罗斯哈德恩医院组织库的技术助理采集肝脏样本，以及细胞分离核心设施的技术助理完成肝脏灌注和肝细胞分离工作。特别感谢Natalja Löwen在视频中演示了该实验操作。最后，我们感谢Natalja Löwen和Edeltraud Hanesch为图1及视频示意图中的各图绘制插图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气泡捕集器 | Gaßner Glastechnik | ||
| 玻璃夹套冷凝管 | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C 水浴锅 | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C 水浴锅 | GFL | 1083 | |
| 压缩气体钢瓶（95% O2/5% CO2） | Linde | ||
| 透气性导管 | Neolab | 2-4440 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | IP65 | |
| 手术刀 | Feather | 320010 | |
| 镊子 | Omnilab | 5171014 | |
| 1 L 锥形瓶 | Schott Duran | 2121654 | |
| 5 L 锥形瓶 | Schott Duran | 2121673 | |
| 烧杯 | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml 离心管 | Becton Dickinson | 352075 | |
| 结晶皿 | Omnilab | 5144063 | |
| 带球头的弯头灌注套管 | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| 微血管夹 | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner 漏斗 | Carl Roth | HT38.1 | |
| 210 μm 尼龙筛网 | Neolab | 4-1413 | |
| 70 μm 尼龙筛网 | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm 无菌滤器 | Peske | 99505 | |
| 500 ml 瓶 | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L 瓶 | Schott Duran | 2180154 | |
| 血细胞计数板 | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml 管 | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml 锥形管 | BD Biosciences | 352070 | |
| 冰桶 | Neolab | 1508454 | |
| 无菌巴斯德移液管 | Brand | 747715 | |
| 电动移液器（Pipette boy acu） | Integra | 155017 | |
| 制冷离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 层流柜 | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| 吸引器（低流量手术抽吸泵） | Atmos | C361 | |
| 实验室燃气灯 | Integra | Fire Boy eco | |
| 一次性实验服 | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| 带面罩的外科口罩 | Kimberly-Clark | 48247 | |
| 外科头罩 | Barrier | 42072 | |
| 乳胶手套 | Semper Care | CE0321 | |
| 胶原酶（批号 NB 4G） | Serva | 17465 | |
| 二水合氯化钙 | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| 氯化钠 | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| 氯化钾 | Serva | 26868 | |
| 白蛋白 | Biomol | 01400-2 | |
| 葡萄糖 | Serva | 22700 | |
| 碳酸氢钠 | Serva | 30180 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Lonza | 17-942E | |
| 冷保存液 | Hepacult GmbH |
参考文献
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222(2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).
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申请许可勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |