培养来自新生期和成年中枢神经系统的小胶质细胞

摘要

我们概述了从新生小鼠大脑皮层和成年小鼠脊髓中高效、快速分离和培养活体小胶质细胞的方法。皮层小胶质细胞的解剖与接种可在90分钟内完成，初次解剖后约10天可进行后续的小胶质细胞收获。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的巨噬细胞样细胞，因此在生理和病理过程中具有至关重要的作用，例如发育过程中的CNS成熟、多发性硬化症以及脊髓损伤。当神经元受到损伤或刺激时，例如在多发性硬化症中观察到的轴突损伤或中风引起的缺血性脑损伤，小胶质细胞可被激活并募集参与反应。这些具有免疫活性的CNS细胞还被认为在非病理条件下参与突触可塑性。我们采用从新生期和成年组织中培养小胶质细胞的实验方案，旨在最大化活细胞数量的同时，尽量减少混杂因素，例如其他CNS细胞类型的存在以及细胞培养中的碎片。我们使用体积较大且易于识别的CNS结构（例如 皮层、脊髓节段），从而使整个过程具有可行性与可重复性。使用成年细胞是替代新生脑小胶质细胞的合适选择，因为许多被研究的病理主要影响出生后的脊髓。这些培养系统还可用于直接检测可能抑制或促进小胶质细胞激活的化合物的作用。由于小胶质细胞的激活可影响成年CNS中疾病的进程，因此有必要建立体外系统，用于培养和研究新生期与成年期的小胶质细胞。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，其结构和功能最接近外周巨噬细胞¹。最近研究表明，出生后的小胶质细胞来源于原始髓系前体细胞，并在胚胎发育第八天之前即已生成，这一发现颠覆了以往认为出生后的造血前体细胞是成年大脑中小胶质细胞来源的观点²。小胶质细胞在多种神经系统疾病中发挥关键作用，能够通过释放促炎性或抗炎性细胞因子快速响应感染或损伤³。因此，小胶质细胞构成了中枢神经系统中一个独立的功能单元，可通过干预调控疾病进程。建立稳定且可重复的新生期或成年小胶质细胞分离与培养方法，对未来的研究具有重要意义。

小胶质细胞已被证实是多种脑部病理过程中的关键参与者。近年来研究发现，小胶质细胞在正常脑发育和功能中也发挥着重要作用，例如通过吞噬海马齿状回中过量的神经前体细胞 ^{1, 4}小胶质细胞还可调节多种影响脊髓的神经系统疾病，例如多发性硬化症（MS）、神经病理性疼痛和脊髓损伤。 ^5-7脊髓小胶质细胞与脑小胶质细胞在响应激活信号时表现出不同的反应 ^{8, 9}，可能是由于局部环境的差异所致。因此，建立一个合适的 体外 用于培养和研究脊髓小胶质细胞的系统。新生小胶质细胞在受到刺激后产生的促炎性细胞因子一氧化氮显著多于成年细胞 体外 使用 IFN-γ 或 TNF-α 刺激^10,11 进一步凸显了在特定疾病....

方案

1. 解剖（第0天）

1. 通过低温诱导 p0-2 小鼠幼崽麻醉。用浸有 70% 乙醇的 Kimwipe 擦拭幼崽头部，以消毒组织。
2. 使用剪刀去除头部，每 10 cm 培养皿使用 4 只幼崽。将头部置于含有冰冻 Hank's 缓冲液的培养皿中。
3. 使用弯头镊子穿过眼眶固定头部，并用直头显微镊小心去除覆盖颅骨的皮肤。
4. 用直头显微镊去除颅骨，注意避免刺破或损伤大脑皮层。最有效的方法是从靠近位于头部基部的小脑区域开始去除，因为该区域将被弃去。
5. 用小刮勺取出脑组织，并将（4 只）脑组织放入盛有冰冻 Hank's 缓冲液的新培养皿中。
6. 从此时起的所有步骤均使用显微镊，并在解剖显微镜下操作。从脑腹侧开始，通过夹住小脑固定组织，在中脑两侧各做两个小切口。注意不要完全切断组织，因为在此区域皮层覆盖中脑。
7. 轻柔地将中脑和小脑作为一个整体从两侧皮层中分离出来。两个皮层应呈凹面形状。
8. 分开两个皮层，将其中一个皮层内侧朝上放置，以便进一步解剖。海马体可能难以观察，但它位于嗅球的对侧，嗅球表现为皮层尖端的一个小结节。
9. 去除呈新月形的海马体。翻转皮层以观察其背侧。
10. 以嗅球为起点，从皮层上去除所有脑膜以及嗅球本身。
11. 解剖好的皮层应放入含有 14 ml 冰冷 Hank's 缓冲盐水的 15 ml 锥形管中。

结果

静息状态和活化状态的小胶质细胞示例见图1。接种后24小时观察小胶质细胞（图1a），呈现分支状（静息）形态。经细菌脂多糖（LPS）这一启动试剂处理后，小胶质细胞形态发生改变，细胞被激活（图1b）。

接种细胞计数的示例如图2所示。由于存在细胞碎片，将DAPI Fluoromount（而非台盼蓝）与等体积的细胞悬液混合后，加入血细胞计数板进行细胞计数，方法见文献^{4, 13}。使用荧光显微镜观察DAPI阳性细胞。采用明场模式有助于准确计数存在的细胞（图2）。每只小鼠脊髓可获得约7×10⁵个细胞。

将细胞接种于PDL包被的35 × 10 mm组织培养皿中。我们发现PDL包被是关键步骤，因为若培养皿未包被，细胞无法贴壁和生长。小胶质细胞在培养约两天后可完全贴附于培养皿表面（图3）。本实验使用了Ma.......

讨论

小胶质细胞不仅调节中枢神经系统的正常功能，还参与对多种病理状态的炎症反应。小胶质细胞通过功能性突触重塑在维持大脑正常稳态中发挥重要作用¹⁵。在神经发生级联过程中，它们参与清除海马齿状回中的神经前体细胞^{4, 16}。因此，有必要建立一种可用于研究新生期和成年期小胶质细胞的培养体系，以覆盖从发育到成年整个过程中小胶质细胞所承担的多种不同功能。我们提出了一种快速且高效的方法，用于从成年脊髓和新生脑组织中培养小胶质细胞。在成年组织中获得的细胞悬液中，小胶质细胞占比达70%，其余主要为星形胶质细胞；而新生小胶质细胞培养物的纯度接近100%。

鉴于星形胶质细胞在调控小胶质细胞活化状态中的作用^17-19，优化培养条件以提高培养物纯度显得尤为重要。尽管将细胞悬液与等体积的DAPI Fluoromount混合可实现准确的细胞计数，但该方法无法区分小胶质细胞与其他细胞类型。为了提高成年小胶质细胞制备的纯度，可将来源于MacGreen小鼠的细胞悬液与表达GFP的髓系细胞共同孵育GFP包被的Dynabeads²⁰。另一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EDTA，5 mM	Invitrogen	15567-028
利多卡因，60 mM	Sigma	L-5647
台盼蓝	Sigma	T8154
胰蛋白酶/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM，1×	Cellgro	10-017
丙酮酸钠	Cellgro	25-000-Cl
硫酸庆大霉素	Biowittaker	17-518Z
35 × 10 mm 组织培养皿	Falcon	353001
多聚-D-赖氨酸，100 μg/mL			按1:20稀释
HBSS，1×	Cellgro	20-023-CV