我们概述了从新生小鼠大脑皮层和成年小鼠脊髓中高效、快速分离和培养活体小胶质细胞的方法。皮层小胶质细胞的解剖与接种可在90分钟内完成，初次解剖后约10天可进行后续的小胶质细胞收获。
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摘要
摘要
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的巨噬细胞样细胞，因此在生理和病理过程中具有至关重要的作用，例如发育过程中的CNS成熟、多发性硬化症以及脊髓损伤。当神经元受到损伤或刺激时，例如在多发性硬化症中观察到的轴突损伤或中风引起的缺血性脑损伤，小胶质细胞可被激活并募集参与反应。这些具有免疫活性的CNS细胞还被认为在非病理条件下参与突触可塑性。我们采用从新生期和成年组织中培养小胶质细胞的实验方案，旨在最大化活细胞数量的同时，尽量减少混杂因素，例如其他CNS细胞类型的存在以及细胞培养中的碎片。我们使用体积较大且易于识别的CNS结构（例如 皮层、脊髓节段），从而使整个过程具有可行性与可重复性。使用成年细胞是替代新生脑小胶质细胞的合适选择，因为许多被研究的病理主要影响出生后的脊髓。这些培养系统还可用于直接检测可能抑制或促进小胶质细胞激活的化合物的作用。由于小胶质细胞的激活可影响成年CNS中疾病的进程，因此有必要建立体外系统，用于培养和研究新生期与成年期的小胶质细胞。
引言
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，其结构和功能最接近外周巨噬细胞1。最近研究表明，出生后的小胶质细胞来源于原始髓系前体细胞，并在胚胎发育第八天之前即已生成，这一发现颠覆了以往认为出生后的造血前体细胞是成年大脑中小胶质细胞来源的观点2。小胶质细胞在多种神经系统疾病中发挥关键作用，能够通过释放促炎性或抗炎性细胞因子快速响应感染或损伤3。因此，小胶质细胞构成了中枢神经系统中一个独立的功能单元，可通过干预调控疾病进程。建立稳定且可重复的新生期或成年小胶质细胞分离与培养方法，对未来的研究具有重要意义。
小胶质细胞已被证实是多种脑部病理过程中的关键参与者。近年来研究发现，小胶质细胞在正常脑发育和功能中也发挥着重要作用，例如通过吞噬海马齿状回中过量的神经前体细胞 1, 4小胶质细胞还可调节多种影响脊髓的神经系统疾病，例如多发性硬化症（MS）、神经病理性疼痛和脊髓损伤。 5-7脊髓小胶质细胞与脑小胶质细胞在响应激活信号时表现出不同的反应 8, 9，可能是由于局部环境的差异所致。因此，建立一个合适的 体外 用于培养和研究脊髓小胶质细胞的系统。新生小胶质细胞在受到刺激后产生的促炎性细胞因子一氧化氮显著多于成年细胞 体外 使用 IFN-γ 或 TNF-α 刺激10,11 进一步凸显了在特定疾病背景下研究小胶质细胞时使用成体细胞的必要性。
我们在实验室中培养新生小胶质细胞所采用的方案是近期方法的一种改进，该方法通过振荡混合胶质细胞培养物，以期将小胶质细胞从细胞培养瓶表面分离下来 12. 我们还描述了一种基于Yip首次报道的方案，从成年小鼠脊髓中培养小胶质细胞的方法， 等13该方法相较于其他现有方案，能够更快地培养成体细胞。 14最终获得的细胞悬液中，70%为小胶质细胞，其余为星形胶质细胞。尽管本方法培养物的纯度低于其他已发表的方法 13该培养体系可用于研究小胶质细胞在体外对多种激活刺激的反应，也适用于主要影响脊髓且以强烈炎症反应为主要特征的疾病研究。
所述所有实验方案均已获得石溪大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
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方案
1. 解剖（第0天）
- 通过低温诱导 p0-2 小鼠幼崽麻醉。用浸有 70% 乙醇的 Kimwipe 擦拭幼崽头部，以消毒组织。
- 使用剪刀去除头部，每 10 cm 培养皿使用 4 只幼崽。将头部置于含有冰冻 Hank's 缓冲液的培养皿中。
- 使用弯头镊子穿过眼眶固定头部，并用直头显微镊小心去除覆盖颅骨的皮肤。
- 用直头显微镊去除颅骨，注意避免刺破或损伤大脑皮层。最有效的方法是从靠近位于头部基部的小脑区域开始去除，因为该区域将被弃去。
- 用小刮勺取出脑组织，并将（4 只）脑组织放入盛有冰冻 Hank's 缓冲液的新培养皿中。
- 从此时起的所有步骤均使用显微镊，并在解剖显微镜下操作。从脑腹侧开始，通过夹住小脑固定组织，在中脑两侧各做两个小切口。注意不要完全切断组织，因为在此区域皮层覆盖中脑。
- 轻柔地将中脑和小脑作为一个整体从两侧皮层中分离出来。两个皮层应呈凹面形状。
- 分开两个皮层，将其中一个皮层内侧朝上放置，以便进一步解剖。海马体可能难以观察，但它位于嗅球的对侧，嗅球表现为皮层尖端的一个小结节。
- 去除呈新月形的海马体。翻转皮层以观察其背侧。
- 以嗅球为起点，从皮层上去除所有脑膜以及嗅球本身。
- 解剖好的皮层应放入含有 14 ml 冰冷 Hank's 缓冲盐水的 15 ml 锥形管中。
2. 细胞培养（第0天）
- 在10 cm组织培养皿中加入用无菌水稀释的5 μg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL），37 °C孵育3小时进行预包被。
- 吸除PDL溶液，用无菌水洗涤培养皿一次，然后在超净台内紫外线下干燥20分钟。此步骤应在解剖操作前立即进行。
- 从含有每4个脑组织皮层的离心管中吸除Hank's缓冲液，每管加入4 ml 1×胰蛋白酶/EDTA溶液，使用p1000枪头反复吹打组织，随后将离心管置于37 °C培养箱中孵育15分钟。
- 每管加入4 ml完全小胶质细胞培养基以终止酶消化反应，混匀后在1.5K rpm条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，并用4 ml完全培养基重复洗涤一次。将细胞重悬于10 ml完全小胶质细胞培养基（DMEM含10% FBS、1%丙酮酸钠、0.08%庆大霉素）中，经40微米孔径的细胞滤网过滤。
- 按每10 ml培养基接种8个皮层组织的密度，将细胞接种至10 cm组织培养皿中，置于37 °C、5% CO2的组织培养箱中培养（参见成年小胶质细胞实验方案）。
（第3天）
- 用完全小胶质细胞培养基更换所有细胞培养皿中的培养液。
（第 10 天）
- 向10 cm组织培养板的培养基中加入400微升60 mM利多卡因HBSS溶液（用于解离小胶质细胞），室温（RT）孵育10–15分钟。
- 收集培养板中的培养基/细胞悬液，并用Hank's缓冲液洗涤培养板一次。收集洗涤液以回收残留的小胶质细胞。
- 向细胞悬液中加入5 mM EDTA（pH 8.0），使其终浓度达到50 μM，或按1/100比例稀释。
- 以1,000 × g（1,500 rpm）离心5分钟，沉淀细胞，然后重悬于1 ml含1% FBS的DMEM培养基中。
- 计数活细胞数量（参照成年小胶质细胞3.1/3.2步骤），按所需实验密度将细胞分种至组织培养板中。通常从一个含有4个脑皮层组织的10 cm培养板中可收获约1×106个小胶质细胞。进行免疫荧光染色时，建议每18 mm盖玻片接种2.5×104个细胞。
- 使用前至少静置24小时，使小胶质细胞充分恢复至其分支状静息状态。
实验方案文本：（成年小胶质细胞）
1. 组织采集
- 将组织培养板用多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine, PDL）在 37 °C 下包被 3 小时，或在 4 °C 下过夜。使用前立即用高压灭菌水洗涤一次。
- 通过 CO2 窒息法处死小鼠，并确认动物死亡。用 70% 乙醇清洁脊髓区域。
- 使用剪刀剪开脊髓上方的皮肤；然后从 T1 至 T12 区域将脊髓剪出。去除附着在脊髓两侧的残余肌肉组织。
- 用显微剪刀缓慢剪开椎骨，同时用手指轻轻夹持脊髓组织。注意避免刺破脊髓，因其组织非常柔软。使用显微镊子缓慢将脊髓完整取出。
- 将脊髓置于含有冰上预冷的 HBSS 的培养皿中。在体视显微镜下，用显微镊子去除所有可见的脑膜组织。
- 将脊髓切成足够小的横向片段，以产生多个组织块。为确保有效消化，每个片段厚度不应超过 2 mm。将脊髓组织块转移至含有 1 ml 冰上预冷 HBSS 的 15 ml 锥形管中。在进行消化步骤前，将管子置于冰上保存。
2. 组织消化
- 从含有脊髓组织的15 ml锥形管中吸除HBSS。注意不要吸走任何组织块。
- 加入1 ml胰蛋白酶溶液（含2.5 g/L辐照猪胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA的HBSS），于37 °C孵育30分钟。
- 为终止消化，移除胰蛋白酶溶液，并加入3 ml含血清的原代小胶质细胞培养基以停止酶消化反应。
- 用移液器反复吹打使组织解离，然后使用40 μm细胞滤网过滤细胞悬液。
3. 细胞计数与铺板
- 将细胞悬液与 DAPI 溶液等体积混合。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 以每毫升 5–7×105 个细胞的密度接种于多聚赖氨酸包被的 35 × 10 mm 培养皿中。若接种密度过低，即使将细胞培养于面积小于 35 × 10 mm 培养皿的 12 孔板中，也会抑制细胞生长。
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结果
静息状态和活化状态的小胶质细胞示例见图1。接种后24小时观察小胶质细胞（图1a），呈现分支状（静息）形态。经细菌脂多糖（LPS）这一启动试剂处理后，小胶质细胞形态发生改变，细胞被激活（图1b）。
接种细胞计数的示例如图2所示。由于存在细胞碎片，将DAPI Fluoromount（而非台盼蓝）与等体积的细胞悬液混合后，加入血细胞计数板进行细胞计数，方法见文献4, 13。使用荧光显微镜观察DAPI阳性细胞。采用明场模式有助于准确计数存在的细胞（图2）。每只小鼠脊髓可获得约7×105个细胞。
将细胞接种于PDL包被的35 × 10 mm组织培养皿中。我们发现PDL包被是关键步骤，因为若培养皿未包被，细胞无法贴壁和生长。小胶质细胞在培养约两天后可完全贴附于培养皿表面（图3）。本实验使用了Ma...
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讨论
小胶质细胞不仅调节中枢神经系统的正常功能，还参与对多种病理状态的炎症反应。小胶质细胞通过功能性突触重塑在维持大脑正常稳态中发挥重要作用15。在神经发生级联过程中，它们参与清除海马齿状回中的神经前体细胞4, 16。因此，有必要建立一种可用于研究新生期和成年期小胶质细胞的培养体系，以覆盖从发育到成年整个过程中小胶质细胞所承担的多种不同功能。我们提出了一种快速且高效的方法，用于从成年脊髓和新生脑组织中培养小胶质细胞。在成年组织中获得的细胞悬液中，小胶质细胞占比达70%，其余主要为星形胶质细胞；而新生小胶质细胞培养物的纯度接近100%。
鉴于星形胶质细胞在调控小胶质细胞活化状态中的作用17-19，优化培养条件以提高培养物纯度显得尤为重要。尽管将细胞悬液与等体积的DAPI Fluoromount混合可实现准确的细胞计数，但该方法无法区分小胶质细胞与其他细胞类型。为了提高成年小胶质细胞制备的纯度，可将来源于MacGreen小鼠的细胞悬液与表达GFP的髓系细胞共同孵育GFP包被的Dynabeads20。另一...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Tsirka实验室成员提供的建议和有益的评论。本研究由以下资助项目支持：SET获得R01NS42168，RB获得12PRE12060489，LT获得NSF-3MT IGERT和Turner博士论文奖学金，JCN获得NSF-3MT IGERT。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA，5 mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| 利多卡因，60 mM | Sigma | L-5647 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM，1× | Cellgro | 10-017 | |
| 丙酮酸钠 | Cellgro | 25-000-Cl | |
| 硫酸庆大霉素 | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 × 10 mm 组织培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 多聚-D-赖氨酸，100 μg/mL | 按1:20稀释 | ||
| HBSS，1× | Cellgro | 20-023-CV |
参考文献
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