利用STA-PUT沉降速度法分离精原细胞类型

摘要

STA-PUT 方法可根据大小和密度分离不同群体的生精细胞。

摘要

哺乳动物的精子发生是一个复杂且多阶段的分化过程，发生于睾丸曲细精管内。目前尚无可靠的细胞培养系统能够支持精子发生分化。 体外，且大多数关于生精细胞的生物学研究都需要从动物模型（如小鼠和大鼠）中获取组织。由于睾丸包含多种细胞类型——非生精细胞（如Leydig细胞、Sertoli细胞、髓系细胞和上皮细胞）以及生精细胞（如精原细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞、浓缩中的精子细胞和精子）——因此，研究精子发生过程中涉及的生物学机制需要分离并富集这些不同的细胞类型。STA-PUT法可通过线性BSA梯度分离异质性的细胞群体——在此情况下为睾丸来源的细胞。不同类型的细胞因其细胞大小不同而具有不同的沉降速度，因而可收集富含特定细胞类型的组分，并用于后续分析。尽管STA-PUT法不能获得极高纯度的细胞类型组分， 例如 尽管无法达到某些细胞分选方法所能获得的纯度，但该方法可显著提高每一分选组分中的总细胞产量
(~1 x 10⁸ 细胞/生精细胞类型，起始细胞群体数量为 7-8 x 10⁸ 细胞）。该高效方法仅需专用玻璃器皿，可在任何低温室或大型冰箱中进行，因此对于无法便捷获取荧光激活细胞分选仪（FACS）或差速离心装置等专用设备的实验室而言，是一种理想的方法。

引言

哺乳动物的精子发生是一个复杂且分阶段进行的分化过程，发生在睾丸的生精小管中¹。简而言之，位于生精小管上皮附近的干细胞样精原细胞分裂并分化为初级精母细胞，随后进行减数分裂。减数分裂完成后，产生的单倍体细胞即为圆形精子细胞，其将经历精子形成过程，该过程包括细胞质的丢弃和细胞核的压缩。精子细胞逐渐形成鞭毛，并相继发生细胞核的伸长和浓缩，依次形成伸长中的精子细胞和浓缩中的精子细胞。最终产物是精子，它们被释放到生精小管的管腔中，并最终进入附睾，在附睾中进一步成熟。

由于精子发生过程依赖于睾丸内特殊的激素和分子环境，因此需要一个可靠的 体外 尚未开发出能够支持精子发生全过程的培养系统^2,3已开发出从干细胞诱导生成“原始生殖细胞样细胞”和单倍体“圆形精细胞样细胞”的培养方法，但这些方法尚无法大量生成此类细胞，且不能产生更晚期的生精细胞类型。^4,5幸运的是，不同类型的生精细胞在大小上存在显著差异，这使得从完整睾丸获得的单细胞悬液可以通过液体梯度进行分离。本文展示的STA-PUT方法利用线性牛血清白蛋白（BSA）梯度和简单的沉降原理，根据细胞的大小和质量分离生精细胞。^6-9.

与另外两种广泛使用的生精细胞分选方法——流式细胞术（FACS）和离心淘洗法相比，STA-PUT 方法具有多项优势^10-13。STA-PUT 装置仅需在低温室或大型冰箱中组装若干件专用玻璃器皿即可，因此其成本远低于使用细胞分选仪或离心淘洗仪。在相同时间内，STA-PUT 方法每种细胞类型及每个睾丸所获得的细胞数量均高于 FACS 分选所能达到的产量，尽管其各细胞群体的纯度不及 FACS 所获得的结果¹¹。近年来，利用磁珠的细胞分选技术（磁性激活细胞分选，MACS）已成功用于从混合的睾丸细胞群体中富集精原细胞，但由于缺乏合适的细胞表面标志物信息，目前尚不适用于初级精母细胞或精子细胞的分离¹⁴。与 FACS 或 MACS 相比，STA-PUT 方法的另一优势在于能够分离出具有活性的细胞，适用于后续培养，因为与大多数 FACS 方案不同，该方法无需进行 DNA 或其他类型的染色。对于需要获得大量纯度约为 90% 的各类生精细胞的研究而言，STA-PUT 是一种理想的方法。

方案

STA-PUT 方案包括三个阶段：1）仪器与试剂的准备，2）从完整睾丸制备细胞悬液，3）上样、沉降及组分收集。由两名研究人员共同操作时，该方案平均耗时八小时。

1. 设置 STA-PUT 装置（图 1）

***STA-PUT 装置应放置在 4°C 的大型冰箱或冷室中，若采用组分收集器进行收集，则冷室还应能容纳该设备。

1. 在进行该方法的前一晚（或至少提前几小时），清洗所有设备（尤其是玻璃器皿和管路），并用70%乙醇灭菌。在按照图1所示组装装置前，确保设备完全干燥。
2. 将两个2 L的圆柱形容器（图1B和C）以及细胞加样室（图1A）固定在顶部平台，并用两段短管和管夹将它们连接起来。将所有管路夹紧关闭。密封最右侧2 L圆柱形容器的出口。
3. 在细胞加样室（图1A）中放入一个小的搅拌子，在最左侧的2 L圆柱形容器（图1B）中放入一个较大的搅拌子，该容器将用于盛装2% BSA溶液。
4. 将2 L沉降室放置在平台上（图1D）。将金属挡板（图1F）直接置于沉降室底部开口的正上方（图1D）。此步骤至关重要，因为挡板可防止液体产生涡流，并在收集组分时避免细胞梯度被破坏。将盖子盖在沉降室顶部。
5. 在三通旋塞的磨砂玻璃接头（图1G）上涂抹少量真空脂后，将旋塞用夹子固定在沉降室底部，使旋塞与沉降室的磨砂玻璃接头紧密连接。
6. 用管路将细胞加样室（图1A）连接至旋塞的右侧出口。关闭旋塞。
7. 将细胞分馏管路连接至旋塞的左侧出口。分馏管路由一段管路组成，其开放端连接一支玻璃巴斯德移液管，再将一段内径较小的管路连接至玻璃移液管的细端。细口径移液管可在收集细胞组分时限制细胞悬液的流速。在该细管最底端使用夹子夹住。
8. 在实验当天配制2 L Krebs（1x）缓冲液（表1）。然后配制550 ml含2% BSA的1x Krebs溶液、550 ml含4% BSA的1x Krebs溶液，以及50 ml含0.5% BSA的1x Krebs溶液。过滤上述溶液并冷却至4 °C。
9. 将4% BSA溶液倒入右侧的2 L圆柱形容器（图1C），将2% BSA溶液倒入左侧的2 L圆柱形容器（图1B）。确保连接这些容器的管路中无大气泡。
10. 向细胞加样室中加入Krebs缓冲液，并充满连接该室与沉降室的管路，确保无大气泡存在，以免干扰梯度形成。轻轻挤压或弹击管路有助于去除气泡。确保所有Krebs缓冲液均位于管路中，而非细胞室中。
11. 让少量Krebs缓冲液流入沉降室，随后几乎将全部缓冲液排入细胞分馏管路中，以充满管路并排除任何大气泡。
12. 将组分收集器置于沉降室正下方。确保所有收集管均已就位，并用塑料薄膜覆盖，以防污染。

2. 从完整睾丸中分离生精细胞

1. 解剖睾丸 ca12只成年小鼠（最好至少八周大），置于室温的Krebs缓冲液中，以洗去任何污染物。本实验方案涉及实验室小鼠的使用，执行过程符合宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的指南。
2. 将45 mg胶原酶加入50 ml克雷布斯缓冲液中，置于锥形管内，待即将加入曲细精管时使用。将该溶液在33 °C下预热数分钟，随后均分为两份，分别置于两个50 ml锥形管中。
3. 在另一培养皿中加入8 ml Krebs缓冲液，将睾丸去囊，弃去白膜，释放曲细精管。白膜是包绕曲细精管的薄层膜结构，曲细精管应可轻易与白膜分离。操作时，先在白膜上做一切口，用一对镊子夹住该膜，再用另一对镊子将曲细精管从膜中推出并分离。
4. 向每个含有25 ml胶原酶溶液的锥形管中加入4 ml含有肾小管的Krebs缓冲液，于33 °C振荡孵育10 min。孵育结束时，肾小管应呈现“意大利面状”外观。
5. 让小管在管底静置约5分钟。倒出上清液，用25 ml克雷布斯缓冲液（室温）洗涤2次，每次均让小管沉降至管底。每次洗涤后在每根管中保留约5 ml克雷布斯缓冲液。
6. 洗涤过程中，在即将加入曲细精管前，将30 mg胰蛋白酶加入50 ml克雷布斯缓冲液中至一个Falcon管内。将该溶液在33 °C下预热数分钟。均分至两个50 ml锥形管中。
7. 向含有曲细精管的两个试管中各加入25 ml胰蛋白酶溶液。每管加入3 μg DNA酶（1 μg/10 ml），以防止细胞聚集。在33 °C下振荡孵育10分钟。
8. 使用宽口移液管吹打含有小管的溶液，上下移液约10次。溶液应逐渐呈现为单细胞悬液。
9. 33 °C下振荡孵育额外10分钟。使用宽口移液枪将小管组织吹打成单细胞悬液，反复吹吸约25次。若仍可见大量小管结构或细胞团块，可进一步用移液枪吹打，和/或每管再加入3 μg DNA酶（使浓度达到初始浓度的两倍）。
10. 将单细胞悬液通过100 μm孔径的细胞滤网过滤（每管30 ml细胞悬液使用一个滤网）。合并细胞悬液并计数总细胞数量（应为7–8 × 10⁶）。⁸ 细胞）。***梯度中加载的细胞数不得超过800,000,000个。
11. 根据步骤 2.10 获得的细胞计数，将适当体积的过滤后细胞在 450 rcf 离心 5 分钟，用 30 ml Krebs 缓冲液洗涤。重复一次。***通常 22 个睾丸可获得超过 800,000,000 个细胞，但不要加载超过此数量的细胞。
12. 将细胞轻轻重悬于25 ml含2.5至5 μg DNA酶（根据细胞聚集程度决定）的0.5% BSA溶液中，避免产生气泡。确保细胞不发生聚集。将单细胞悬液通过100 μm细胞滤网过滤。此时细胞已准备好上样。上样前轻轻倒置离心管数次，充分混匀。

3. 细胞加样与沉降

1. 确保旋塞处于关闭状态，但位置应调整至允许液体从细胞室（图 1A）流入沉降室（图 1D）。
2. 将两个搅拌子加热板均调至低速（约 70 rpm），使搅拌子持续缓慢转动。
3. 将细胞悬液倒入细胞室（图 1A），打开旋塞，使细胞以 10 ml/min 的流速缓慢流入沉降室（图 1D），然后关闭旋塞。可通过在沉降室上标记体积刻度来确定流速。
4. 向细胞室中加入 5 ml 0.5% BSA 溶液，并以 10 ml/min 的流速排入沉降室，随后关闭旋塞。此步骤用于将细胞从细胞室中冲洗出来，重复 4 次。
5. 制备梯度：打开细胞室（图 1A）与两个 2 L 储液瓶（图 1B 和 C）之间的夹子，立即以 40 ml/min 的流速开始将液体排入沉降室（图 1D）。调节流速，使 BSA 梯度在约 20–30 分钟内完成加载。此时应在 BSA 梯度上方可见一层薄而未受扰动的细胞层。当大部分 BSA 加载完成后，关闭旋塞，并将其旋转至允许液体从沉降室流入分级收集管的位置。
6. 关闭搅拌板。
7. 静置细胞沉降 1 小时 45 分钟。在此期间切勿扰动装置，任何机械扰动均可能破坏梯度。

4. 组分分级及组分分析

***进行以下步骤时，请小心不要扰动梯度。如果 BSA 梯度受到扰动，该实验步骤将无法成功！

1. 待细胞沉降后，缓慢将沉降室中的 50 ml 液体转移至一个 50 ml 锥形管中并暂置一旁。此组分通常含有不期望的细胞团块和碎片。
2. 将组分管连接至组分收集器。***若无组分收集器，也可手动收集组分。
3. 收集组分：通过调节旋塞控制流速，使每 45 秒收集 10 ml（即填满一个收集管）。
4. 盖紧组分收集管，于 4 °C 条件下以 450 rcf 离心 5 分钟。小心倾去上清液，将细胞重悬于残留液体中，并将细胞置于冰上保存。
5. 待所有组分收集完毕后，通过显微镜分析各组分中不同细胞群体。可根据细胞大小和核形态^8,15 区分不同类型的细胞。图 2 展示了三个经合并的组分的“代表性结果”，这些组分分别富集了（a）体细胞和减数分裂细胞以及精原细胞，（b）圆形精子细胞，以及（c）伸长和浓缩中的精子细胞。
   • A 型精原细胞直径约为 12–14 μm，具有染色质组成均一的圆形细胞核。
   • B 型精原细胞直径约为 8–9 μm，具有圆形细胞核，核周区域异染色质更致密。
   • 前细线期初级精母细胞直径约为 7.5–8.2 μm，其细胞质较 B 型精原细胞更少，细胞核形态与 B 型精原细胞相似。
   • 细线期初级精母细胞直径约为 8–10 μm，其细胞核形态与前细线期初级精母细胞相似，但核膜处似乎出现更多致密的染色质。
   • 偶线期初级精母细胞直径约为 10–12 μm，其细胞核形态与细线期初级精母细胞相似。
   • 粗线期精母细胞直径范围约为 12–18 μm，细胞周围有一薄层细胞质环绕着较大的细胞核。细胞核内可见更多致密染色质团块。
   • 圆形精子细胞直径约为 10 μm，具有圆形细胞核，中央有一个强染色的染色中心。
   • 残余体直径约为 6.5 μm，呈圆形，无细胞核。
   • 伸长和浓缩中的精子细胞大小与圆形精子细胞相似，但具有独特的镰刀状细胞核。
   1. 从第 15 组分开始，每隔五个组分分析一次，直至第 85 组分。通常，低于 15 的组分细胞混杂且易成团，而高于 85 的组分则几乎不含或仅含极少量可用细胞。
   2. 分析某一组分时，取组分收集管中 5 μL 液体（离心后细胞已重悬），加入 5 μL 含 8% 甲醛的 Krebs 缓冲液。将固定后的细胞在室温下静置 5 分钟。
   3. 向固定后的细胞中加入 5 μL 含 0.1% Triton 和 DAPI（5 μg/mL Krebs 缓冲液）的溶液。室温静置 5 分钟。
   4. 取 10 μL 上述溶液滴加至载玻片上，加盖盖玻片，用荧光显微镜观察，以确定每个组分的纯度。
   5. 将细胞大小和核形态相似的组分合并（参见“代表性结果”），以获得以下细胞群体：减数分裂期和体细胞二倍体细胞、圆形精子细胞以及浓缩/伸长中的精子细胞。

结果

STA-PUT 实验的理想结果是根据细胞大小和密度，将睾丸细胞较为明显地分离。当从睾丸中分离的细胞在 BSA 梯度中沉降时，可观察到数个清晰的细胞条带。任何细胞团块通常会沉降至梯度底部，不会污染其他组分。在梯度稍高位置的是较大的体细胞和减数分裂细胞。更靠近梯度上部的是较小的圆形精子细胞。在梯度最顶部的是浓缩的精子细胞、精子以及混入的红细胞（这些细胞表现为无细胞核的小圆形细胞）。

可以结合使用光学显微镜和荧光显微镜快速分析各细胞组分（图2）¹⁵。减数分裂细胞、精原细胞以及体细胞二倍体细胞是睾丸中体积最大的细胞，其细胞核较大，经DAPI染色后呈现相对均一的荧光信号。圆形精子细胞体积较小，具有较小的圆形细胞核，通常含有一个强荧光染色的染色中心。浓缩期/伸长期精子细胞为小型细胞，形态常呈椭圆形，仿佛正在形成一条细小的尾部。这些细胞具有较小而致密的细胞核，DAPI染色强，形状类似镰刀。当细胞组分合并后，可通过蛋白印迹法（western blot）对细胞裂解物进行进一步分析，以确定其纯度（图3）。减数分裂...

讨论

研究精子发生过程的学者依赖动物模型获取精原细胞样本，因为目前尚不存在能够生成所有类型精原细胞的可靠细胞培养系统³。尽管可以从完整的睾丸组织中方便地收集精原细胞，但所得细胞群体为混合类型。这对于希望研究特定亚型细胞（如减数分裂期细胞、圆形精子细胞和浓缩中的精子细胞）的研究者而言构成了挑战。目前有三种不同的方法用于分离这些精原细胞亚型：STA-PUT法、流式细胞分选（FACS）和差速离心法（elutriation）^6-13。后两种方法分别需要使用昂贵的设备：细胞分选仪和差速离心装置。尽管FACS法可获得纯度很高的不同精原细胞亚群，但该过程耗时约六小时，且每两至三个睾丸组织仅能获得0.5–2.0 × 10⁶个每种类型的细胞¹¹。差速离心法与STA-PUT法类似，均依据细胞的大小和密度进行分离，但需要使用差速离心装置，其成本高于STA-PUT设备。

STA-PUT 方法利用简单的牛血清白蛋白（BSA）梯度，以较高的得率（约每 22 个睾丸可获得 10⁸ 个细胞/细胞群）分离不同大小...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	可使用其他品牌。
0.5%、2% 和 4% BSA 溶液	分别将 0.25 g、11 g 和 22 g 溶于总体积分别为 50 ml、550 ml 和 550 ml 的 1x KREBS 溶液中。	应在 STA-PUT 实验当天配制。过滤除菌。
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl + 5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g 葡萄糖 + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl，用 ddH20 定容至 2 L	可高压灭菌或过滤，4 °C 保存数月。
KREBS (1x)	将 4.24 g NaHCO3 溶于 100 ml ddH20 中。加入 200 ml 10x KREBS 溶液，用 ddH20 定容至 2 L。	应在 STA-PUT 实验当天配制。过滤除菌。
胶原酶	Sigma	C9891-1G
脱氧核糖核酸酶（DNAse）	Sigma	DNEP-5MG
胰蛋白酶	Sigma	T9201-1G
DAPI	研究者自选
吐温-100（Triton-X100）	研究者自选
甲醛（~37%）	研究者自选
表 2：仪器设备
仪器设备	公司	货号	备注
完整的 STA-PUT 装置	ProScience Glass Shop	STA-PUT（本实验使用标准沉降室：货号 56700-500）	包含装置所需的全部玻璃器皿和设备。也可选用适用于较少细胞数量的 STA-PUT 实验的其他规格玻璃器皿。
10 μm 孔径滤膜	Fisherbrand	22363549
小鼠解剖工具	研究者自选
14 ml 圆底带盖组分收集管	研究者自选
约需 100 支试管
组分收集器	GE Healthcare Life Sciences	型号：Frac-920，产品编号：18-1177-40	可使用其他品牌。
显微镜载玻片、盖玻片	研究者自选
光学/荧光显微镜	研究者自选