我们描述了一种用于区分炎症阶段的非侵入性成像方法。全身递送的鲁米诺可显示依赖于中性粒细胞中髓过氧化物酶（MPO）活性的急性炎症区域。相比之下，注入的双甲酰胺（lucigenin）则可实现对依赖于巨噬细胞中NADPH氧化酶（Phox）活性的慢性炎症的可视化成像。
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摘要
摘要
炎症是许多人类疾病的基本特征。在本视频报告中，我们展示了非侵入性生物发光成像技术，可用于区分小鼠模型中的急性与慢性炎症。当组织受损或病原体入侵时，中性粒细胞作为第一道防线，在介导急性炎症反应中发挥重要作用。随着炎症反应的进展，循环中的单核细胞逐渐迁移至损伤部位，并分化为成熟的巨噬细胞，通过清除组织碎片和分泌抗炎性细胞因子来介导慢性炎症并促进组织修复。腹腔注射鲁米诺（luminol，5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼二酮钠盐）可实现对主要由组织浸润性中性粒细胞介导的急性炎症的检测。鲁米诺特异性地与中性粒细胞吞噬体内部产生的超氧阴离子发生反应，其生物发光依赖于髓过氧化物酶（MPO）介导的反应。氯化氰胺（lucigenin，双-N-甲基吖啶硝酸盐）也能与超氧阴离子反应产生生物发光。然而，氯化氰胺的生物发光不依赖于MPO，而是仅依赖于慢性炎症期间巨噬细胞中的吞噬细胞NADPH氧化酶（Phox）。因此，鲁米诺与氯化氰胺联合使用，可实现对急性和慢性炎症不同阶段中多种吞噬细胞群体的非侵入性可视化及纵向评估。鉴于炎症在多种人类疾病中具有重要作用，我们认为这种非侵入性成像方法有助于研究中性粒细胞与巨噬细胞在多种病理状态下的不同作用。
引言
炎症是一种高度调控的生物学反应，参与多种人类疾病的发生发展，包括微生物感染1、伤口愈合2、糖尿病3、癌症4、心血管5、神经退行性6以及自身免疫性疾病7。组织炎症需要多种免疫细胞之间的协调作用，以实现病原体清除、组织修复和疾病消退。中性粒细胞和巨噬细胞是介导组织炎症的关键免疫细胞。在炎症的急性期，中性粒细胞是应对各种有害刺激和组织损伤的首批响应者8。中性粒细胞迅速从血液循环中渗出并迁移至损伤部位，在此处通过释放抗菌颗粒和吞噬作用使入侵的微生物失活。在吞噬过程中，中性粒细胞将入侵的微生物摄入吞噬体，并在吞噬体内产生大量超氧阴离子（O2·-）。吞噬体内的超氧阴离子是多种下游活性氧（ROS）的主要来源。例如，超氧阴离子可通过自发歧化或超氧化物歧化酶（SOD）的作用转化为过氧化氢（H2O2）9,10。在中性粒细胞中，髓过氧化物酶（MPO）进一步将过氧化氢转化为具有抗菌作用的次氯酸（HOCl）11。随着炎症反应的持续，循环中的单核细胞逐渐迁移至损伤部位，并分化为成熟的巨噬细胞2，其吞噬功能有助于清除失活的病原体和细胞碎片。此外，作为炎症后期的关键调节细胞，巨噬细胞通过产生抗炎性细胞因子12以及在较....
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方案
注意：所有动物实验均在经批准的机构方案和动物护理指南下进行。
1. 试剂与溶液
- 皮下接种用PMA溶液：将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）溶于DMSO中，配制成5 mg/ml的储存液。将储存液于-20 °C保存。接种前将储存液解冻，并用PBS稀释至PMA浓度为1 mg/ml。
- 皮下接种用LPS溶液：将脂多糖（lipopolysaccharide, LPS，来源于Salmonella enterica血清型enteritidis）溶于无菌PBS中，配制成1 mg/ml的溶液，用于皮下接种前使用。
- 急性期成像用luminol溶液：将luminol（5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼二酮钠盐，sodium salt）溶于无菌生理盐水（0.9% NaCl）中，配制成10 mg/ml的溶液。该溶液可在使用前于-20 °C保存。
- 慢性期成像用lucigenin溶液：将lucigenin（双-N-甲基吖啶硝酸盐，bis-N-methylacridinium nitrate）溶于无菌生理盐水中，配制成2.5 mg/ml的溶液。该溶液可在使用前于-20 °C保存。
2. 皮下PMA炎症模型
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结果
我们进行了纵向生物发光成像，以评估实验性炎症模型中的急性和慢性炎症。佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一种强效的蛋白激酶C（PKC）激动剂，可激活Phox以产生活性氧超氧阴离子，并引发强烈的急性炎症反应21。在NCr裸鼠皮下注射50 mg PMA后，注射部位迅速出现皮肤刺激和急性炎症18, 22, 23。我们连续4天每日进行成像，首次成像在PMA注射后3小时即开始。图1展示了使用luminol和lucigenin作为底物的纵向生物发光成像结果。在炎症早期（3小时），我们观察到显著的luminol生物发光信号，表明PMA注射部位中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）活性较高。在炎症早期阶段未观察到明显的lucigenin生物发光信号。从第2天开始，出现结痂现象，因此发光强度降低。随着伤口愈合过程逐渐明显（图1A，第3天和第4天），我们观察到lucigenin生物发光信号持续增强（图1B）。这些结果表明，luminol生物发光与炎症的急性期相关，而lucigenin生物发光则与炎症后期的组.......
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讨论
在本报告中，我们展示了一种用于活体动物炎症无创成像的生物发光方法。该方法利用两种发光底物——鲁米诺（luminol）和卢西格宁（lucigenin），可区分炎症的不同阶段。鲁米诺生物发光与炎症急性期中的中性粒细胞相关，而卢西格宁生物发光则由慢性期的巨噬细胞介导。鲁米诺相对分子量较小（分子量 = 177.16 g/mol）且不带电荷，能够轻易穿透血浆膜和吞噬体膜25-29。此外，鲁米诺发光对中性粒细胞内髓过氧化物酶（MPO）的活性具有特异性9。另一方面，由于卢西格宁分子较大（分子量 = 510.5 g/mol）并带有两个正电荷，其通常难以穿过细胞膜25, 27-30。
中性粒细胞和巨噬细胞在不同的亚细胞位置组装 Phox 全酶。尽管两种试剂均依赖 Phox 产生超氧阴离子（O2·-），但它们在细胞通透性和髓过氧化物酶（MPO）依赖性方面的差异，使得这些底物能够在疾病模型中区分不同类型的炎症性吞噬细胞。中性粒细胞在其胞内囊泡（吞噬体）膜上表达大部分 Phox 酶14<.......
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披露
作者声明本研究不存在利益冲突。
致谢
本工作由南希·卢里·马克斯基金会资助。感谢南希·E·科尔博士对稿件的审阅。感谢黄健忠在准备本视频报告过程中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| 来自Salmonella enterica血清型肠炎沙门氏菌的脂多糖 | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| 鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼，钠盐） | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| 卢西格宁（双-N-甲基吖啶硝酸盐） | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| 配备Living Imaging 4.2软件包的IVIS Spectrum成像系统 | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
参考文献
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S.
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重印与许可
