我们介绍一种利用多重微球抗体阵列对唾液蛋白质进行分析的方法。采用碳二亚胺化学法将单克隆抗体共价连接至荧光染料编码的4.5 μm聚合物微球上。将修饰后的微球沉积于光纤微孔中，通过荧光夹心免疫分析法测定唾液中的蛋白质水平。
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摘要
摘要
本文介绍了一种利用光纤微球抗体阵列同时检测唾液中六种蛋白质的实验方案。所采用的免疫阵列技术结合了基于微球的悬浮芯片制备方法与荧光显微成像的优势。如视频方案所述， commercially available 的 4.5 μm 聚合物微球通过两种荧光染料在微球内部的物理包埋浓度被编码为七种不同类型。表面带有羧基的编码微球通过 EDC/NHS 偶联化学法修饰单克隆捕获抗体。为构建蛋白质微阵列，将不同类型的编码且功能化的微球混合后随机沉积于光纤束近端经化学蚀刻形成的 4.5 μm 微孔中。该光纤束既作为载体，也用于微球的成像。微阵列组装完成后，用于捕获从临床收集的唾液上清液中的蛋白质。检测基于夹心免疫分析法，使用针对不同分析物的生物素化检测抗体混合物，并结合链霉亲和素标记的荧光探针 R-藻红蛋白（R-phycoerythrin）进行信号识别。通过三通道荧光显微镜对微阵列成像，其中两个通道用于微球定位编码，一个通道用于检测分析信号。所得荧光显微图像随后通过自主研发的 MATLAB 算法进行解码与分析。
引言
自20世纪90年代中期Mark Schena及其同事首次报道微阵列技术以来，这一强大工具已广泛应用于生物学研究的多个领域1。抗体微阵列能够同时检测血液等诊断体液中的多种蛋白质，在临床诊断和生物标志物筛选中具有重要应用价值2-10。唾液中含有许多与血液相同的分析物，且因其采集安全、无创，并可由经简单培训的医务人员完成，被视为血液的理想替代样本11-13。目前，利用唾液样本进行多重蛋白质分析仍受到若干关键因素的限制，包括目标分析物浓度较低14以及不同生物标志物浓度范围差异较大15。
.本文中，我们展示了对六种蛋白质的分析：人血管内皮生长因子（VEGF）、干扰素γ诱导蛋白10（IP-10）、白细胞介素-8（IL-8）、表皮生长因子（EGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和白细胞介素-1β（IL-1β）。该方法的性能首先通过含有重组分析物蛋白和封闭缓冲液的标准溶液进行验证。此外，还测试了来自不同慢性呼吸系统疾病患者以及健康对照者的实际唾液样本，结果表现令人满意。该方案应可适用于其他蛋白质分析物及其他基于微球的检测方法。与类似的酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，该平台在分析化学领域具有显著优势，能够快速、准确且可重复地同时检测多种蛋白质在宽动态范围内的低浓度水平，且非特异性相互作用少、样本消耗量低、成本低廉。
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方案
图1. 光纤微球抗体阵列用于唾液蛋白谱分析的工作流程。
（1）微球内部由两种荧光染料进行编码；（2）编码后的微球通过共价修饰连接特异性单克隆抗体；（3）将多种编码微球混合后，（4）随机沉积于光纤束近端蚀刻形成的微孔中；（5）唾液中的目标蛋白通过夹心免疫测定法被微球捕获，并（6）通过荧光显微镜进行定量分析。
1. 微球编码
- 称取三水合三氟乙酰丙酮铕钠（Eu-TTA，分子量 = 869.54 g/mol）至棕色玻璃小瓶中，用四氢呋喃（THF）配制 200 mM 的储备液。通过移液轻轻混匀；目视确认染料完全溶解。
- 称取香豆素 30（C30，分子量 = 347.41 g/mol）至棕色玻璃小瓶中，用 THF 配制 12 mM 的储备液。通过移液轻轻混匀；目视确认染料完全溶解。
- 使用上述储备液和 THF 配制每种微球的工作液，每种 700 μl，终浓度见表 1。
- 通过涡旋使微球（10% w/v）充分悬浮，然后将 60 μl 悬浮液转移至 1.5 ml 微量离心管中。
- 向微球悬浮液中加入 600 μl 磷酸盐缓冲液（PBS），通过移液吹打 20 次混匀。在 10,000 rpm 下离心 3 分钟，小心去除上清液。重复此步骤 2 次，以洗涤微球。
- 用 THF 按照与步骤 1.5 类似的操作洗涤微球沉淀 3 次。
- 将微球/THF 悬浮液在 10,000 rpm 下离心 3 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 表 1 中列出的 600 μl 工作液中。将混合液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。
- 用 Parafilm 封口膜密封微量离心管，并置于摇床上。在 3,000 rpm 下振荡，避光孵育 24 小时，可通过用铝箔包裹的盒子覆盖装置以避光。
- 将微球悬浮液在 10,000 rpm 下离心 3 分钟，形成沉淀。
- 弃去上清液中的染料溶液，用 600 μl 甲醇洗涤微球 6 次，再用含 0.01% Tween-20 的 600 μl PBS 洗涤 6 次，操作同步骤 1.5 所述。
- 将编码后的微球储存于含 0.01% Tween-20 的 600 μl PBS 中，4 °C 保存，避光，待用。
| 微球类型名称： | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
表1. Eu-TTA 和 C30 工作溶液的浓度。
2. 蛋白质捕获微球的制备
- 提前在室温下配制 MES 缓冲液 [2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 0.1 M、NaCl 0.9%、SDS 0.01%、pH 5.7] 和 PBS/SDS 缓冲液（磷酸钠 0.01 M、NaCl 0.154 M、SDS 0.01%、pH 7.4]。
- 将 200 μl 编码微球悬浮液（含约 2 mg 微球）加入一个带安全锁的 1.5 ml 微量离心管中。必须使用此类微量离心管，以避免在步骤 2.6 孵育过程中发生泄漏。
- 用 600 μl MES 缓冲液洗涤微球 3 次，操作如步骤 1.5 所述。向微球沉淀中加入 700 μl MES 缓冲液，并通过移液充分混匀。
- 分别在不同的试管中，用 MES 缓冲液配制 0.105 g/ml 的 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC，MW = 191.7 g/mol）溶液和 0.163 g/ml 的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS，MW = 217.13 g/mol）溶液。
- 将 150 μl 新鲜配制的 EDC 溶液逐滴加入微球悬浮液中。EDC 极易快速水解，因此必须使用新鲜配制的溶液以确保偶联效率。加入 EDC 后，立即向微球中加入 150 μl sulfo-NHS 溶液，通过移液充分混匀，并确认悬浮液均匀。
- 盖紧管盖，用 Parafilm 封口，置于摇床上。在避光条件下（使用铝箔包裹的盒子遮光），以 1,500 rpm 振荡反应 4 小时。
- 将微球悬浮液在 10,000 rpm 离心 3 分钟，形成沉淀后弃去上清液。用 500 μl PBS/SDS 缓冲液洗涤微球 3 次，操作如步骤 1.5 所述。
- 向沉淀中加入 200 μl PBS/SDS 缓冲液，充分混匀微球，然后将该悬浮液转移至含有 60 μg 捕获抗体的 300 μl PBS/SDS 缓冲液中。必须先将微球沉淀充分重悬，再将微球悬浮液加入抗体溶液中。
- 将抗体-微球混合物置于摇床上，在避光条件下（使用铝箔包裹的盒子遮光），以 1,500 rpm 振荡孵育 4 小时。
- 将微球悬浮液在 10,000 rpm 离心 3 分钟，形成沉淀后弃去上清液。用 500 μl StartingBlock（TBS）封闭缓冲液洗涤微球 3 次，操作如步骤 1.5 所述。
- 将微球与 1 ml TBS 封闭缓冲液混合，在避光条件下，以 1,500 rpm 在摇床上孵育 1 小时。
- 将微球悬浮液在 7,000 rpm 离心 3 分钟，形成沉淀后弃去上清液。用 500 μl TBS 封闭缓冲液洗涤沉淀 3 次，操作如步骤 1.5 所述。
- 将微球溶液在 7,000 rpm 离心 3 分钟，形成沉淀后弃去上清液。加入 500 μl TBS 封闭缓冲液，通过移液混匀。
- 将修饰后的微球悬浮液于 4 °C 保存，避光，直至使用。
- 重复上述步骤，使用相应的抗体制备其他类型的微球。
3. 光纤微阵列组装
- 将每种蛋白质捕获微球各50 μl加入一个新的灭菌微量离心管中。将微球储备液混合物在7,000 rpm下离心3分钟，弃去上清液，使剩余体积约为100 μl。
- 用手将光纤束切割至约5 cm长，并使用抛光机依次用30、15、9、6、3、1、0.5和0.05 μm的金刚石研磨膜对两端进行抛光。将抛光后的光纤束在去离子水中超声处理2分钟，以去除任何颗粒。
- 将一个小的磁力搅拌子放入0.5 ml微量离心管中，加入400 μl无蛋白PBS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，以去除气泡。
- 将抛光后的光纤束一端浸入0.025 N HCl溶液中刻蚀150秒10,16。立即将其刻蚀端浸入去离子水中并超声1分钟。用压缩空气干燥光纤束。
- 将光纤束安装在光纤夹具上，将刻蚀端浸没于无气泡、无蛋白的PBS缓冲液中封闭1小时。
- 取1 μl储存的微球悬浮液滴加在光纤束的刻蚀端。用铝箔包裹的盒子遮光保护，静置15分钟。悬浮液体积将因蒸发而减少，从而迫使微球进入刻蚀形成的微孔中。重复此加载步骤一次。
- 用浸有样品溶液的棉签轻轻擦拭，去除未被固定在微孔中的微球。此时蛋白质微阵列已准备就绪，立即进入步骤4.1进行唾液分析。
4. 使用微球微阵列分析唾液样本
- 添加 200 μl 样品溶液（100 μl 唾液上清液用等体积的StartingBlock T20（PBS）封闭缓冲液稀释。唾液上清液的采集方案此前已有发表。10) 转移至一个0.5 ml经高压灭菌的微量离心管中。将载有蛋白微阵列的纤维浸入该溶液，置于摇床中以600 rpm转速孵育2小时，并用铝箔包裹的盒子避光保护。
- 通过加入制备 20 ml 洗涤缓冲液 200 μl 10 % BSA 溶液和 200 μl 将10% Tween-20加入19.6 ml PBS中，轻轻振荡混匀。
- 将蛋白质微阵列浸入一个新的已灭菌微量离心管中，管内含有 200 μl 洗涤缓冲液，600 rpm 振荡 2 分钟。重复洗涤 3 次。
- 将微阵列孵育在 100 μl 含有检测抗体混合物的溶液 5 μg/ml 在室温下，将抗VEGF、IP-10、IL-8、EGF、MMP-9、IL-1β生物素化检测抗体加入StartingBlock T20（PBS）封闭缓冲液中，于600 rpm摇床上孵育30分钟，使用铝箔包裹的盒子避光保护。
- 按照步骤4.3所述，用洗涤缓冲液洗涤微阵列3次。
- 将微阵列孵育在 200 μl 的 20 μg/ml 在摇床上以600 rpm的速度，将链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）溶液溶于PBS中孵育10分钟，并用铝箔包裹的盒子避光保护。
- 按照步骤4.3所述，用洗涤缓冲液洗涤微阵列5次。
- 清洁光纤的远端即用浸有无水乙醇的棉签擦拭远离微球的一端。
- 用压缩空气吹干光纤两端。将光纤安装在落射荧光显微镜上，通过光纤的远端进行成像。
- 获取对应于 Eu-TTA、C30 和 SAPE 荧光发射强度的微球图像。Eu-TTA、C30 和 SAPE 荧光成像所用的光学滤光片设置及曝光时间如图所示 表2.
| 通道 | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| 激发滤光片 | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| 分光镜 | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| 发射滤光片 | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| 曝光时间 | 1 sec | 0.3 sec | 1 sec |
表2. 微阵列三幅荧光图像的参数。
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结果
显示光纤束小部分区域的三个通道荧光图像见图2A-C。这些图像使用MATLAB编写的算法进行分析（详见讨论部分）。该分析结合了Eu-TTA编码图像（图2A）和C30编码图像（图2B）的信息用于解码微球，并计算信号图像中不同微球的荧光强度（图2C）。根据从相应蛋白标准品获得的校准曲线，计算出口腔唾液样本中蛋白质的浓度。
图 2. （A）Eu-TTA 编码图像，（B）C30 编码图像，（C）SAPE 信号图像，...
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讨论
研究人员应特别注意以下步骤：为了获得更好的解码准确性，在微球编码过程中的所有孵育和洗涤步骤中，必须确保微球均匀悬浮。此外，编码后的微球在整个实验过程中需避光保存。在遵循正确的编码和储存程序后，我们发现整体解码准确性高于99%。编码后的微球应储存于4 °C。避免冷冻并避光保存。在适当储存条件下，编码微球可稳定保存超过六个月。在编码和修饰步骤中需格外小心，以减少微球的损失。例如，在移除上清液时不要扰动微球沉淀。此外，在缓冲液中添加Tween-20和SDS对于实现更好的微球沉淀至关重要。
常见的故障排除步骤包括：（1）仅使用新鲜配制的 EDC 溶液，并将 EDC 溶液逐滴加入，（2）使用经高压灭菌的离心管，并在每次孵育步骤前将微球溶液转移至新的离心管中，（3）在每次洗涤步骤中，应尽可能彻底移除上清液，（4）修饰后的微球应保存于 4 °C，避免冷冻并避光保存。在适当的储存条件下，修饰后的微球可保存超过 3 个月而无明显信号损失。
用于分析荧光图像的 MATLAB 算法...
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披露
作者声明不存在利益冲突的财务关系。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（资助号 08UDE017788-05）资助。E.B.P. 还感谢西班牙科学技术基金会（FECYT）的支持。作者感谢 Shonda T. Gaylord 和 Pratyusha Mogalisetti 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Eu-TTA 染料 | 费舍尔科技 | AC42319-0010 | |
| THF | 西格玛-奥德里奇 | 34865-100ML | |
| 棕色玻璃小瓶 | 费舍尔科技 | 03-339-23B | |
| 香豆素 30 染料 | 西格玛-奥德里奇 | 546127-100MG | |
| 微球 | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | 费舍尔科技 | 05-408-129 | |
| PBS 10 倍浓缩液 | 西格玛-奥德里奇 | P5493-1L | |
| 水 | 西格玛-奥德里奇 | W4502-1L | |
| 甲醇 | 西格玛-奥德里奇 | 34860-100ML | |
| Tw-20 | 西格玛-奥德里奇 | P7949-100 ml | |
| BupH MES 缓冲盐水 | 赛默飞世尔科技 | 28390 | |
| SDS | 西格玛-奥德里奇 | 05030-500ML-F | |
| NaOH 溶液 | 费舍尔科技 | SS256-500 | |
| 安全锁微量离心管 | VWR 实验室商店 | 53511-997 | |
| EDC | 赛默飞世尔科技 | 22980 | |
| 磺基-NHS | 赛默飞世尔科技 | 24510 | |
| 人 VEGF 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB293 | |
| 人 IP-10 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB266 | |
| 人 IL-8 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB208 | |
| 人 EGF 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB636 | |
| 人 MMP-9 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB936 | |
| 人 IL-1β 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB601 | |
| 小鼠 IgG1 同型对照抗体 | R&D 系统 | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37542 | |
| HCl 标准溶液 1.0 N | 西格玛-奥德里奇 | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml 微量离心管 | 费舍尔科技 | 05-408-120 | |
| 无蛋白 (PBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37572 | |
| 重组人 VEGF 165 | R&D 系统 | 293-VE | |
| 重组人 IP-10 | R&D 系统 | 266-IP | |
| 重组人 IL-8 | R&D 系统 | 208-IL | |
| 重组人 EGF | R&D 系统 | 236-EG | |
| 重组人 MMP-9 | R&D 系统 | 911-MP | |
| 重组人 IL-1β | R&D 系统 | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37539 | |
| 含 BSA 的 PBS 封闭剂 | 赛默飞世尔科技 | 37525 | |
| 生物素标记的 VEGF 检测抗体 | R&D 系统 | BAF293 | |
| 生物素标记的 IP-10 检测抗体 | R&D 系统 | BAF266 | |
| 生物素标记的 IL-8 检测抗体 | R&D 系统 | BAF208 | |
| 生物素标记的 EGF 检测抗体 | R&D 系统 | BAF236 | |
| 生物素标记的 MMP-9 检测抗体 | R&D 系统 | BAF911 | |
| 生物素标记的 IL-1β 检测抗体 | R&D 系统 | BAF201 | |
| 链霉亲和素，R-藻红蛋白 | 英维特罗根 | S-21388 | |
| 乙醇（200 证明） | 西格玛-奥德里奇 | E7023-500ML |
参考文献
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