我们介绍一种利用多重微球抗体阵列对唾液蛋白质进行分析的方法。采用碳二亚胺化学法将单克隆抗体共价连接至荧光染料编码的4.5 μm聚合物微球上。将修饰后的微球沉积于光纤微孔中，通过荧光夹心免疫分析法测定唾液中的蛋白质水平。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种利用光纤微球抗体阵列同时检测唾液中六种蛋白质的实验方案。所采用的免疫阵列技术结合了基于微球的悬浮芯片制备方法与荧光显微成像的优势。如视频方案所述， commercially available 的 4.5 μm 聚合物微球通过两种荧光染料在微球内部的物理包埋浓度被编码为七种不同类型。表面带有羧基的编码微球通过 EDC/NHS 偶联化学法修饰单克隆捕获抗体。为构建蛋白质微阵列，将不同类型的编码且功能化的微球混合后随机沉积于光纤束近端经化学蚀刻形成的 4.5 μm 微孔中。该光纤束既作为载体，也用于微球的成像。微阵列组装完成后，用于捕获从临床收集的唾液上清液中的蛋白质。检测基于夹心免疫分析法，使用针对不同分析物的生物素化检测抗体混合物，并结合链霉亲和素标记的荧光探针 R-藻红蛋白（R-phycoerythrin）进行信号识别。通过三通道荧光显微镜对微阵列成像，其中两个通道用于微球定位编码，一个通道用于检测分析信号。所得荧光显微图像随后通过自主研发的 MATLAB 算法进行解码与分析。
引言
自20世纪90年代中期Mark Schena及其同事首次报道微阵列技术以来，这一强大工具已广泛应用于生物学研究的多个领域1。抗体微阵列能够同时检测血液等诊断体液中的多种蛋白质，在临床诊断和生物标志物筛选中具有重要应用价值2-10。唾液中含有许多与血液相同的分析物，且因其采集安全、无创，并可由经简单培训的医务人员完成，被视为血液的理想替代样本11-13。目前，利用唾液样本进行多重蛋白质分析仍受到若干关键因素的限制，包括目标分析物浓度较低14以及不同生物标志物浓度范围差异较大15。
.本文中，我们展示了对六种蛋白质的分析：人血管内皮生长因子（VEGF）、干扰素γ诱导蛋白10（IP-10）、白细胞介素-8（IL-8）、表皮生长因子（EGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和白细胞介素-1β（IL-1β）。该方法的性能首先通过含有重组分析物蛋白和封闭缓冲液的标准溶液进行验证。此外，还测试了来自不同慢性呼吸系统疾病患者以及健康对照者的实际唾液样本，结果表现令人满意。该方案应可适用于其他蛋白质分析物及其他基于微球的检测方法。与类似的酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，该平台在分析化学领域具有显著优势，能够快速、准确且可重复地同时检测多种蛋白质在宽动态范围内的低浓度水平，且非特异性相互作用少、样本消耗量低、成本低廉。
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方案
图1. 光纤微球抗体阵列用于唾液蛋白谱分析的工作流程。
（1）微球内部由两种荧光染料进行编码；（2）编码后的微球通过共价修饰连接特异性单克隆抗体；（3）将多种编码微球混合后，（4）随机沉积于光纤束近端蚀刻形成的微孔中；（5）唾液中的目标蛋白通过夹心免疫测定法被微球捕获，并（6）通过荧光显微镜进行定量分析。
1. 微球编码
- 称取三水合三氟乙酰丙酮铕钠（Eu-TTA，分子量 = 869.54 g/mol）至棕色玻璃小瓶中，用四氢呋喃（THF）配制 200 mM 的储备液。通过移液轻轻混匀；目视确认染料完全溶解。
- 称取香豆素 30（C30，分子量 = 347.41 g/mol）至棕色玻璃小瓶中，用 THF 配制 12 mM 的储备液。通过移液轻轻混匀；目视确认染料完全溶解。
- 使用上述储备液和 T....
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结果
显示光纤束小部分区域的三个通道荧光图像见图2A-C。这些图像使用MATLAB编写的算法进行分析（详见讨论部分）。该分析结合了Eu-TTA编码图像（图2A）和C30编码图像（图2B）的信息用于解码微球，并计算信号图像中不同微球的荧光强度（图2C）。根据从相应蛋白标准品获得的校准曲线，计算出口腔唾液样本中蛋白质的浓度。
图 2. （A）Eu-TTA 编码图像，（B）C30 编码图像，（C）SAPE 信号图像，.......
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讨论
研究人员应特别注意以下步骤：为了获得更好的解码准确性，在微球编码过程中的所有孵育和洗涤步骤中，必须确保微球均匀悬浮。此外，编码后的微球在整个实验过程中需避光保存。在遵循正确的编码和储存程序后，我们发现整体解码准确性高于99%。编码后的微球应储存于4 °C。避免冷冻并避光保存。在适当储存条件下，编码微球可稳定保存超过六个月。在编码和修饰步骤中需格外小心，以减少微球的损失。例如，在移除上清液时不要扰动微球沉淀。此外，在缓冲液中添加Tween-20和SDS对于实现更好的微球沉淀至关重要。
常见的故障排除步骤包括：（1）仅使用新鲜配制的 EDC 溶液，并将 EDC 溶液逐滴加入，（2）使用经高压灭菌的离心管，并在每次孵育步骤前将微球溶液转移至新的离心管中，（3）在每次洗涤步骤中，应尽可能彻底移除上清液，（4）修饰后的微球应保存于 4 °C，避免冷冻并避光保存。在适当的储存条件下，修饰后的微球可保存超过 3 个月而无明显信号损失。
用于分析荧光图像的 MATLAB 算法.......
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披露
作者声明不存在利益冲突的财务关系。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（资助号 08UDE017788-05）资助。E.B.P. 还感谢西班牙科学技术基金会（FECYT）的支持。作者感谢 Shonda T. Gaylord 和 Pratyusha Mogalisetti 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Eu-TTA 染料 | 费舍尔科技 | AC42319-0010 | |
| THF | 西格玛-奥德里奇 | 34865-100ML | |
| 棕色玻璃小瓶 | 费舍尔科技 | 03-339-23B | |
| 香豆素 30 染料 | 西格玛-奥德里奇 | 546127-100MG | |
| 微球 | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | 费舍尔科技 | 05-408-129 | |
| PBS 10 倍浓缩液 | 西格玛-奥德里奇 | P5493-1L | |
| 水 | 西格玛-奥德里奇 | W4502-1L | |
| 甲醇 | 西格玛-奥德里奇 | 34860-100ML | |
| Tw-20 | 西格玛-奥德里奇 | P7949-100 ml | |
| BupH MES 缓冲盐水 | 赛默飞世尔科技 | 28390 | |
| SDS | 西格玛-奥德里奇 | 05030-500ML-F | |
| NaOH 溶液 | 费舍尔科技 | SS256-500 | |
| 安全锁微量离心管 | VWR 实验室商店 | 53511-997 | |
| EDC | 赛默飞世尔科技 | 22980 | |
| 磺基-NHS | 赛默飞世尔科技 | 24510 | |
| 人 VEGF 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB293 | |
| 人 IP-10 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB266 | |
| 人 IL-8 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB208 | |
| 人 EGF 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB636 | |
| 人 MMP-9 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB936 | |
| 人 IL-1β 捕获抗体 | R&D 系统 | MAB601 | |
| 小鼠 IgG1 同型对照抗体 | R&D 系统 | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37542 | |
| HCl 标准溶液 1.0 N | 西格玛-奥德里奇 | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml 微量离心管 | 费舍尔科技 | 05-408-120 | |
| 无蛋白 (PBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37572 | |
| 重组人 VEGF 165 | R&D 系统 | 293-VE | |
| 重组人 IP-10 | R&D 系统 | 266-IP | |
| 重组人 IL-8 | R&D 系统 | 208-IL | |
| 重组人 EGF | R&D 系统 | 236-EG | |
| 重组人 MMP-9 | R&D 系统 | 911-MP | |
| 重组人 IL-1β | R&D 系统 | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37539 | |
| 含 BSA 的 PBS 封闭剂 | 赛默飞世尔科技 | 37525 | |
| 生物素标记的 VEGF 检测抗体 | R&D 系统 | BAF293 | |
| 生物素标记的 IP-10 检测抗体 | R&D 系统 | BAF266 | |
| 生物素标记的 IL-8 检测抗体 | R&D 系统 | BAF208 | |
| 生物素标记的 EGF 检测抗体 | R&D 系统 | BAF236 | |
| 生物素标记的 MMP-9 检测抗体 | R&D 系统 | BAF911 | |
| 生物素标记的 IL-1β 检测抗体 | R&D 系统 | BAF201 | |
| 链霉亲和素，R-藻红蛋白 | 英维特罗根 | S-21388 | |
| 乙醇（200 证明） | 西格玛-奥德里奇 | E7023-500ML |
参考文献
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D.
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重印与许可
