方法文章

复用荧光微阵列人类唾液蛋白质分析用高分子微球和光纤束

DOI：

10.3791/50726

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2013年10月10日

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1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了使用多路复用基于微球的抗体阵列分析唾液蛋白的过程。单克隆抗体共价连接到荧光染料编码的4.5微米聚合物用碳二亚胺化学性微球。修改后的微球沉积在光纤的微孔用荧光夹心免疫测定蛋白水平在唾液。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文中，我们描述了一种协议，用于同时测量6蛋白在唾液中使用的光纤基于微球的抗体阵列。所采用的免疫阵列技术结合基于微球的悬浮阵列制造与使用荧光显微镜的优点。如在视频协议描述的，可商购的4.5微米的聚合物微球进行编码成七种不同类型的，由两个荧光染料物理截留在微球内的浓度分化。表面含羧基的编码微球通过EDC / NHS偶联化学进行了修改，用单克隆捕获抗体。组装的蛋白质微阵列，不同类型的编码和官能化的微球混合，并随机地沉积在4.5微米的微孔，从而进行化学蚀刻在一光纤束的近端。光纤束被用来同时作为载体和用于成像的米icrospheres。一旦组装后，该微阵列用于捕获蛋白在从诊所收集唾液上清液。该检测是基于使用生物素化的检测抗体的混合物为不同的分析物与链霉亲和结合的荧光探针，R-藻红蛋白的夹心免疫测定。微阵列是在三个不同的通道，两个对微球的注册和一个用于检测信号成像，荧光显微镜。的荧光显微照片，然后解码，并在MATLAB中使用自制的算法进行分析。

引言

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由于报道由Mark Schena并在90年代中期的同事第一芯片，这个强大的工具已被用于生物研究1的许多领域。能够同时检测多种蛋白质在诊断液，如血液的抗体微阵列，具有在临床诊断和生物标志物筛选2-10重要的应用。唾液，含有许多相同的分析物如血，一直被认为是一个优选的替代方案，因为血液唾液收集是安全的，非侵入性的，并且可以进行通过微创医疗人员11-13。目前，使用唾液样本复用蛋白分析是由几个重要的因素，其中包括目标分析物14的低浓度和不同的生物标记物15的宽浓度范围的限制。

。

在此，我们证明6种蛋白的分析:人血管内皮生长因子（VEGF），干扰素γ-诱导蛋白10（IP-10），白细胞介素-8（IL-8），表皮生长因子（EGF），基质金属蛋白酶9（MMP-9），和白细胞介素-1β（IL-1β） 。该方法的性能用标准溶液构成的重组蛋白分析物和封闭缓冲液中最初验证。从不同的慢性呼吸系统疾病的患者以及健康对照真正的唾液样本进行了测试表现令人满意。该协议应当适用于其他蛋白质的分析物和其他基于微球的实验。该平台提供了相当大的优势，在分析化学领域，因为它使低浓度的几种蛋白质具有广泛的动态范围，最小的非特异性相互作用，减少样品消耗和低成本的快速，精确，可重复的和同时分析在比较的类似的酶联免疫吸附试验（ELISA）。

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方案

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图1。 。工作流应用的光纤微球体抗体阵列唾液剖析 （1）微球的内部编码的两种荧光染料，（2）所编码的微球在外部修改与蛋白特异性的单克隆抗体，（3）复用的微球混合，和（4）随机地沉积在微孔蚀刻在光纤束的近端，（5）唾液蛋白是通过夹心免疫捕获的微球，和（6）使用荧光显微镜进行定量。

1。编码微球

  1. 称取钠铕（Ⅲ）thenoyltrifluoroacetonate三水（欧盟TTA，MW =869.54克/摩尔）在琥珀色玻璃瓶中，并在四氢呋喃（THF）准备一个200毫米原液。用移液枪轻轻混匀;直观地验证染料完全溶解。
  2. 称取香豆素30（C30，MW =347.41克/摩尔）在琥珀色玻璃瓶中，并准备一个12毫米原液在THF。用移液枪轻轻混匀，直观地验证了染料完全溶解。
  3. 制备700微升使用储备溶液和THF中以达到表1中列出的最终浓度为每微球型工作液。

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结果

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从三个通道表示光纤束的一小部分的荧光图像示于图2A-C。使用MATLAB写的一个算法这些图像进行分析（如在讨论部分更详细地描述）。该分析采用从铕-TTA编码图像（ 图2A）中的信息和C30的编码图像（ 图2B）来解码的微球，并计算信号的图像（ 图2C）在不同的微球的荧光强度。与相关蛋白的标准中获得的校准曲线，计算蛋白的唾液样品中的浓度。

figure-results-1
图2。 （一）EU-TTA编码图像，（B）C30编码图像，（C）SAPE信号图像，（D）解码结果s重叠的信号图像上;不同类型的微球是标记有不同的颜色和形状。

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讨论

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研究者应该格外注意以下步骤:为更好的解码精度，有必要验证微球均匀地悬浮在所有孵育和微球编码过程中的洗涤步骤。此外，经编码的微球需要在整个实验中，以避光。下列正确的编码和储存程序中，我们发现，总体解码准确率为99％以上。该编码微球应保存在4℃保存，避免冷冻和避光。在适当的储存条件下，编码微球是稳定超过六个月。在编码和修改步骤，需要格外小心，以减少微球的损失。例如，除去上清液时不妨碍微球颗粒。另外，包括吐温20和SDS的缓冲液是必不可少的更好的微球粒化。

有些ØF中的常见故障排除过程是:（1）只使用新鲜制备的EDC溶液和EDC溶液应溶液，（2）高压灭菌管中，应使用与微球溶液应在每次孵育步骤之前被转移到新管中，（ 3）在每个洗涤步骤中，尽量除去上清液尽可能地，（4）修改后的微球应贮存于4℃， 避免冷冻和避光，在适当的储存条件下，修饰的微球可以被存储为3个月以上，没有检测到信号损失。

用于分析的荧光图像在MATLAB算法简述如下。相关的代码可以在补充材料中找到。一个用.......

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披露

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作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

致谢

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这项工作是由美国国立卫生研究院（补助08UDE017788-05）的支持。 EBP也承认支持西班牙基金会科学与技术（FECYT）。作者感谢人Shonda T.盖洛德和Pratyusha Mogalisetti的手稿的批判性阅读。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Eu-TTA 染料Fisher ScientificAC42319-0010
THFSigma-Aldrich34865-100ML
琥珀色玻璃小瓶Fisher Scientific03-339-23B
香豆素 30 染料Sigma-Aldrich546127-100MG
微球BangslabsPC05N/6698
1.5 ml 微量离心管Fisher Scientific05-408-129
PBS 10x 浓缩液Sigma-AldrichP5493-1L
水Sigma-AldrichW4502-1L
甲醇Sigma-Aldrich34860-100ML
Tw-20Sigma-AldrichP7949-100 ml
BupH MES 缓冲盐水Thermo Scientific28390
SDSSigma-Aldrich05030-500ML-F
NaOH 溶液Fisher ScientificSS256-500
安全锁微量离心管VWR labshop53511-997
EDCThermo Scientific22980
Sulfo-NHSThermo Scientific24510
人 VEGF 捕获抗体R&D SystemsMAB293
人 IP-10 捕获抗体R&D SystemsMAB266
人 IL-8 捕获抗体R&D SystemsMAB208
人 EGF 捕获抗体R&D SystemsMAB636
人 MMP-9 捕获抗体R&D SystemsMAB936
人 IL-1&β; 捕获抗体R&D SystemsMAB601
小鼠 IgG1 同种型对照抗体R&D SystemsMAB002
StartingBlock （TBS） 缓冲液Thermo Scientific37542
HCl 标准溶液 1.0 NSigma-Aldrich318949-500 ml
0.5 ml 微量离心管Fisher Scientific05-408-120
无蛋白 （PBS） 缓冲液Thermo Scientific37572
重组人 VEGF 165研发&D Systems293-VE
重组人 IP-10研发D Systems266-IP
重组人 IL-8R&D Systems208-IL
重组人 EGFR&D Systems236-EG
重组人 MMP-9R&D Systems911-MP
重组人 IL-1&β;研发&D Systems201 磅
StartingBlock T20 （PBS） 缓冲液Thermo Scientific37539
阻断剂 PBS 中的 BSAThermo Scientific37525
生物素化 VEGF 检测抗体R&D SystemsBAF293
生物素化 IP-10 检测抗体R&D SystemsBAF266
生物素化 IL-8 检测抗体R&D SystemsBAF208
生物素化 EGF 检测抗体R&D SystemsBAF236
生物素化 MMP-9 检测抗体R&D SystemsBAF911
生物素化 IL-1& β 检测抗体R&D SystemsBAF201
链霉亲和素、R-藻红蛋白InvitrogenS-21388
乙醇（200 度）Sigma-AldrichE7023-500ML

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D.

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Multiplexed Fluorescent MicroarraySalivary Protein AnalysisPolymer MicrospheresFiber optic BundlesMicrosphere EncodingAntibody CouplingFluorescence MicroscopySandwich ImmunoassayBiofluid AnalysisMATLAB Algorithm

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