方法文章

用于合成生物学的基于 Escherichia coli 的 TX-TL 无细胞表达系统的实施方案

DOI：

10.3791/50762

⸱

2013年9月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, California Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, California Institute of Technology, 3Synthetic Biology Center, Department of Bioengineering, Massachusetts Institute of Technology, 4School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本五日方案详细说明了从头开始创建和运行一种高效的内源性大肠杆菌（Escherichia coli）为基础的TX-TL无细胞表达系统所需的全部步骤、设备及补充软件。使用试剂时，该方案在8小时或更短时间内即可完成反应的设置、数据采集与处理。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

理想的无细胞表达系统理论上可以模拟 在体内 受控的细胞环境 体外 平台1 这对于以受控方式表达蛋白质和基因线路，以及为合成生物学提供原型设计环境具有重要意义。2,3 为实现后一目标，保留内源性大肠杆菌转录-翻译机制的无细胞表达系统能够更准确地模拟 在体内 细胞动力学，优于基于T7 RNA聚合酶转录的系统。我们描述了一种高效的内源性 大肠杆菌 基于转录-翻译（TX-TL）的无细胞表达系统，其蛋白质产量可与基于T7的系统相当，且成本较类似的商业系统降低98%。4,5 缓冲液和粗制细胞提取物的制备方法，以及三管式TX-TL反应的实施过程均被详细描述。整个方案的准备工作需时五天，单次制备所获得的材料足以进行多达3000次的单个反应。制备完成后，每次反应从设置到数据采集与分析耗时不足8小时。可外源添加大肠杆菌以外的调控与转录机制， 大肠杆菌，例如 lac/tet 阻遏蛋白和 T7 RNA 聚合酶，可进行补充。6 mRNA和DNA降解速率等内源性特性也可进行调整。7 TX-TL 无细胞表达系统已成功应用于大规模电路组装、生物现象研究，以及在 T7 和内源性启动子下表达蛋白质。6,8 配套的数学模型可获取。9,10 该系统在合成生物学中具有独特应用，可作为原型设计平台，即“TX-TL 生物分子试验板”。

引言

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无细胞表达技术始于20世纪50年代，最初仅为单纯的翻译系统，数年后发展为利用T7噬菌体DNA实现转录-翻译偶联的系统。11,12 此后，人们开展了大量研究以优化粗细胞提取物（或称为 E. coli S30提取物）的制备。13,14 这些优化措施包括通过ATP再生或菌株改造来延长无细胞蛋白合成的持续时间，以及缩短实验周期并降低成本。15-17 此外，还存在使用重组组分替代粗细胞提取物进行表达的无细胞表达系统。5 粗细胞提取物和重组组分方法均已开发用于商业化应用。

随着合成生物学的发展，人们越来越需要一个特征明确的平台，用于测试和表达经过工程改造的生物模块与线路18,19 。该平台必须具备多功能性、特征明确、易于操作，并专注于用户提供的组分。尽管细胞无提取物系统比其他方法早发展了半个世纪，但基于大肠杆菌（E. coli）的细胞无提取物系统本质上符合这些要求，因为它们是以简化的体外（in vitro）形式再现细胞过程，避免了生长和代谢的复杂性。此外，所有在活体（in vivo）条件下对大肠杆菌（E. coli）研究所积累的基础知识均可直接应用于大肠杆菌（E. coli）的细胞无提取物系统。

尽管无细胞表达系统在合成生物学中具有应用潜力，但迄今为止，大多数无细胞表达系统的目标仍是最大化蛋白质和代谢产物的产量。这一目标通常通过T7噬菌体RNA聚合酶在T7启动子驱动下转录序列来实现。20 尽管该表达方式高效且稳定，但这些系统仅适用于高度特化的用途。其细胞调控手段有限，目标DNA模板必须重新设计以包含T7启动子，且某些序列（如核糖体复合物）无法被有效转录和组装。21,22 现有的无细胞表达系统在保持内源性调控机制的同时难以维持高产量，而这种灵活性对于合成生物学而言至关重要。

我们开发了一种内源性 E. coli 无细胞表达系统，在保留先前系统所展现的高效蛋白质表达能力的基础上，进一步增强了灵活性，允许基于内源性以及外源性（T7 或其他）机制进行基因表达与调控。本方案最初基于 Kigawa et al. (2004) 和 Liu et al. (2005) 的方法，但进行了多项重要改进：采用谷氨酸镁和谷氨酸钾替代乙酸镁和乙酸钾以提高效率，去除2-巯基乙醇，并使用珠磨法裂解细胞。17,23,24 与均质化、基于压力的方法或超声破碎相比，珠磨法因成本更低且产率相当而被选用。23 能源物质采用3-磷酸甘油酸（3-PGA），因其相较于磷酸肌酸和磷酸烯醇式丙酮酸可获得更高的蛋白质产量。4,25 本系统在使用基于sigma70并带有λ噬菌体操纵子的启动子或T7驱动启动子时，均可产生高达0.75 mg/ml的报告蛋白，产量与其它商业系统相当。4,6 制备所有必要试剂共需五天（图1）。此外，与类似的商业无细胞系统相比，本系统可降低98%的成本——每10 μl反应的材料成本为0.11美元，若计入人工成本则升至0.26美元（图2）。

方案

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1. 粗提细胞提取物的制备

在三天内制备粗制细胞提取物需要两人协作以确保操作高效。该方案在功能上分为三个部分：培养物生长（步骤 1.1 至步骤 1.11）、细胞裂解（步骤 1.12 至步骤 1.37）以及提取物澄清（步骤 1.38 至步骤 1.52）。为方便起见，本方案按天数划分。理想的提取物可从质粒 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500（Addgene #40019）表达出 0.75 mg/ml 的 deGFP，且粗制细胞提取物的蛋白浓度介于 27–30 mg/ml 之间4。然而，提取物特性在不同批次之间可能存在差异。以下配方可制备约 3,000 次单个反应所需的量（6 ml 粗制细胞提取物）。若需缩小规模，建议使用的量不少于本方案所列数值的 1/6。由于时间限制，不建议扩大规模。

第1天

  1. 按照表1所述准备细菌培养基、培养平板和培养基添加剂。配方见补充材料1。
  2. 从-80 °C中取出BL21-Rosetta2菌株，在2xYT+P+Cm琼脂平板上划线，于37 °C培养至少15小时，直至菌落清晰可见。注：氯霉素（Cm）用于筛选BL21-Rosetta2菌株中编码稀有tRNA的质粒。

第2天

  1. 按照表2所述配制缓冲液和添加剂。具体配方见补充材料1。
  2. 准备并灭菌第3天所需的材料，包括：6个4 L带铝箔封口的锥形瓶（已高压灭菌）、4个1 L无菌离心瓶、漏斗（已高压灭菌）、100 g 0.1 mm玻璃珠（已高压灭菌）、2个搅拌子（已高压灭菌）、1 L和500 ml量筒（已高压灭菌）、2个1 L烧杯（已高压灭菌）、3 ml带18 G针头的注射器（无菌）、2–3个浮子、2–3个10 k MWCO透析盒（无菌）、比色皿。
  3. 制备小规模培养物1。在12 ml无菌培养管中加入4 ml 2xYT+P培养基和4 μl氯霉素（Cm），于37 °C预热30分钟。
  4. 用2xYT+P+Cm琼脂平板上的单菌落接种小规模培养物1，在220 rpm、37 °C条件下培养8小时。
  5. 7小时30分钟后，制备小规模培养物2。在无菌的250 ml锥形瓶中加入50 ml 2xYT+P培养基和50 μl氯霉素（Cm），于37 °C预热30分钟。
  6. 取100 μl小规模培养物1接种至小规模培养物2中，在220 rpm、37 °C条件下培养8小时。

第3天

  1. 称量四个空的无菌 50 ml Falcon 管，并将质量记录在表 3中。将 Falcon 管置于冰上预冷；这些管将在步骤 1.18 中使用。
  2. 在步骤 1.8 开始后 7 小时 30 分钟，准备最终的细菌培养基。使用无菌 1 L 量筒，将 660 ml 的 2xYT+P 培养基转移至六个 4 L 锥形瓶中的每一个，并在 37 °C 下预热 30 分钟。注：建议使用 4 L 或更大的锥形瓶以保证充分通气。
  3. 向每个 4 L 锥形瓶中加入 6.6 ml 的 mini-culture 2。在 220 rpm、37 °C 下培养，直至培养物在 600 nm 处的 OD 值达到 1.5–2.0（对应于对数中期生长阶段）。通过 1:10 的培养物稀释液定期检测 OD 值以确保准确性。此步骤不应超过 3 小时至 3 小时 45 分钟；在对数中期快速生长并收集对提取物质量至关重要。
  4. 生长结束后立即均匀地将所有培养物转移至四个 1 L 离心瓶中，并在 4 °C 下以 5000 × g 离心 12 分钟，以沉淀细菌细胞。
  5. 在离心过程中，通过向 2 L 已预先配制的 S30A 缓冲液中加入 4 ml 的 1 M DTT 完成 S30A 缓冲液的配制。混匀后将缓冲液置于冰上保存。
  6. 离心结束后，通过倾倒并用无菌纸巾轻拍离心瓶的方式彻底去除步骤 1.12 中的上清液。
  7. 向四个离心瓶中的每一个加入 200 ml 4 °C 的 S30A 缓冲液，剧烈振荡瓶子，直至沉淀完全溶解且无任何团块残留。然后在 4 °C 下以 5,000 g 离心 12 分钟。
  8. 通过倾倒并用无菌纸巾轻拍离心瓶的方式彻底去除上一步的上清液。
  9. 重复步骤 1.15 和 1.16。
  10. 向每个离心瓶中加入 40 ml 4 °C 的 S30A 缓冲液。将每个沉淀与 S30A 的混合物转移至步骤 1.9 中预冷的 Falcon 管中。注：此步骤旨在将沉淀转移至更小的容器中。
  11. 在 4 °C 下以 2,000 g 离心 Falcon 管 8 分钟。通过倾倒去除上清液。
  12. 再次在 4 °C 下以 2,000 g 离心 Falcon 管 2 分钟。用移液器彻底去除残留的上清液。保持在冰上。
  13. 称量含有沉淀的四个 Falcon 管，并将质量记录在表 3中。根据表 3中的特定公式计算沉淀质量、所需 S30A 缓冲液体积以及所需珠子质量。
  14. 沉淀的正确装填和珠击处理对制备高质量提取物至关重要，是本流程中最关键的步骤。建议在操作前观看相关视频。若未能避免气泡或珠子分布不均，将导致提取效率低下。
  15. 向每个 Falcon 管中加入表 3中计算出的 S30A 缓冲液体积，涡旋至均匀，然后放回冰上。
  16. 在保持其他 Falcon 管处于冰上的同时，向单个 Falcon 管中分三次加入珠子，每次使用总量珠子的 1/3。每次加入珠子后，涡旋 30 秒。在每次涡旋之间及最后一次涡旋后将 Falcon 管放回冰上。加入最后一份珠子后，确保珠子均匀分布，形成浓稠的糊状物。
  17. 使用无菌刀片切去 5 ml（体积）移液器吸头的末端，形成 3–4 mm 的开口，以备使用。将移液器调节至 2 ml。注：不同的移液器和吸头提供的吸力可能不足以吸取和释放浓稠的珠-细胞溶液；可改用剪去末端的 1 ml 移液器吸头。
  18. 将 20 个珠击管置于冰上预冷。
  19. 使用改装后的移液器验证细胞-珠混合液的高黏度。该溶液应黏稠至几乎无法从移液器尖端排出的程度。若过于黏稠，可根据步骤 1.25 调整移液器吸头。若黏度不足，可逐步添加珠子（沉淀质量 × 0.05），最多不超过（沉淀质量 × 5.1）。每次添加珠子后，涡旋 30 秒并放回冰上。参见图 3a以了解黏度示例。
  20. 使用改装后的移液器从 Falcon 管中取出细胞-珠混合液，并转移至无菌珠击管中，使珠击管填充至四分之三满。在台式小型离心机上极短时间（1 秒）离心，以去除气泡而不扰动珠子分布。参见图 3b–d了解珠击管装填过程的静态图像。
  21. 继续添加细胞-珠混合液，形成凹形弯月面。
  22. 在珠击管盖内侧滴加极少量的细胞-珠混合液，注意不要阻碍盖子外缘；否则珠击管将无法完全闭合。将盖子在平坦表面上轻敲，并确认盖子底部无气泡。
  23. 用上一步的珠击管盖盖紧珠击管。交由助手进行珠击处理。若操作正确，盖子应密封紧密，无可见气泡，且极少（或无）细胞-珠混合液溢出。若发现气泡或盖子未完全闭合，需重新进行装填。
  24. 涡旋步骤 1.24 中剩余细胞-珠混合液的 Falcon 管，确保珠子均匀分布。重复步骤 1.28 至 1.31，直至 Falcon 管为空；然后对每个额外的 Falcon 管重复步骤 1.24 至 1.31。
  25. 同时进行步骤 1.33 至 1.38。助手将步骤 1.31 中装填好的珠击管取走并置于冰上。当收集到两个装填好的珠击管并在冰上放置至少一分钟后，开始珠击处理。
  26. 以 46 rpm 击打一个管 30 秒。在此期间，将另一个管倒置放在冰上击打。
  27. 重复上一步，使每个装填好的珠击管总共被击打 1 分钟。
  28. 重复步骤 1.33 至 1.35，直至处理完 8 个装填好的珠击管（或离心机所能容纳的最大数量）。然后，从 15 ml Falcon 管构建过滤装置（图 3e）。将一个新的珠击管盖（平面朝上）置于 15 ml Falcon 管底部。然后，取下已处理珠击管的盖子，将微型层析柱牢固地压在已处理珠击管末端，直至完全密封。折断微型层析柱的洗脱端，将微型层析柱（洗脱端朝下）放入空的珠击管中。将此复合体放入 15 ml Falcon 管中。对所有 8 个装填好的珠击管重复此操作；完成后保持在冰上。
  29. 将 8 个过滤装置（Falcon 管不加盖）在 4 °C 下以 6,000 g 离心 5 分钟，以分离提取物和沉淀与珠子。
  30. 验证每个珠击管是否产生有效的提取物。正确击打后的提取物不应浑浊，且沉淀应分为两层明显不同的层次。弃去所有浑浊的管，将非浑浊管的上清液转移至单独的 1.75 ml 微型离心管中，尽可能少地带入沉淀。保持在冰上，直至所有珠击管处理完毕。参见图 3f以比较正确与错误处理的珠击管。
  31. 将上一步的微型离心管在 4 °C 下以 12,000 g 离心 10 分钟。
  32. 使用移液器将无沉淀的上清液转移至空的珠击管中，将 500 μl 合并至一个新的珠击管中。
  33. 将上一步产物在 220 rpm、37 °C 下孵育 80 分钟，移除珠击管盖。此步骤利用珠击过程中释放的内源性外切核酸酶消化残留的核酸，可将珠击管直立放置于组织培养管中完成。
  34. 准备透析材料。通过向 2 L 已预先配制的 S30B 缓冲液中加入 2 ml 的 1 M DTT 完成 S30B 缓冲液的配制。混匀后，将 900 ml 加入两个无菌 1 L 烧杯中。向每个烧杯中加入无菌磁力搅拌子；保持在 4 °C。
  35. 步骤 1.41 后，提取物应呈现浑浊状态。将提取物以 1.5 ml 分装至 1.75 ml 微型离心管中，并在 4 °C 下以 12,000 g 离心 10 分钟。
  36. 使用移液器将无沉淀的上清液合并转移至冰上的 15 ml Falcon 管中，通过盖紧管盖并倒置充分混匀。在冰上保留 10 μl 上清液用于步骤 1.47。
  37. 确定产生的提取物总量，并通过将 10k MWCO 透析盒浸入 S30B 缓冲液中 2 分钟进行水合，假设每个透析盒处理 2.5 ml 提取物。
  38. 向每个透析盒中加入 2.5 ml 提取物。每个烧杯最多可容纳 2 个透析盒；在 4 °C 下搅拌透析 3 小时。注：允许部分填充透析盒。透析可提高蛋白质产量。
  39. 在上一步进行期间，使用步骤 1.44 中保存的提取物通过 Bradford 法测定提取物的蛋白质浓度。详见补充材料 2。
  40. 透析完成后，将提取物以 1.5 ml 分装至 1.75 ml 微型离心管中。在 4 °C 下以 12,000 g 离心 10 分钟。管底将形成沉淀。
  41. 使用移液器将上一步的澄清上清液合并转移至冰上的 15 ml Falcon 管中。通过倒置 5–10 次使其均质化。
  42. 根据步骤 1.47 中 Bradford 法测定的浓度，确定分装至各个 1.75 ml 管中的提取物量。每个单独的管中应含有 810–900 mg 总蛋白的体积。提取物的总蛋白浓度应高于 27 mg/ml。此步骤需助手协助以高效完成。注：若提取物浓度低于 30 mg/ml，则以 30 μl 分装；若浓度更高，则相应调整；例如，28 mg/ml 的提取物以 30 μl 分装，32 mg/ml 的提取物以 28.1 μl 分装。
  43. 按照步骤 1.50 进行提取物分装，注意避免产生气泡。在液氮中快速冷冻提取物。注：含气泡的分装样品可通过在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 秒去除气泡。
  44. 使用滤网从液氮中取出管子，并立即储存于 -80 °C。安全提示：佩戴护目镜；由于液氮与室温之间的温差，提取物管的管盖可能弹出。

2. 氨基酸溶液的配制

应批量制备氨基酸溶液。以下配方使用一整套RTS氨基酸试剂盒，可制备约11,000次单个反应所需的量。若需缩小规模，建议至少使用半套试剂盒。各氨基酸储备液的体积均为1.5 ml，浓度为168 mM，亮氨酸除外，其浓度为140 mM。氨基酸溶液的最终组成为：亮氨酸5 mM，其余所有氨基酸均为6 mM。此为4倍工作浓度。

  1. 从 -20℃ 中取出全部 20 种氨基酸 °C，于室温下解冻。解冻后涡旋振荡直至氨基酸完全溶解，并在37℃孵育 °如有必要，将所有氨基酸溶解后置于冰上。 除Asn、Phe和Cys外，其余均置于室温保存。Cys可能无法完全溶解.
  2. 在冰上，向一个无菌的50 ml Falcon管中加入12 ml无菌水。
  3. 加入每种氨基酸 1.5 ml 按以下顺序，每次加入后需涡旋混匀 Falcon 管，并始终保持溶液置于冰上：Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Leu、Cys。Cys 可以悬浮液形式加入。 加入后涡旋至溶液相对澄清，并在37℃孵育 °如有必要，可加热至 37 °C。Cys 可能无法完全溶解.
  4. 将氨基酸溶液分装至50个管中，每管26 μL μl，置于冰上。将剩余部分以500 μ每管加样后置于冰上。26 μl 部分 aliquots 将用于提取物的校准，而 500 μl 分装的样品将用于缓冲液的制备。 分装时，需频繁涡旋混匀主液，以避免悬液分布不均.
  5. 在液氮中快速冷冻等分试样，并于 -80 ℃ 保存 °C. 安全：佩戴护目镜；由于液氮与室温之间的温差，提取管的管盖可能发生弹出.
  6. 可选：对新制备的氨基酸溶液与先前制备的氨基酸溶液进行活性测定。

3. 能量溶液的制备

能量溶液既用于校准粗提细胞提取物，也用于缓冲液的配制，应批量制备。以下配方可制备约10000次单个反应所需的量。若需缩小规模，建议用量不少于本方案所列数值的1/24。由于能量溶液成本较高，初次使用者可考虑按1/24比例制备。能量溶液的最终成分为：700 mM HEPES（pH 8）、21 mM ATP、21 mM GTP、12.6 mM CTP、12.6 mM UTP、2.8 mg/ml tRNA、3.64 mM CoA、4.62 mM NAD、10.5 mM cAMP、0.95 mM 亚叶酸、14 mM 亚精胺、420 mM 3-磷酸甘油酸，此为14倍工作浓度。如需要，表4中所列各组分可分别储存于-80 °C以备后续使用。

  1. 移除所有化学品 表 4 从 -80 °C, -20 °C，或 4 °室温放置30分钟。
  2. 按照所述制备储备液 表 4。参见 补充材料 1 用于配方。配制后将所有溶液置于冰上。
  3. 在15 ml Falcon离心管中，加入 按以下顺序，每次加入后需涡旋混匀 Falcon 管，并将溶液保持在冰上：3.6 ml 2 M HEPES, 144 μl 水，1.39 ml 核苷酸混合液，576 μl 50 mg/ml tRNA，576 μl 65 mM CoA，276 μl 175 mM NAD，170 μl 650 mM cAMP，288 μl 33.9 mM 次黄嘌呤酸，144 μl 1 M 亚精胺和 3.09 ml 1.4 M 3-磷酸甘油酸
  4. 将能量溶液分装至50个管中，每管7 μL μl，置于冰上。将剩余部分以150 μ每管加样后置于冰上。7 μl 部分 aliquots 将用于提取物的校准，而 150 μl aliquots 将用于缓冲液的制备。 分装时，需频繁涡旋混匀主储备液.
  5. 将分装样品在液氮中快速冷冻，然后于 -80 ℃ 保存 °C. 安全事项：佩戴护目镜；由于液氮与室温之间的温差，提取管的管盖可能发生脱落.
  6. 可选：对新制备的能量溶液与先前制备的能量溶液进行活性测定。

4. 缓冲液制备

缓冲液制备需要先完成粗提细胞提取物制备、氨基酸溶液制备和能量溶液制备。每批粗提细胞提取物需使用特定的缓冲液。本步骤依次优化谷氨酸镁、谷氨酸钾和DTT，以获得最高表达水平的反应体系。以下方案使用预先编写好的模板 TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx（补充材料3）来校准预先制备的粗提细胞提取物并配制缓冲液。然而，也可不使用模板，通过手动优化谷氨酸镁、谷氨酸钾和DTT的浓度，并设置缓冲液与提取物共同占总反应体积的75%，从而完成校准和缓冲液配制。若采用手动校准，最终反应条件见步骤5。

  1. 填写“通用数据”表格。
  2. 在冰上解冻以下试剂：100 mM Mg-谷氨酸盐（4 °C）、3 M K-谷氨酸盐（4 °C）、6 mM 氨基酸溶液（26 μl，-80 °C）、能量溶液（7 μl，-80 °C）、100 mM DTT（-20 °C）、阳性对照DNA（-20 °C）、40% PEG-8000（4 °C）、粗制细胞提取物（-80 °C）和水（4 °C）。注意：阳性对照建议使用1 nM工作浓度的pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500（Addgene质粒40019）（激发波长485 nm，发射波长525 nm），或选择可产生高强度信号的其他参照物。4
  3. 准备七份10.5 μl的反应体系，通过将不同量的Mg-谷氨酸盐储备液分装至各微量离心管中，测试4–10 mM范围内额外添加的Mg-谷氨酸盐浓度效应。注意：尽管初始反应体积为10.5 μl，最终反应体积为10 μl。
  4. 根据“Mg-谷氨酸盐校准”模板中的指示配制主混合液，并额外加入80 mM K-谷氨酸盐。保持冰上操作，并在每加入一种组分后充分涡旋混匀。注意：此处及模板中所列数值为除用于制备粗制细胞提取物的S30B缓冲液中已含有的Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐和DTT之外的额外添加量。
  5. 将主混合液加入含Mg-谷氨酸盐的样品中并建立反应体系。具体操作详见步骤5.10至5.13。
  6. 在29 °C条件下进行反应，可使用恒温培养箱或酶标仪。
  7. 通过终末蛋白表达水平和蛋白表达的最大速率确定最佳Mg-谷氨酸盐浓度（图4a）。注意：反应时间因实验而异，通常不超过8小时。
  8. 在“K-谷氨酸盐校准”部分重复步骤4.2至4.7，Mg-谷氨酸盐浓度设定为步骤4.7中确定的最优值。
  9. 在“DTT校准”部分重复步骤4.2至4.7，Mg-谷氨酸盐浓度设定为步骤4.7中确定的值，K-谷氨酸盐浓度设定为步骤4.8中确定的值。注意：我们发现额外添加DTT对终末蛋白表达水平无显著影响。
  10. 根据“缓冲液组成”部分校准所得数值确定待配制缓冲液的组分。根据所制备粗制细胞提取物的总量，生成特定体积缓冲液的主混合液配方。
  11. 按照主混合液配方所列，在冰上解冻各组分。解冻后立即配制主混合液，保持冰上操作，并在每加入一种组分后充分涡旋混匀。
  12. 按照“缓冲液组成”中规定的量进行分装。使用液氮快速冷冻缓冲液管。分装过程中需频繁涡旋主储备液。
  13. 使用滤网从液氮中取出冻存管，并立即置于-80 °C保存。安全提示：请佩戴护目镜；由于液氮与室温温差较大，提取物管盖可能弹出。

5. TX-TL 反应的实验操作

最终反应条件为：8.9–9.9 mg/ml 蛋白质（来自粗提细胞提取物），4.5–10.5 mM 谷氨酸镁，40–160 mM 谷氨酸钾，0.33–3.33 mM DTT，每种氨基酸各 1.5 mM（亮氨酸除外），亮氨酸 1.25 mM，50 mM HEPES，1.5 mM ATP 和 GTP，0.9 mM CTP 和 UTP，0.2 mg/ml tRNA，0.26 mM CoA，0.33 mM NAD，0.75 mM cAMP，0.068 mM 亚叶酸，1 mM 精脒，30 mM 3-PGA，2% PEG-8000。一个基本的 TX-TL 反应包含三个组分（试管）：粗提细胞提取物、缓冲液和 DNA。其比例为：75% 缓冲液和提取物，25% DNA。反应体积可以变化，我们通常使用 10 μl 的体积，以最小化反应体积并适用于 384 孔板操作。较大体积的反应需要振荡以确保充分供氧。以下方案使用预先编写好的模板 TXTL_JoVE.xlsx（补充材料 4）来进行 10 μl 反应。紫色项目表示需用户输入的数值，蓝色项目表示需额外添加至反应中的试剂。然而，也可不使用模板，直接依据上述反应条件进行反应。

  1. 填写“一般数据”表格。
  2. 在“主混合物制备”部分，将步骤 4.1 中的提取物百分比数值填入紫色框中。
  3. 设计实验 在计算机中 使用“主混合物制备”（第10-17行）和“DNA制备”（第19-50行）部分。通常，可将常量放入“主混合物制备”部分，而将变量放入“DNA制备”部分。 尽量减少每次实验的样本数量，以避免样本蒸发和实验起始时间偏差。参见 图6 用于样品设置。
  4. 在“主混合物制备”部分，添加诱导剂或蛋白质等试剂，这些试剂将以恒定浓度加入所有样品中。从第14行开始填写蓝色阴影区域，每行对应一种试剂。单位为相对比例。
  5. 在“DNA制备”部分，加入具有样本特异性的DNA。样本编号#1和#2分别对应阳性对照和阴性对照。样本编号#3及以上的DNA及其储存浓度（ng/μL）可由用户自行定义。μl，长度（以碱基对计），期望的最终浓度（nM），以及重复次数（10次） μl 反应）。达到目标终浓度所需的贮存 DNA 量将自动计算。每行总量加总为 10.5×n，其中 n 为重复次数。 注意：尽管最终反应体积为10 μ升，计算基于总体积10.5 μ每次反应需额外增加1 μL，以补偿移液过程中的体积损失。
  6. 在“DNA 准备”部分，向蓝色列中添加试剂或特定样本所需的额外 DNA。可在“DNA 准备”部分计算以 nM 为单位的 DNA 储备液浓度，而特定样本的试剂需根据总体积 10.5×n 手动计算。所输入的体积将从同一行的水体积中扣除。
  7. 从“需解冻的管状物”中取出所需数量的缓冲液管、粗制细胞提取物管和阳性对照管，这些均存放于-20℃ °C 或 -80 °C，并在冰上解冻。
  8. 准备DNA样品。根据“DNA制备”部分，为每个样品编号在室温下将指定的DNA、水和用户提供的组分分装至微量离心管中。 注意：为避免样品损失，建议使用近期校准的移液器以及低吸附的移液器吸头和微量离心管。
  9. 当步骤5.7中的试管解冻后，根据橙色阴影框中的内容，准备包含缓冲液、提取物以及任何用户提供的全局组分的预混液，并置于冰上保存 每次添加组分后涡旋混匀. 注意：提取物极为黏稠。含有气泡的分装样品可在 4 ℃ 下以 10,000 × g 离心 30 秒以去除气泡 °中国台湾
  10. 根据“DNA Preparation”（O列）中橙色单元格所示的量，向每个DNA样本中加入相应量的主混合液，并在室温下保存。 将此视为反应开始时间.
  11. 涡旋混匀每个样品，然后在室温下以10,000 × g离心30秒，以收集残留样品并减少气泡。
  12. 若在微型离心管中进行反应，直接于29℃孵育 °C. 否则，用移液器加入10 μ将样品加入384孔板中。 注意：反应体系体积大于10 μ可能需要振荡以供氧。
  13. 在室温下以 4,000 x g 离心 30 秒，使残留样品沉降至管底并减少气泡。随后密封反应板以防止蒸发。
  14. 在29℃下进行反应 °C. 注：运行时间因实验而异，但通常少于 8 小时。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了一种为期五天的实验方案，用于制备基于内源性大肠杆菌（Escherichia coli）的TX-TL无细胞表达系统。试剂（粗提细胞提取物和缓冲液）制备的示例时间线见图1。试剂制备完成后，可在-80 °C下保存长达一年。试剂制备完毕后，实验的设置与实施可在8小时以内完成。

此外，我们优化了TX-TL无细胞表达系统的表达条件。对于用户自行添加的其他组分，例如缓冲液或DNA溶液，应预先校准其毒性。例如，由于盐含量不同，质粒的不同处理方法会导致表达量差异。我们还测试了Tris-Cl洗脱缓冲液对反应效率的影响（图5）。

粗品细胞提取物校准的一个示例（参见步骤 4.1 至 4.9）如图所示 图 4a总体而言，我们的实验表明，粗制细胞提取物对谷氨酸镁水平最为敏感，其次是对谷氨酸钾水平。为演示该无细胞表达系统，我们构建并测试了一个基于负反馈回路的系统 tet 抑制26 (图6在无细胞表达系统中，同一电路在有无 aTc 的条件下运行，八小时表达后 deGFP 报告蛋白的终点表达量变化达 7 倍。尽管本实验无需全局诱导剂或阻遏剂，但如有需要，可在“主混合物制备”步骤中添加。

实验时间线示意图；粗提细胞提取物、缓冲液制备、氨基酸溶液时间安排。
图 1. 粗提细胞提取物、氨基酸溶液和能量溶液制备的时间线。 上述为该实验方案典型操作的五天时间安排，已优化以适应过夜孵育和日间操作步骤。

显示无细胞系统成本构成的饼图；柱状图：成本与蛋白质表达分析。
图 2. 不同粗提物无细胞系统的成本与表达分析。a) TX-TL 无细胞表达系统的人力与材料成本构成。基于2012年12月的试剂价格，以及每小时14美元的人力成本。 b) TX-TL 无细胞表达系统与其他商业系统的成本比较。成本按每微升（μL）计算，尽管各试剂盒的反应体积可能不同。 c) TX-TL 无细胞表达系统与其他商业系统的产量比较。蛋白质表达产量依据制造商标准测定。 点击此处查看高清大图。

生物样品制备；微量管，离心机；蛋白质纯化，实验设置。
图 3. 珠磨管的装载与处理。a) 细胞-珠混合液正确黏度的示例。细胞-珠混合液的黏度受多种因素影响，包括加入的 S30A 缓冲液体积、加入的珠粒数量以及在冰上放置的时间。b) 珠磨管在快速台式离心前的装载状态。离心可去除装载过程中积聚的气泡。c) 台式离心后气泡上浮的情况。气泡大小不一，可用移液器吸头刺破或移除。d) 封盖前完全装满的珠磨管。珠磨管内形成弯月面，管帽足以覆盖液体并导致少量溢出。e) 正确装载的滤器装置。这些装置可重复使用。f) 正确与不正确处理的珠磨管对比。左侧管为处理良好的样品——其上层较小且界限清晰，上清液非常透明；右侧管则不理想，表现为较厚、浑浊的第二层及不透明的上清液。不理想的样品不应进行后续处理。

比较不同 Mg、K、DTT 浓度以及提取物 1 和 2 的最大荧光强度的柱状图。
图 4. 粗提物制备的特性。a) 粗细胞提取物的典型校准曲线。依次对粗提物中额外添加的 Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐和 DTT 水平进行校准。图中显示了反应 8 小时后的终点荧光值，以及基于 12 分钟滑动平均计算的蛋白质生成最大速率。根据这些曲线，额外添加的 Mg-谷氨酸盐适宜范围为 4 mM，K-谷氨酸盐为 60–80 mM，DTT 为 0–3 mM。请注意，每批粗提物均需针对这三个变量独立校准。b) 不同批次提取物之间的差异。图中显示了在不同日期制备的两批粗提物的终点荧光值；误差条表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。 点击此处查看高清大图。

纯化方法比较；柱状图；蛋白质分析；最大强度；Tris-Cl 浓度研究。
图 5. DNA 溶液对表达效率的影响。a) 两种不同质粒纯化方法的比较。使用仅 QiaPrep Spin Miniprep 试剂盒（纯化方法 1）或在此基础上追加 QiaQuick PCR 纯化试剂盒处理（纯化方法 2）制备 1 nM 的 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500。图中显示反应 8 小时后的终点荧光强度，以及基于 12 分钟滑动平均计算的最大蛋白质合成速率。误差线表示在不同日期进行的四次独立实验的标准差。b) 洗脱缓冲液（Tris-Cl）的影响。在无细胞表达反应中比较不同浓度 Tris-Cl 对 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 表达的影响。图中所示为反应体系中 Tris-Cl 的终浓度；所用洗脱缓冲液为 10 mM Tris-Cl。误差线表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。 点击此处查看高清大图。

PCR 准备表格、DNA 载体图谱以及显示有无 aTc 时随时间变化的蛋白质表达荧光强度图。
图 6. 负反馈回路的典型 TX-TL 实验结果。a) 无细胞表达反应的典型设置。比较负反馈回路的“开启”与“关闭”状态，并包含阳性和阴性对照。b) 负反馈回路的质粒图谱。c) 代表性实验结果。数据来源于 a) 和 b) 所示实验，信号已扣除阴性对照值。插图显示所用基因线路。误差条表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。 点击此处查看高清大图。

名称浓度用量灭菌方式备注
氯霉素 (Cm)34 mg/ml（溶于乙醇）1 ml过滤灭菌 (0.22 μM)可配制较大体积，于 -20 °C 保存以备后续使用。
含P和氯霉素的2xYT琼脂平板 (2xYT+P+Cm 琼脂平板)31 g/L 2xYT，40 mM 磷酸氢二钾，22 mM 磷酸二氢钾，34 μg/ml 氯霉素1 个平板高压灭菌
含P的2xYT培养基 (2xYT+P 培养基)31 g/L 2xYT，40 mM 磷酸氢二钾，22 mM 磷酸二氢钾4 L高压灭菌

表1. 粗提细胞提取物方案第1天所用试剂。

名称浓度用量灭菌方式备注
Tris 碱2 M250 ml过滤灭菌（0.22 μM）或高压灭菌可于室温保存。
DTT1 M6 ml过滤灭菌（0.22 μM）可配制较大体积，分装后于 -20 °C 保存以备后续使用。
S30A 缓冲液14 mM 谷氨酸镁，60 mM 谷氨酸钾，50 mM Tris，pH 7.72 L高压灭菌使用醋酸滴定至 pH 7.7。使用前加入 DTT 至终浓度为 2 mM。4 °C 保存。
S30B 缓冲液14 mM 谷氨酸镁，60 mM 谷氨酸钾，约 5 mM Tris，pH 8.22 L高压灭菌使用 2 M Tris 滴定至 pH 8.2。使用前加入 DTT 至终浓度为 1 mM。4 °C 保存。

表2. 粗提细胞提取物方案第二天所用试剂。

Falcon
1234
空的 50 ml Falcon（g）
含有沉淀的 50 ml Falcon（g）
沉淀质量 （含沉淀的 50 ml Falcon - 空的 50 ml Falcon）（g）
需加入的 S30A 缓冲液体积 （沉淀质量 × 0.9）（ml）
需加入的磁珠总质量 （沉淀质量 × 5.0）（g）

表3. S30A缓冲液和珠质量计算器，用于粗提细胞提取物方案的第3天。

名称浓度体积灭菌方式备注
HEPES2 M, pH 84 ml无需灭菌调节 pH 至 8，需用 KOH 滴定。
核苷酸混合液156 mM ATP 和 GTP，94 mM CTP 和 UTP，pH 7.51.5 ml无需灭菌调节 pH 至 7.5，需用 KOH 滴定。
tRNA50 mg/ml600 μl无需灭菌
CoA65 mM600 μl无需灭菌
NAD175 mM，pH 7.5–8300 μl无需灭菌调节 pH 至 7.5–8，需用 2 M Tris 滴定。
cAMP650 mM，pH 8200 μl无需灭菌调节 pH 至 8，需用 2 M Tris 滴定。
亚叶酸33.9 mM300 μl无需灭菌尽管仅需 300 μl，补充材料中的配方为 1.15 ml。
亚精胺1 M150 μl无需灭菌4 °C 保存，加热至 37 °C 溶解。
3-磷酸甘油酸（3-PGA）1.4 M，pH 7.53.2 ml无需灭菌调节 pH 至 7.5，需用 2 M Tris 滴定。

表4. 能量溶液制备方案所需试剂。

附录材料 1. 物品配方。

氯霉素，34 mg/ml：取0.51 g氯霉素，加入乙醇至15 ml。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，分装至1 ml离心管中，于-20 °C保存备用。

2xYT+P+Cm 琼脂平板：称取 1.24 g 2xYT、1.6 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、0.88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液、0.6 g 琼脂，加水至 40 ml。高压灭菌。冷却至 50 °C 后加入 40 μl 氯霉素（Cm）。分装 25 ml 至 100 x 15 mm 培养皿中，静置冷却 1 小时。

2xYT+P 培养基： 配制 124 g 2xYT、160 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液，并加水至 4 L。分装为 2 份 1.88 L 和 1 份 0.24 L。高压灭菌。

Tris 碱，2 M：称取 60.57 g Tris 碱，加水至 250 ml。灭菌后室温保存备用。

DTT，1 M：称取 2.31 g DTT，加水至 15 ml。过滤除菌（0.22 μM），分装至 1 ml 离心管中，-20 °C 保存备用。

S30A 缓冲液：称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 50 ml 2 M Tris 溶液，用乙酸调节 pH 至 7.7，加水定容至 2 L。121 °C 高压灭菌，4 °C 保存，使用前加入 4 ml 1 M DTT。

S30B 缓冲液：称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 2 M Tris（调至 pH 8.2），加水定容至 2 L。经高压灭菌后，4 °C 保存，使用前加入 2 ml 1 M DTT。

HEPES：取1.91 g HEPES（分子量238.21），用KOH调节pH至8，并加水至4 ml。

tRNA： 准备 30 mg tRNA 并加水至 600 μl。

CoA： 准备 30 mg 的 CoA（分子量 767.53）并加水至 600 μl。

NAD：加入34.83 mg NAD（分子量663.43）、2 M Tris（调至pH 7.5–8）以及水，定容至300 μl。（加入27 μl 2 M Tris以将溶液调至pH 7.5–8）。

cAMP：加入 42.80 mg cAMP（分子量 329.22）、2 M Tris（调至 pH 8）和水至终体积 200 μl。（加入 73 μl 2 M Tris 溶液以将 pH 调至 8）。

亚叶酸（33.9 mM）：向20 mg亚叶酸钙盐固体（分子量511.5）中加入1.15 ml水。

亚精胺（Spermidine）：取23.55 μl亚精胺（分子量145.25），加水至150 μl。先在37 °C短暂融化，然后在室温下配制。
3-磷酸甘油酸（3-PGA）：称取1.03 g 3-磷酸甘油酸（分子量230.02），加入2 M Tris（调至pH 7.5）和水，定容至3.2 ml（加入1.73 ml 2 M Tris溶液以调节pH至7.5）。

核苷酸混合物：加入145 mg三磷酸腺苷二钾盐二水合物（分子量619.4）、133 mg三磷酸鸟苷二钠盐（分子量567.14）、79.4 mg三磷酸胞苷二钠盐二水合物（分子量563.16）、82.6 mg三磷酸尿苷三钠盐二水合物（分子量586.12），加入15%稀释的KOH（调至pH 7.5），加水至1.5 ml。（加入353 μl 15%稀释的KOH使溶液pH达到7.5）。

补充材料 2. Bradford 测定法。

  1. 从 4 °C 取出 Bradford 试剂，置于室温下平衡。
  2. 配制 50 μl 浓度为 1 mg/ml 和 0.1 mg/ml 的 BSA 标准品。
  3. 配制 40 μl 来自步骤 1.47 的提取物的 20 倍稀释液。
  4. 向 7 个比色皿中各加入 800 μl 水。
  5. 配制标准曲线比色皿：0 mg/ml、1 mg/ml（10 μl 0.1 mg/ml BSA）、2 mg/ml（20 μl 0.1 mg/ml BSA）、4 mg/ml（4 μl 1 mg/ml BSA）、6 mg/ml（6 μl 1 mg/ml BSA）。
  6. 配制实验组比色皿：分别加入 2 μl 和 4 μl 样品。
  7. 向每个比色皿中加入 200 μl Bradford 试剂，用移液器充分混匀。室温孵育至少 10 分钟。
  8. 使用步骤 6.5 中的比色皿在 OD 595 nm 处测定标准曲线；若 r2 < 0.95，则舍弃该标准曲线。
  9. 使用步骤 6.6 中的比色皿在 OD 595 nm 处测定提取物浓度。

补充材料 3. 缓冲液校准电子表格。

请参见 TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx。

补充材料 4. 无细胞表达运行电子表格。

参见 TXTL_JoVE.xlsx。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述的基于内源性Escherichia coli的TX-TL无细胞表达系统是一种易于操作的三管反应体系，从实验设置到数据收集可在八小时以内完成。制备所有试剂的全过程共需五天时间（其中仅一天需要大量人力），但可制得可供3,000次反应使用的粗提物以及可供10,000次反应使用的缓冲液制备试剂（图1）。此外，粗提物和缓冲液制备试剂在-80 °C下至少可稳定保存1年，因此单次制备可多次使用。4 每10 μl反应的成本为0.11美元（包含人工成本则为0.26美元），较同类商业系统降低98%（图2）。

然而，该系统仍存在一些尚未解决的局限性。每次制备的粗提细胞提取物的最终效率可能因操作者熟练程度和环境条件而异，尽管典型的产量差异通常在 5-10% 之间（图 4b）。因此，终点表达水平和表达动态在不同批次之间存在可预期的批间差异。在提取物未被完全表征或提取过程未实现完全自动化之前，这些差异可能仍将持续存在。如果使用该无细胞表达系统进行敏感的定量实验，建议使用同一批次的粗提细胞提取物完成所有实验。单批粗提细胞提取物可获得约 3000 次反应的产量，足以满足典型的实验课程需求。尽管我们推测通过扩大规模并实现流程自动化可消除变异，但此类尝试将需要大量的资源投入。

此外，尽管终点表达水平相对容易测定，但对于无细胞系统内在动力学的理解仍需进一步研究。已知资源竞争和资源限制均会影响表达动力学。例如，内源性σ70因子的有限性可能导致饱和状态，增加DNA模板所产生的表达谱类似于核苷酸或氨基酸耗竭时的情况。9,27 然而，要利用该系统，并不需要完全理解其动力学特性。对于单纯提高产量的优化，可通过机器学习方法实现。28 资源竞争与限制的相关问题可通过基于实验数据验证的数学模型加以研究。

本文所述方案已针对 BL21-Rosetta2 菌株进行优化，但可推广至其他 E. coli 菌株。BL21-Rosetta2 的某些修饰，例如敲除编码 lon 蛋白酶的基因以及引入编码稀有 tRNA 的基因，有助于实现蛋白质产量的最大化。我们曾尝试使用另外两种提取物菌株——仅含 BL21 及 BL21 trxA 敲除菌株——进行本方案，发现其蛋白质产量降低了约 50%。我们推测，使用其他菌株时产量亦会类似地减少。其他参数的改变，例如以 LB 或其他富营养肉汤替代 2xYT 培养基，也会导致蛋白质产量下降。

利用内源性和外源性转录-翻译系统及调控机制的无细胞表达系统，在蛋白质和代谢物表达以及合成生物学领域具有广泛的应用。3,29 人们可以设想，在一个用户可控的环境中，通过结合使用大肠杆菌（E. coli）内源启动子与外源提供的转录和调控元件，突破仅依赖T7调控回路的限制，实现复杂生物分子的合成。由于不受细胞分裂和代谢的限制，诸如“抑制振荡器”（repressilator）等合成回路，或青蒿素生物合成通路等代谢工程通路中的变异性可被降低或更深入理解。30,31 我们已利用这些优势实现了基因开关的构建，并深入研究了σ因子的隔离机制。9,32 此类技术还可作为“最小”或“人工”细胞的核心基础——即由提取物构成的小型化、特征明确且自给自足的功能单元。33,34

最终，我们预期这种内源性无细胞表达系统可立即作为合成生物学的原型开发平台。该系统被称为“TX-TL 生物分子试验板”，提供了一个可控的环境，使最终将用于体内表达的合成基因线路能够进行多轮原型设计——即在基础质粒、线性或化学合成的 DNA 上进行测试，随后分析结果并快速修改。目前正开发的预测性数学模型可辅助原型设计过程。通过在非最终版本的基因线路构建中省去克隆和体内操作步骤，我们预期可将工程设计周期从目前的数周缩短至 1–3 天。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢Jongmin Kim、Dan Siegal-Gaskins、Anu Thubagere和Enoch Yeung在优化本实验方案过程中提供的帮助，感谢Clare Chen和Barclay Lee在项目初期阶段的支持。本研究工作部分由美国国防高级研究计划局（DARPA/MTO）“生命铸造厂”项目资助，合同号HR0011-12-C-0065（DARPA/CMO）。Z.Z.S. 还获得了加州大学洛杉矶分校/加州理工学院医学科学家培训项目奖学金以及美国国防部空军科学研究办公室国家国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金（32 CFR 168a）的支持。本文所表达的观点和结论均为作者个人观点，不应被解释为代表美国国防高级研究计划局或美国政府的官方立场，无论明示或暗示。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2xYTMP生物医学3012-032 
3-磷酸甘油酸Sigma-AldrichP8877 
ATPSigma-AldrichA8937 
Bacto-agarBD 诊断214010 
珠磨管（聚丙烯微量离心管）BioSpec522S 
珠子，直径0.1 mmBioSpec11079101 
BL21 Rosetta 2 大肠杆菌 菌株Novagen71402 
Bradford BSA 蛋白检测试剂盒伯乐（Bio-rad）500-0201 
cAMPSigma-AldrichA9501 
氯霉素Sigma-AldrichC1919 
辅酶ASigma-AldrichC4282 
胞苷三磷酸USB14121 
比色皿，1.5 mlFisher14-955-127 
DTTSigma-AldrichD0632 
亚叶酸Sigma-AldrichF7878 
GTPUSB16800 
HEPESSigma-AldrichH6147 
K-谷氨酸盐Sigma-AldrichG1149 
Mg-谷氨酸盐Sigma-Aldrich49605 
微型生物旋柱层析柱Bio-Rad732-6204 
NADSigma-AldrichN6522 
Nunc 384孔光学底板赛默飞世尔科技142761 
Nunc 封口膜赛默飞世尔科技232701 
PEG-8000PromegaV3011 
磷酸氢二钾溶液Sigma-AldrichP8584 
磷酸二氢钾溶液Sigma-AldrichP8709 
RTS 氨基酸样本套装5 端2401530 
Slide-A-Lyzer透析盒，10k MWCO（试剂盒）赛默飞世尔科技66382 
亚精胺Sigma-Aldrich85558 
Tris 碱FischerBP1521 
tRNA（来自 大肠杆菌)罗氏应用科学MRE600 
UTPUSB23160 
1 L 离心瓶贝克曼库尔特A98813此规格专用于Avanti J系列；请根据所用离心机选择相应规格的等效尺寸。
4L 锥形瓶Kimble Chase26500-4000 
Avanti J-26XP 离心机Beckman-Coulter393127或可使用容量为1 L的等效离心机。
Forma 480 轨道摇床Thermo Scientific480或同等规格的6x4升胸式摇床
JLA-8.1000 转子Beckman-Coulter363688或可容纳1 L、相当于5000 × g离心机转子。
Mini-Beadbeater-1BioSpec3110BX 
补充材料 1. 物品配方
氯霉素，34 mg/ml： 称取0.51 g氯霉素，加入乙醇定容至15 ml。过滤除菌（0.22 μm） μM），分装至1 ml离心管中，于-20℃保存 °C 以供后续使用。
2xYT+P+Cm 琼脂平板： 称取 1.24 g 2xYT、1.6 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、0.88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液、0.6 g 琼脂，加水至 40 ml。高压灭菌。冷却至 50 ℃ °C 并加入 40 μl Cm。取25 ml分装至100x15 mm培养皿中，静置冷却1小时。
2xYT+P 培养基： 称取124 g 2xYT，加入160 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液，并加水至4 L。分装为两份1.88 L和一份0.24 L。高压灭菌。
Tris 碱，2 M： 称取60.57 g Tris碱，加水至250 ml。灭菌后室温保存备用。
DTT，1 M： 准备 2.31 g DTT，加水至 15 ml，过滤除菌（0.22 μm） μM），分装至1 ml离心管中，于-20 ℃保存 °C，以备后续使用。
S30A 缓冲液： 称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 50 ml 浓度为 2 M 的 Tris 溶液，用乙酸调节 pH 至 7.7，加水定容至 2 L。121°C 高压灭菌，4 °C 保存 °C，使用前加入4 ml 1 M DTT。
S30B 缓冲液： 称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 2 M Tris（调至 pH 8.2），加水定容至 2 L。121 °C 高压灭菌，4 °C 保存 °C，在使用前加入 2 ml 1 M DTT。
HEPES： 称取1.91 g HEPES（分子量238.21），用KOH调节pH至8，加水定容至4 ml。
tRNA： 将30 mg tRNA溶于水，定容至600 μL μl.
辅酶A: 准备 30 mg 辅酶 A（分子量 767.53）并加水至 600 μL μl.
NAD： 加入 34.83 mg NAD（分子量 663.43）、Tris 至终浓度 2 M（调 pH 至 7.5–8.0），加水定容至 300 mL μl. （加入27 μ2 M Tris 溶液，调节溶液 pH 至 7.5–8。
cAMP： 加入42.80 mg cAMP（分子量329.22）、Tris至2 M（调pH至8），加水至200 μL μl. （加入 73 μ2 M Tris 溶液调至 pH 8
亚叶酸（33.9 mM）：将 20 mg 亚叶酸钙盐固体（分子量 511.5）溶于 1.15 ml 水中。
亚精胺： 准备 23.55 μ145.25 分子量的亚精胺溶液及水至 150 微升 μl. 在37℃短暂融化后，于室温下制备 °C.
3-磷酸甘油酸 加入1.03 g 3-磷酸甘油酸（分子量230.02）、2 M Tris（调至pH 7.5）和水，定容至3.2 ml。（加入1.73 ml 2 M Tris溶液以将pH调至7.5）。
核苷酸混合液： 加入145 mg三磷酸腺苷二钾盐二水合物（分子量619.4）、133 mg三磷酸鸟苷二钠盐（分子量567.14）、79.4 mg三磷酸胞苷二钠盐二水合物（分子量563.16）、82.6 mg三磷酸尿苷三钠盐二水合物（分子量586.12）、15%稀释的KOH（调至pH 7.5）以及水至1.5 ml。（加入353 μ加入15%稀释的KOH溶液，调节pH至7.5。
补充材料 2. Bradford 法测定蛋白浓度
  1. 从4℃取出Bradford试剂 °C，并置于室温。
  2. 准备 50 μ1 mg/ml 和 0.1 mg/ml 的 BSA 标准品
  3. 准备40 μl 步骤1.47中提取物的20倍稀释液。
  4. 加入800 μ向7个比色皿中加入l水。
  5. 准备标准比色皿，分别用于 0 mg/ml、1 mg/ml（10 μl 0.1 毫克/毫升 BSA），2 毫克/毫升（20 μl 0.1 毫克/毫升 BSA），4 毫克/毫升（4 μl 1 mg/ml BSA），6 mg/ml（6 μl 1 mg/ml BSA）
  6. 准备用于2的实验比色皿 μ样品 4 微升和 4 μ样品体积。
  7. 加入200 μ向每个比色皿中加入 Bradford 试剂 l，用移液器充分混匀。室温孵育至少 10 分钟。
  8. 使用第6.5步的比色皿在595 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。若相关系数 r2 &< 0.95
  9. 使用第 6.6 步的比色皿，通过 OD 595nm 测定提取物浓度。
补充材料 3. 缓冲液校准电子表格
参见 TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx.
补充材料 4. 无细胞表达运行电子表格。
请参见 TXTL _JoVE.xlsx.

参考文献

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.Z

The figure legend was update from:

Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).

to

Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

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