一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

摘要

人呼吸道合胞病毒（HRSV）可导致婴幼儿严重的细支气管炎。严重HRSV疾病发病机制的一部分由宿主免疫反应引起。利用HRSV刺激原代人免疫细胞，可提供一种快速且可重复的模型系统，用于研究炎症通路的活化及感染过程。

摘要

人类呼吸道合胞病毒（HRSV）感染的疾病严重程度表现多样，从轻度感染到危及生命的细支气管炎不等。严重疾病发病机制的重要组成部分是增强的免疫反应，导致免疫病理损伤。

在此，我们描述了一种用于研究人类免疫细胞对HRSV感染免疫应答的实验方案。首先，我们介绍了HRSV的培养、纯化及定量方法。随后，我们描述了一种人类 体外 外周血单个核细胞（PBMC）经活体人呼吸道合胞病毒（HRSV）刺激的模型可用于研究多种可能影响疾病严重程度的参数，包括先天性和适应性免疫应答。这些应答可在转录和翻译水平进行检测。此外，可通过流式细胞术便捷地检测细胞的病毒感染情况。综上所述，利用活体HRSV刺激PBMC提供了一种快速且可重复的模型系统，用于探究HRSV诱导疾病的潜在机制。

引言

人呼吸道合胞病毒（HRSV）是儿童下呼吸道感染最常见的病因。每年，有超过3300万名五岁以下儿童感染HRSV，导致超过300万例住院病例和近20万例死亡¹。越来越多的证据表明，HRSV对老年人以及患有基础慢性疾病的成人也构成重大威胁²。

大多数婴幼儿感染HRSV后表现为轻微症状，类似于普通感冒，无需临床干预。然而，少数患者因重症毛细支气管炎需要住院治疗和机械通气。

HRSV 疾病发病机制的一部分是宿主对感染产生过度且不充分的免疫反应^3,4。这一点可通过多项观察得到说明。病情最严重的时期通常出现在病毒感染达到高峰之后，更密切地与感染组织中的细胞浸润以及炎性细胞因子的释放相一致³。另一条证据来自20世纪60年代的甲醛灭活HRSV（FI-RSV）疫苗试验。该疫苗非但未能在婴幼儿中诱导保护作用，反而引发了过度的免疫反应，导致呼吸道疾病加重以及更高的发病率和死亡率。

为了研究人呼吸道合胞病毒（HRSV）感染的发病机制，已开发出多种模型。连续传代细胞系（如 HEp-2 和 A549）已被广泛用于体外研究 HRSV 感染。in vitro。上皮细胞是 HRSV 感染的主要靶细胞⁵，因此大量研究集中于这些细胞类型。然而，in vivo 的....

方案

注意：

HRSV 实验必须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。由于存在生物危害，所有病毒废弃物及接触过病毒的材料均需收集并妥善处理。

使用可能被感染的人类血液时，必须采取特殊预防措施。

在整个实验方案中，必须使用无内毒素的试剂。

1. 人呼吸道合胞病毒 A2 株的培养

1. 在含有10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM培养基中培养HeLa或HEp-2细胞，置于175 cm²培养瓶中² 培养瓶中的细胞直至其汇合度达到约50%。
2. 用室温磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次 (PBS
3. 解冻一管含有HRSV接种病毒储备液的冻存管 37 °C 在水浴中。将病毒原液稀释至感染复数（MOI）为0.1或更低，以防止产生缺陷性干扰颗粒（DIPs）。用4 ml/瓶感染培养基（DMEM + 1% P/S）稀释病毒原液，并加入HeLa或HEp-2细胞中。保持该体积尽可能低，但避免细胞干燥。体积越低，感染率越高。
4. 孵育2-4小时 37 °C，5% CO₂每15分钟轻轻摇动一次锥形瓶，以重新分布培养基。
5. 移除接种物，用 PBS 洗涤一次。
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结果

本文所述的HRSV A2培养与纯化方法可获得每毫升2 × 10⁷至2 × 10⁸个经FITC-50定量的感染性病毒颗粒。显微镜分析结果（计数FITC染色的感染细胞，结果未显示）与FACS定量结果进行了比较（图1）。两种方法所得滴度相似，但FACS方法在不同实验间的标准偏差显著更低，且操作更为简便。

进行PBMC刺激实验时，我们推荐使用刺激物-组分法。该方法将实验条件分为刺激物条件和组分条件（图2）。刺激物条件为标准条件（例如 RPMI和HRSV），组分条件为测试条件（例如 RPMI、MDP和LPS）。每次实验均应包含阴性对照和阳性对照。本实验中，LPS为阳性对照，RPMI为阴性对照。当检测如TNFα和IL-1β等促炎性细胞因子时，LPS通常可用作阳性对照。刺激物-组分法可避免遗漏重要的对照条件。

刺激24小时后，外周血单个核细胞（PBMC）中不同细胞类型的感染率呈现剂量依赖性（

讨论

本研究中，我们证明了用HRSV感染PBMC是一种快速且可靠的模型系统，可用于研究炎症通路。为了刺激PBMC，需要制备并定量HRSV病毒原液。

多种细胞系均易受人呼吸道合胞病毒（HRSV）感染。用于培养HRSV最常用的细胞系包括HEp-2、HeLa 和Vero细胞。然而，我们不推荐使用Vero细胞培养HRSV，因为已有研究表明，在Vero细胞中培养HRSV会导致HRSV的G蛋白发生截短¹⁰。此外，由于存在产生缺陷型干扰颗粒（defective interfering particles, DIPs）的风险，进行病毒培养时应始终使用较低的病毒感染量¹¹。缺陷型干扰颗粒是指缺失部分或全部基因组的病毒颗粒，因此无法独立引发感染，必须依赖完整的感染性病毒才能复制。由于其基因组较小，DIPs的复制效率高于完整病毒，可能导致大量非感染性颗粒的产生。这些DIPs无法通过依赖病毒复制的定量技术检测出来，但在免疫细胞刺激实验中可能被识别。因此，必须尽可能将DIPs的水平控制在最低。Treuhaft 等的研究表明，当使用0.1的感染.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
PBS	Lonza	BE17-516F	不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红的 PBS
HBSS	Invitrogen	14025-100	含钙、镁，不含酚红的 HBSS
DMEM	Invitrogen	31966-047	高糖 DMEM，含 GlutaMAX 和丙酮酸钠
RPMI	Invitrogen	72400054	RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 和 HEPES
低血清培养基（Opti-MEM）	Invitrogen	51985-026	Opti-MEM I 低血清培养基，含 GlutaMAX
FCS	Greiner Bio-one		胎牛血清（FBS）
BSA	Sigma Aldrich	A7030	牛血清白蛋白
P/S	Invitrogen	15140-122	青霉素-链霉素溶液（液体）
胰蛋白酶	Invitrogen	25300-054	0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2
A549 细胞	ATCC	CCL-185
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903	生物级蔗糖（BioXtra），≥99.5%
IgG2 抗小鼠-FITC	BD Pharmingen	555057	小鼠 IgG2b κ FITC 同型对照
抗 RSV-NP-FITC	Abcam	ab25849	抗呼吸道合胞病毒抗体 [671]（FITC 标记）
密度梯度介质（Lymphoprep）	Axis-Shield	1114545
EDTA 抗凝管	BD Biosciences	367525
丙酮	Merck Millipore	1000141000	分析纯丙酮
材料
离心管	Beckman Coulter	326823	薄壁聚丙烯离心管，38.5 ml，25 mm × 89 mm
SureSpin 630 转子（带 36 ml 吊篮）	Sorvall	79368	摆动式钛合金转子
Sorvall WX80 超速离心机	Sorvall	46900
CB 150l CO2 培养箱	Binder