我们描述了一种在小鼠模型中使用MRI进行体内细胞示踪的通用方案，其中细胞经过体外标记。本文包括典型的细胞标记、图像采集、处理与定量分析流程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
体内 19F MRI 可实现无需电离辐射的细胞定量示踪，是一种可应用于人类的非侵入性技术。本文介绍了一种通用的细胞标记、成像及图像处理方案。该技术适用于多种细胞类型和动物模型，但本文以小鼠模型追踪小鼠免疫细胞为例进行说明。文中阐述了细胞标记过程中最关键的问题，因为这些要点适用于所有模型。同样，本文列出了关键的成像参数，尽管具体数值会因 MRI 系统和具体实验设置的不同而有所差异。最后，我们提供了一套用于定量分析的图像处理流程。对于本方案及其他部分的可能变异，将在讨论部分进行评估。根据本文所述的详细步骤，使用者需针对每一种特定的细胞类型、细胞标记物、动物模型和成像系统对方案进行相应调整。请注意，只要符合临床使用限制，该方案也可适用于人类研究。
引言
体内细胞示踪对于细胞治疗药物的优化与监测至关重要1。由于成像技术具有非侵入性，因此为体内细胞监测提供了极佳的机会。磁共振成像（MRI）不依赖电离辐射，能够实现更高的成像分辨率和固有的软组织对比度。基于MRI的细胞示踪已应用于临床，用于追踪黑色素瘤患者中的树突状细胞2。常规临床MRI基于组织中移动水分子内的1H原子核进行。此外，也可对其他具有磁活性的原子核（如13C、19F和23Na）进行MRI成像。然而，只有19F MRI已成功应用于体内细胞示踪，因其在1H之后具有最高的灵敏度。组织中不存在可被MRI检测到的内源性19F，这使得外源性19F对比剂的信号具有高度选择性，并允许直接从图像数据中定量氟浓度。关于19F MRI的详细讨论，参见文献3-5。19F MRI的一个关键问题在于需要开发和优化合适的19F细胞标记物，尽管目前已开发出多种标记物，且呈现向多模态探针发展的趋势6。
本文所述方案基于我们研究团队先前的研究工作7-9，其中包括最早描述基于体内定量19F MRI细胞示踪的文献10,11。使用19F MRI进行细胞示踪的一般流程如图1所示。我们介绍了一种利用自制全氟碳对比剂标记并成像树突状细胞（DCs）的通用方案8。该成像方案可广泛适用于不同类型的细胞、标记物及动物模型。此处所述的细胞类型和动物模型仅作为示例，因此我们不提供细胞分离与标记的详细步骤，而将重点放在成像方案上。针对不同的标记物、细胞类型、动物模型及成像系统，均需进行相应的调整，相关优化方法可在文献中查找或由研究人员自行确定。一些常见的调整方法已在讨论部分中列出。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：所有涉及动物的实验和操作必须遵循相关伦理准则，并符合标准的动物护理和人道要求。
1. 细胞标记（共孵育标准方案）
- 将19F标记物8以4 mg/106个细胞（溶于2 ml培养基中）的浓度加入未成熟DC细胞，轻轻混匀。
- 在使DC细胞成熟并收获之前，将细胞与标记物共同孵育3天。
- 收集DC细胞，用PBS洗涤至少3次以去除过量的标记物，并对细胞进行计数。
- 将细胞重悬于少量PBS中，用于注射或进一步检测。
注意：本方案适用于这些特定的树突状细胞（DCs）和标记物。该实验流程已在另一篇文献中进行了优化8，此处仅包含成像样本制备的步骤，因为本方案的重点在于成像。因此，特定细胞类型的分离、培养和标记方案需查阅相关文献或由研究人员自行优化。文献中已使用的其他19F标记物的汇总见于其他研究6。
2. 使用19F NMR 测定每个细胞的19F含量
- 将已知数量的标记细胞（通常多于 0.5 × 106 个，或足以产生足够信号的数量）放入核磁共振管中。
- 加入 10 μl 的 5% 三氟乙酸（TFA）。如果 TFA 的共振频率因与标记物重叠而不适用，可使用其他可溶性化合物作为替代，优选具有单一19F 共振峰的化合物。
- 将样品放入核磁共振波谱仪中，获取19F 谱图。确保谱宽足以同时覆盖 TFA（参考物）和待测物的信号。
注意：TR 应足够长，以确保参考和样品自旋的充分弛豫（约为 5 倍 T1 最长T的弛豫时间1 管中的组分，通常 TR 为 5–8 秒）。某些波谱仪需要 D2O 作为频率锁定信号。一种标准 19F 谱图已足够。若细胞对标记物的摄取效果较差，则需要进行大量平均化处理或使用更多细胞 或当细胞数量较少时，光谱应位于参考峰和相关标记峰之间；除非已进行校正以补偿部分激发。
- 计算参考物质与样品（或样品主峰）峰下面积的相对值，然后计算样品中每个细胞的平均19F原子数。
注意：整个过程必须重复足够多次并进行充分平均，以达到统计学显著性。也可直接在磁共振成像仪上使用光谱法完成该步骤。但需注意，此方法仅能提供大量细胞的平均19F负载量，无法反映细胞间的差异性。若需检测细胞摄取的均一性，则要求19F标记剂含有荧光组分，以便通过显微镜或流式细胞术分析细胞摄取情况。
3. 实验设计的注意事项 - 细胞注射
由于19F MRI在细胞示踪中的灵敏度相对较低，因此需要使用细胞能够大量聚集的动物模型，才能成功实现体内成像。典型的检测灵敏度范围为每体素每小时扫描时间1,000至100,000个细胞6，细胞内氟原子载量通常在1011至1013个之间。
成像次数和频率必须经过仔细规划，因为这会影响麻醉剂的选择。需要注意的是，异氟烷可能并不适用于 19f MRI 如果 19异氟烷的共振频率与所用标记化合物的频率接近。如果成像时间足够短，不足以引起显著的信号累积，异氟烷仍可适用。文献中已采用多种替代麻醉剂。10,11；成像方案中包含一个示例。不同小鼠品系和疾病模型可能需要优化麻醉方案。
4. 外部19F参考标准的设计
- 使用含有已知量19F信号的外部参照物进行定量12。选择参照物的信号强度应大致与受试样本预期的信号强度相当。
注意：通常情况下，参考化合物与细胞标记物相同最为简便，以便匹配弛豫参数。如果使用波谱序列或无空间定位的序列，则可能需要使用化学位移不同的化合物。
- 根据感兴趣区域（ROI）的需要，调整参考物的位置、大小和形状。注意：通常使用横截面均匀的管材作为参考物最为方便。
5. 成像与小鼠准备
- 将市售的氯胺酮和赛拉嗪按1:10 v/v的比例用生理盐水稀释，制备成浓度为10 mg/ml的氯胺酮和2 mg/ml的赛拉嗪储备液。
- 打开扫描仪的加热系统（通常为热风），以确保在对小鼠成像前扫描孔内已预热。
- 腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪 以启动麻醉。注意：上述剂量已针对 CD1(ICR) 和 NU-Foxn1 进行过测试nu 8周龄雄性小鼠。其他品系可能需要略微不同的剂量，应通过单独的预实验进行优化。此剂量可使小鼠维持麻醉状态约45分钟。注意：若动物对足部夹捏无反应，通常表明麻醉深度已足够。
- 麻醉后，将动物置于动物固定架中并加以固定，以防止磁共振成像过程中动物移动。如有需要，将外部参考物置于动物旁边。参考物和感兴趣区域（预计注射细胞的位置）均应位于线圈中心。动物应连接体温和呼吸监测装置，以便在扫描期间进行生理监测。
- 用无菌材料覆盖小鼠的眼睛 使用眼药膏防止干燥 在长时间成像过程中会减弱。
- 如果成像时间超过40分钟，需在动物苏醒前准备额外的导管用于追加注射氯胺酮/赛拉嗪。将两个独立的皮下导管分别置于 使用含有氯胺酮和赛拉嗪工作溶液的导管。在首次给药后40分钟，每隔20分钟通过该导管向小鼠追加2.5 mg氯胺酮。如有必要，在初始注射后100分钟时，可通过导管追加注射0.5 mg赛拉嗪以进一步延长麻醉时间。在所有情况下，实验时间不应超过3小时，除非在终末麻醉状态下可酌情延长。
- 确保小鼠在第一次注射后立即进行保温，并维持其体温在37 °C。采用本方案， <检测到在吸入空气条件下血氧饱和度为80%。为防止血氧降低引起的副作用，应使用100%氧气（0.3 L/min）。在整个实验过程中以及动物完全恢复之前，均需控制体温和呼吸。需注意，使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉时，小鼠自主呼吸频率较高（200–250次/分钟）。呼吸节律的不规则性，而非呼吸频率本身，可能提示需要增加麻醉剂量以维持适当的麻醉状态。小鼠将在20–30分钟内自行苏醒。 麻醉剂最后一次给药后。
注意：对于细胞追踪，需要对同一只动物进行多次成像。在此情况下，成像时间点的安排应考虑麻醉剂从动物体内清除所需的时间，并遵守所在机构的动物使用指南。
6. 成像
1H 调整与成像
- 使用低分辨率、不同切片方向的解剖扫描（定位像），将动物置于扫描仪内，使目标区域位于等中心位置。
- 对1H采用常规匀场协议，例如对线圈内整个体积进行全局匀场。
- 利用厂商提供的调整扫描，调节参考脉冲增益（RG），即以分贝（dB）为单位测量的1毫秒Hermite 90°射频脉冲的发射功率。
注意：该调整会因射频线圈类型的不同而有所变化，对于19F MRI而言至关重要，因为19F频率上的信号通常过弱，无法进行直接调整。因此，必须通过1H信号的测量来估算RG值。使用表面线圈进行射频发射时，应将1H RG调整至通过感兴趣区域且与线圈平行的平面；而对于具有均匀B1场分布的体线圈，该调整的具体设置则不那么重要。
- 以下方案的 19F 参考脉冲增益调节仅在以下两种情况下有效 1H 和 19F射频发射使用相同的（单调谐或双调谐）射频线圈进行。在此类成像设置中，线圈灵敏度分布（B1 透射场）上 1H 应与……成正比 19固定RG条件下F线圈的轮廓 即 B1,1H=C*B1,19F 比例常数 C。
- 为确认特定设置下的线圈轮廓呈正比关系，需获取一个 1H 和 a 19F 翻转角图（参见后续关于 B 的章节）1 校正）对一支高浓度的试管 19F, 例如 水与三氟乙酸（1:1 体积比）中，采用相同的视野（FOVs），预先图3).
- 使用相同的RG，检查两张图谱是否仅在全局因子C上存在差异，其余部分完全相同。
- 一旦 1记录所确定的 H RG 值。
- 进行常规操作 1H MRI 扫描作为解剖学参考的 19F成像。将系统调节至 19细胞标志物的频率并进行分析 19F MR 扫描。理想情况下 19fMRI扫描将具有相同的视野和切片选择作为 1H MRI，尽管通常分辨率较低。 成像完成后可立即复苏动物，随后可离线进行图像处理。
- 确定 19F RG 通过关系 dB19FdB1H-20*log10(C). 估算 19F因子在独立样本中的频率 体外 实验
注意：体内实验中，由于不同的匀场条件，实际频率可能在不同实验间略有差异。因此，若条件允许，应通过19F磁共振波谱（MRS）在每次实验中确定精确频率，以避免化学位移伪影。对于极低19F信号的典型扫描，可采用全局（脉冲-采集）波谱法（TR = 200 毫秒，NEX = 3,000，TA = 10 分钟，BW = 50 kHz）。当19F信号较强时，NEX及相应的TA可显著减少。19F造影剂的频率通过傅里叶变换和相位校正后的谱图确定。NEX指激发次数，TA为采集时间，BW为带宽。
注：典型的成像参数9 在11.7T/16 cm专用动物成像仪上的：解剖学 1使用TR/有效回波时间（TE）的涡轮自旋回波（TSE）序列进行氢成像扫描效率) = 2,200 毫秒/42.8 毫秒，每次激发采集 8 个回波，NEX = 2，连续采集 10 层，层厚 1 毫米，FOV = 1.92 × 1.92 厘米2，128 × 128 矩阵， 即 150 × 150 × 1,000 μm 的分辨率3，TA = 1 分钟，BW = 50 kHz，采用线性相位编码方案。 19F图像采用相同的序列和匹配的几何参数获取，但平面内分辨率较低且带宽较低（NEX = 256，48 × 48矩阵， 即 400 × 400 × 1,000 μm 的分辨率3，TA = 57 分钟，BW = 10 kHz。
- B1 校正
使用具有非均匀B的射频线圈1 轮廓， 例如 表面线圈可能会妨碍定量分析 19F 数据，因为该信号不仅取决于 19F 浓度以及与线圈的距离。获取一个 B1 地图上的 1H 通道以进行回顾性校正 19F 数据。这要求 1H 和 19F线圈的轮廓完全相同，仅比例因子C不同，且该条件已足够 1H背景信号出现在某些区域 19F. 一种用于校正的示例实验方案 19F自旋回波序列，采用可调谐至双频的单通道发射/接收表面线圈 1H 和 19F 和成比例的 B1 谱型13.- 获取一个 1使用双翻转角法的H翻转角图 14. 采用非常长的TR获取梯度回波扫描>3次 1H T1）并采用略低于90°的估计翻转角。靠近线圈处，以RG=dB采集第二组梯度回波扫描1H-6, 即 第一次扫描翻转角的两倍。
- 计算 1H 翻转角 α 在体素 (x,y,z) 处通过第一次和第二次梯度回波扫描的信号强度（SI）计算：α(x,y,z) = arccos(SI通用电气，1(x,y,z)/2SI通用电气，2(x,y,z)14。该 19F 翻转角相同（仅差一个因子 1/C），因为 B 成正比1 根据法拉第互易原理15，衰减的 19自旋回波序列（激发翻转角 α，重聚翻转角 2α）在信号接收期间的 F 信号强度受到衰减Rx(x,y,z)~α(x,y,z)。由于激发不完全导致的衰减为 attTx(x,y,z)~sin3(α(x,y,z))16总衰减表示为 att = attRx × attTx = α × sin3(α)/90°。注意，当激发/重聚焦翻转角为理想的90°/180°时，该值被归一化为1。B1 校正的 19F图像信号强度SI19F,corr 通过 SI 计算19F,corr(x, y, z) = SI19F(x,y,z)/att(x,y,z)
- 为了比较不同实验的信号强度，需放置一支含有已定义参数的参照管 19视野中的 F 浓度，并对 SI 进行归一化19F,corr 与参考中的平均信号相比。
注意：可使用其他1H B1/翻转角映射方法，不同的19F脉冲序列需要对attTx,19F进行相应调整。任何类型的B1校正方案都会在细胞定量过程中引入额外误差。如果精确的细胞定量是主要前提，可使用具有均匀B1场分布的射频线圈，以规避本步骤的实验流程。
7. 图像处理
- 生成 1H 和 19F 叠加图像
- 从扫描仪导出最终的 1H 和 19F 幅值图像的图像数据。
- 在图像处理程序（如 ImageJ，NIH 免费软件）中打开这些文件。
- 根据需要进行图像调整（裁剪、亮度、对比度），并对所有图像保持相同的调整参数。19F 图像通常需要提高分辨率以匹配相应的 1H 图像。
- 将 19F 图像以伪彩色渲染（在 ImageJ 的 "图像" 菜单下选择不同的查找表），然后叠加到相应的 1H 图像上，以实现信号定位。
- 19F 定量分析
- 选择一张包含目标细胞和参考物质的 19F 图像（幅值图像）。
- 在 ImageJ 等程序中，分别在目标细胞区域、参考物质区域以及样本外部区域（噪声）绘制感兴趣区域（ROI）。
- 使用“分析”菜单中的“测量”命令（或直接按 Ctrl+M），计算这些区域内像素的平均强度及其面积。令 S(细胞) 表示细胞 ROI 内的平均像素强度，将其乘以体积（= 面积 × 层厚）以计算总信号。
- 计算信噪比（SNR），例如使用公式 SNR = 0.65 × S(细胞) / σ，其中 σ 是样本外部无化学位移伪影区域（通常为空气背景）ROI 内像素强度的标准差17。若 SNR 低于 5，可能需要对噪声引起的信号进行校正，具体方法可参考其他文献1110。
- 否则，通过将参考物质在切片中的面积乘以层厚（得到体积），再乘以参考物质中已知且假设均匀分布的 19F 浓度，计算出参考物质 ROI 中产生信号的总 19F 量。
- 将上述数值乘以细胞 ROI 的总信号，再除以参考物质 ROI 的总信号，从而计算出细胞中 19F 的总量。
- 将该数值除以第 2 节中计算得到的每细胞 19F 含量，即可得出细胞数量。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在此，我们展示了涉及转移的实验方案的典型结果 19F标记细胞归巢至引流淋巴结。 图2 显示一个 19F NMR 谱图（10）6 使用TFA参考标记细胞。成像设置按照本方案中所述进行（图3）。对于 体内 成像时，我们使用了一个密封的圆柱体作为参考，该圆柱体与用于细胞的标记物相同，并置于小鼠足部之间。图中显示了一幅具有代表性的处理后图像。 图4. 通过应用第7.2节中所述方案，我们计算得到细胞数量约为1.2 × 106 根据原始数据 19F 幅值图像。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案概述了以下通用操作流程 体内 19f MRI 细胞追踪。尽管已描述了共孵育方法，但仍存在多种不同的细胞标记方案 19F 试剂。然而，共孵育是最常用的方法，且可进一步优化 例如 通过添加转染试剂6具体的细胞标记方案取决于细胞类型。此处仅描述标记过程中的关键步骤。通常，将制备好的标记物加入细胞中，孵育一定时间，时间范围从数小时至数天不等。最后，必须仔细洗涤细胞，以去除未结合的过量标记物，特别是在需要对图像数据进行定量分析时。3。如果 19F试剂包含荧光标记时，可利用显微镜检测细胞外（或未结合于细胞）的标记物存在情况。标记后，需针对未标记细胞评估细胞的活力与功能。例如 通过台盼蓝排斥法检测）。还必须进行细胞特异性功能测试，例如树突状细胞（DCs）激活T细胞的能力。最后，由于某些非-19fMRI 标记对细胞迁移具有影响18此类检测也应被纳入 19F标记，尤其是在高细胞载量的情况下。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向 Nadine Henn 和 Arend Heerschap 表示感谢，感谢他们提供的宝贵帮助。本研究得到了荷兰再生医学研究所（NIRM，FES0908）、欧盟第七框架计划 ENCITE（HEALTH-F5-2008-201842）和 TargetBraIn（HEALTH-F2-2012-279017）、大众基金会资助项目（I/83 443）、荷兰科学研究组织（VENI 700.10.409 和 Vidi 917.76.363）、欧洲研究理事会（高级资助项目 269019）以及奈梅亨拉德堡德大学医学中心（AGIKO-2008-2-4）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | MFCD00131855 | |
| TFA | Sigma-Aldrich | 76-05-1 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 | |
| Ophtosan | Produlab Pharma | 2702 | 眼膏 |
| 材料名称 | |||
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| NMR spectrometer | Bruker Biospec |
参考文献
- Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1080-1093 (2010).
- de Vries, I. J., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23, 1407-1413 (2005).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28, 363-370 (2010).
- Ruiz-Cabello, J., Barnett, B. P., Bottomley, P. A., Bulte, J. W. Fluorine (19F) MRS and MRI in biomedicine. NMR Biomed. 24, 114-129 (2011).
- Stoll, G., Basse-Lusebrink, T., Weise, G., Jakob, P. Visualization of inflammation using 19F-magnetic resonance imaging and perfluorocarbons. Wires Nanomed. Nanobiol. 4, 438-447 (2012).
- Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Figdor, C. G., de Vries, I. J., Hoehn, M. Labeling cells for in vivo tracking using (19)F. MRI. Biomaterials. 33, 8830-8840 (2012).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23, 983-987 (2005).
- Srinivas, M., et al. Customizable, multi-functional fluorocarbon nanoparticles for quantitative in vivo imaging using 19F MRI and optical imaging. Biomaterials. 31, 7070-7077 (2010).
- Boehm-Sturm, P., Mengler, L., Wecker, S., Hoehn, M., Kallur, T. In vivo tracking of human neural stem cells with 19F magnetic resonance imaging. PLoS One. 6, e29040(2011).
- Srinivas, M., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using (19)F. MRI. Magn. Reson. Med. , (2009).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58, 725-734 (2007).
- Mangala Srinivas, E. T. A. Cellular labeling and quantification for nuclear magnetic resonance techniques. US patent. , 11787521 (2007).
- Boehm-Sturm, P., Pracht, E. D., Aswendt, M., Henn, N., Hoehn, M. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine. , Melbourne, Australia. (2012).
- Insko, E. K., Bolinger, L. Mapping of the Radiofrequency Field. J. Magn. Res. A. 103, 82-85 (1993).
- Haacke, E. M., Brown, R. W., Thompson, M. R. Magnetic resonance imaging: physical principles and sequence design. , Wiley. (1999).
- Scheffler, K. A pictorial description of steady-states in rapid magnetic resonance imaging. Concepts Magn. Res. 11, 291-304 (1999).
- Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images. Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).
- de Chickera, S. N., et al. Labelling dendritic cells with SPIO has implications for their subsequent in vivo migration as assessed with cellular MRI. Contrast Media Mol. Imaging. 6, 314-327 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
