我们开发了一种 体外 用于研究免疫调节通路在HIV特异性CD4 T细胞细胞因子分泌调控中作用的检测方法。
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方法文章
体外检测免疫调节通路对HIV特异性CD4 T细胞效应功能影响的实验方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
T细胞耗竭是慢性病毒感染期间病原体清除失败的主要因素。在持续抗原暴露下，免疫调节通路（如PD-1和IL-10）表达上调，导致CD4和CD8 T细胞增殖能力下降、细胞毒性功能减弱以及细胞因子产生受损。在LCMV感染的小鼠模型中，给予针对这两个通路的阻断抗体可增强T细胞应答。然而，目前尚无用于评估此类阻断对人源样本细胞因子分泌影响的in vitro检测方法。我们的实验方案和研究方法能够准确、高效地定量检测来自HIV感染者HIV特异性CD4 T细胞的细胞因子产生功能的恢复情况。
此处，我们展示一种 体外 能够检测 HIV 特异性 CD4 T 细胞的细胞因子分泌及其对其他细胞亚群影响的实验设计。从全血中耗竭 CD8 T 细胞后，通过 Ficoll 分离法获取剩余的外周血单个核细胞（PBMC）。将去除了 CD8 的 PBMC 与抗 PD-L1 和/或抗 IL-10Rα 阻断抗体共同孵育，随后用 HIV-1 Gag 肽库进行刺激，细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育248小时后，收集上清液，利用微球阵列法进行细胞因子分析，同时收集细胞沉淀，用于后续通过流式细胞术进行表型分析或通过qRT-PCR进行转录水平分析。为进一步深入分析，可通过选择性去除PBMC中的特定亚群或利用流式细胞术分选获得不同细胞群体，再在相同检测中进行评估。这些方法可高度敏感且特异地检测抗原特异性辅助性T细胞对细胞因子产生的调控作用，并可用于分析不同免疫细胞群体之间的功能相互作用。
引言
在持续性病毒感染过程中，病毒特异性T细胞会经历一种称为T细胞耗竭的过程，从而获得功能缺陷。早期在小鼠慢性病毒感染LCMV模型中的in vivo研究表明，耗竭的病毒特异性T细胞对病毒感染细胞的细胞毒功能降低，丧失增殖能力，并且产生IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的能力下降1,2。在慢性感染期间，PD-1和IL-10等复杂的免疫调节通路被上调，导致T细胞功能障碍（综述见3,4）。在LCMV小鼠模型中，in vivo给予针对这些抑制性通路的阻断抗体可恢复耗竭病毒特异性T细胞的功能，并增强病毒清除能力，表明T细胞耗竭是一种部分可逆的现象（综述见5）。
LCMV模型的研究结果迅速被推广应用于人类慢性病毒感染，如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）5在慢性 HIV-1 感染中，感染个体的 PD-1 和 IL-10 通路表达上调，且与疾病进展参数相关，与病毒载量呈正相关，与 CD4 计数呈负相关6-8PD-1 或 IL-10 通路的抗体阻断 体外 恢复了HIV特异性CD4和CD8 T细胞的增殖能力，表明与LCMV小鼠模型类似，人类T细胞耗竭是一种部分可逆的现象。然而，由于人类样本实验的敏感性以及检测方法灵敏度的局限性 体外 检测方法，但迄今为止，针对这些干预措施所实现的功能恢复谱型的系统性研究却明显缺失。增殖检测是目前唯一可靠的 体外 在大多数研究中都检测了该检测方法，然而关于这些干预措施对以下方面的影响，证据仍明显不足：1）细胞毒性T细胞的杀伤能力，2）T细胞对病毒复制的抗病毒效应，3）细胞因子分泌谱，以及4）CD4+ T细胞对其他细胞亚群的辅助作用。
细胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining, ICS）是一种非常有用且广泛应用的基于流式细胞术的检测方法，用于检测小鼠和人类多种细胞类型中细胞因子的产生。该方法还被用于研究抗体阻断抑制性通路的作用效果。在ICS检测中，通过添加布雷菲德菌素（Brefeldin）和/或莫能菌素（Monensin）来抑制细胞因子的分泌，使细胞因子滞留在细胞内，随后利用荧光标记的抗体结合多色流式细胞术对其进行检测。由于通常在抗原刺激后2小时内即加入Brefeldin和Monensin，且这两种试剂的作用时间有限，因此该检测的孵育时长一般限制在抗原刺激后的6小时或12小时之内。 抗原添加后，对细胞具有毒性。胞内细胞因子染色（ICS） assay 是一种强大的技术，已广泛应用于研究其对细胞效应的影响 体内 在小鼠中给予阻断性抗体干预，并在抗体暴露一段时间后提取细胞9然而，将这种实验方法应用于评估阻断人源样本中抑制性受体的影响时存在若干局限性。在进行抑制性通路的抗体干预时，若刺激时间为6或12小时 体外 （通常在人类样本中如此），通过标准的胞内细胞因子染色（ICS）检测所测量的抗原特异性T细胞应答频率，在大多数情况下不会因抑制性受体的阻断而发生改变6, 7 通过平均或中位荧光强度测定的单细胞细胞因子产量结果不一致6, 7, 10另一方面，当在刺激后的较晚时间点进行ICS时（即 六天后，可观察到分泌细胞因子的细胞数量的变化。这些差异是增殖、存活能力以及效应功能改变共同作用的结果，这些变化在指定时间段内逐渐累积。6一种部分克服这些局限性的方法是延长孵育时间（例如 36 小时，60 小时， 等等在添加细胞因子分泌阻断剂之前，先用抗原刺激细胞，无需等待细胞增殖发生。我们已成功应用此方法测定HIV特异性CD4和CD8 T细胞分泌细胞因子的动力学过程。11,12然而，该方法无法检测微弱的应答信号，也不能反映自刺激以来细胞因子总分泌量的累积结果。因此，与同时检测细胞因子mRNA定量或上清液中细胞因子分泌量的方法相比，胞内细胞因子染色（ICS）在检测抑制性通路阻断对活化T细胞产生细胞因子数量的影响时，敏感性不足。此外，活化T细胞产生的大多数细胞因子通过与抗原呈递细胞相互作用，以自分泌方式发挥作用，参与正向或负向反馈调节。因此，在ICS实验中加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）或莫能菌素（Monensin）会阻断细胞因子的分泌，从而导致T细胞的刺激状态无法达到最佳。最后，ICS在同时检测多种细胞因子时，受限于可用于流式细胞术检测细胞因子的抗体的可获得性和灵敏度，同时也受到特定检测面板中可同时使用的荧光染料数量的限制。
我们开发了一种高灵敏度的 体外 评估免疫调节通路在调控HIV特异性CD4 T细胞分泌细胞因子及其对抗原呈递细胞（APCs）和自然杀伤细胞（NK细胞）辅助功能中的作用的实验方法。该方法也可通过从外周血单个核细胞（PBMCs）中耗竭CD4 T细胞，或使用仅被CD8 T细胞识别的最优肽段进行刺激，来评估阻断抑制性分子对CD8 T细胞功能的影响。与细胞内细胞因子染色法不同，我们选择不干扰HIV特异性CD4 T细胞的细胞因子分泌，以便能够：1）更准确地定量所产生细胞因子的水平；2）检测更广泛的细胞因子或效应分子谱；3）评估HIV特异性CD4 T细胞所分泌细胞因子对其他细胞亚群的影响。我们在存在针对目标免疫调节通路的阻断抗体条件下，用HIV-1 Gag肽库刺激去除CD8 T细胞的PBMCs。在设定的孵育时间（通常为48小时）后，收集上清液，利用微球阵列法检测细胞因子分泌水平，同时收集细胞沉淀，用于不同细胞亚群的表型分析或转录水平分析。值得注意的是，在48小时时间点，我们未检测到显著增殖的T细胞群体。12这是一种灵活的方法，该设计的多种变体可应用于验证不同的假设。例如，不同的细胞亚群（如HIV特异性的CD4 T细胞或PD-1高表达的CD4 T细胞）， 等等孵育12小时后可对细胞进行分选，随后继续孵育36小时，之后收集上清液和细胞沉淀，以更具体地研究阻断干预对PBMC特定亚群细胞因子分泌的影响。
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方案
1. 通过Ficoll分离法耗竭和分离PBMCs
- 通过在每毫升全血中加入50 μl的人CD8+耗竭混合液，耗竭CD8+ T细胞。
- 充分混匀，并在室温（18–25 °C）下孵育20分钟。
- 孵育后，将全血与不含Ca2+或Mg2+的HBSS（Hank's平衡盐溶液）混合，然后铺在Histopaque上。以340 rcf离心30分钟（无刹车，缓慢加速）。
- 收集PBMCs并转移至新的50 ml锥形管中。用45 ml RPMI 1640洗涤两次，每次洗涤时加入50 IU青霉素、50 μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1% HEPES，于340 rcf离心10分钟。
2. 细胞的抗体阻断与抗原特异性刺激
- 将细胞重悬于 RPMI 1640 培养基中，每种条件细胞密度为 2×106，培养基中含 10% 人血清，并添加 50 IU 青霉素、50 μg/ml 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 1% HEPES，每种条件体积计为 500 μl。
- 每管流式管中加入 500 μl 细胞悬液。
- 根据所研究的通路，加入 PD-L1、IL-10Rα 阻断抗体和/或同型对照抗体，终浓度为 10 μg/ml，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 15 分钟。
- 用 HIV-1 Gag 肽库刺激细胞，每种肽的终浓度为 1 μg/ml。每种阻断条件下还需设置一个"无刺激"对照。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。
3. 上清液的收集与分析
- 48 小时后，将 FACS 管在 340 rcf 条件下离心 7 分钟。
- 小心吸取 2 × 225 μl 上清液至 Eppendorf 管中，用于 Luminex 微球阵列检测，注意勿扰动沉淀。
- 在收集的上清液中加入 25 μl 0.5% PBS-Tween 以灭活病毒，终浓度为 0.05% PBS-Tween。
- 未立即使用的收集上清液应储存于 -80 °C 冰箱中。
- 根据生产商说明书，使用 Millipore Luminex 试剂盒测定目标细胞因子浓度。
4. 通过流式细胞术收集细胞并进行表型分析
- 收集上清液后，用 3 ml PBS 洗涤细胞，在 340 rcf 条件下离心 7 分钟，弃去多余的洗涤液。
- 根据制造商说明书，使用 LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒对细胞活力进行染色。
- 在 4 °C 条件下，以 340 rcf 离心 7 分钟，用 PBS 洗涤细胞，弃去上清，重悬于 100 μl 含 1% FBS 的 PBS 中。
- 若对单核细胞或其他抗原呈递细胞进行染色，可通过加入 1.4 μl FcR 封闭试剂并涡旋混匀，以阻断 Fc 受体。
- 在 4 °C 下孵育 10 分钟。
- 加入表面抗体，涡旋混匀后，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
- 用含 1% FBS 的 PBS 洗涤细胞，弃去上清，加入 200 μl 4% 多聚甲醛，在室温避光孵育 20 分钟 。
- 用含 1% FBS 的 PBS 洗涤细胞，重悬于 250 μl 含 1% FBS 的 PBS 中，随后在多激光流式细胞仪（e.g. BD LSRII 或 Fortessa）上检测。
5. 通过qRT-PCR分析细胞
- 对于未通过流式细胞术分析的细胞：在收集上清液后，使用含有1% β-巯基乙醇的300 μl Qiagen Buffer RLT裂解细胞。若不立即继续后续操作，细胞可在-80 °C冷冻保存。
- 按照试剂盒制造商的说明书，使用RNA提取试剂盒进行RNA分离。
- 按照cDNA合成试剂盒的说明书，以RNA为模板合成cDNA。
- 使用SYBR Green技术进行定量PCR。
- 为每个引物（包括内参基因，e.g. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH）配制引物混合液，将引物加入无核酸酶的水中，使终浓度为10 μM。置于冰上保存。
- 为每个引物配制预混液：每孔加入10.5 μl无核酸酶水、12.5 μl SYBR Green和1 μl引物混合液。置于冰上保存。
- 将24 μl预混液移入即将使用的PCR板的每个孔中。
- 根据模板，向每个孔中加入1 μl cDNA。
- 密封各孔，并在800 rcf下离心3 min 。
- 将PCR板放入qRT-PCR仪中运行，e.g. 使用Stratagene MX3005P仪器。
6. 48小时细胞内细胞因子染色的适应性处理
在进行细胞内细胞因子染色前6小时加入布雷菲德菌素和莫能菌素。布雷菲德菌素的添加浓度为10 μg/ml，莫能菌素则根据生产商说明书添加。为方便起见，可在染色前12小时以5 μg/ml的浓度加入布雷菲德菌素。
- 表面染色后，用含1% FBS的PBS洗涤细胞，并使用固定/通透溶液试剂盒及相应方案对细胞内细胞因子（如IL-12、IFN-γ和TNF-α）进行染色。
- 洗涤细胞，重悬于250 μl含1% FBS的PBS中，然后在多激光流式细胞仪（e.g. BD LSR II或Fortessa）上检测。
7. 细胞分选的适应性调整
- 刺激后16小时，根据制造商说明书使用LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒对细胞活力进行染色。整个操作过程中将细胞置于冰上。
- 用PBS在340 rcf、4 °C条件下离心洗涤细胞7分钟，然后重悬于100 μl含1% FBS的PBS中。
- 加入表面抗体，涡旋混匀，冰上避光孵育20分钟。
- 用含1% FBS的PBS在340 rcf、4 °C条件下洗涤细胞，然后重悬于500 μl预冷的RPMI 1640培养基中，该培养基含有10%胎牛血清，并补充50 IU青霉素、50 μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1% HEPES。
- 使用带细胞滤网帽的5 ml聚苯乙烯圆底管过滤细胞。
- 在每个收集管中加入200 μl RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清，并补充50 IU青霉素、50 μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1% HEPES），用于准备分选所需的收集管。分选过程中所有管子均需保持在冰上。
- 在可处理生物危害性材料的设施内，使用仪器（e.g. BD FACS Aria II）对目标细胞亚群进行活细胞分选。
- 细胞分选完成后，将细胞放回培养箱中孵育所需时间，随后进行上清液收集/Luminex分析以及细胞沉淀收集/PCR分析。
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结果
进行细胞因子检测时，使用本方法 体外 系统中，必须能够区分抗原特异性反应与无刺激对照组的反应。通常，我们将抗原刺激后的细胞因子水平较无刺激对照组至少升高三倍、且处于检测方法线性范围内的结果视为阳性反应。我们采用高灵敏度微球阵列检测法，可检测低至0.16 pg/ml的细胞因子浓度，从而能够观察到较弱的抗原特异性CD4 T细胞反应。所有样本均设置复孔，以确保获得准确的检测值。 图2A 显示在IFN-γ产生方面，该检测方法相较于无刺激条件可检测到中位数达800倍的增加。这些数值取决于所检测的细胞因子，因为对于某些细胞因子（如IL-13和IL-2），相较于无刺激条件会观察到较低的数值。类似的方法也适用于对多种细胞因子mRNA的转录谱分析。 图2B 显示刺激后IFN-γ mRNA水平显著升高（超过三倍）。该检测方法中，IFN-γ蛋白分泌与IFN-γ mRNA水平之间存在强相关性（图2C）。尽管我们开发了这一方法 体外 我们还成功应用该方法评估了PD-L1和/或IL-10Rα阻断对CD4 T细胞在SEB、抗CD3...
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讨论
上清液的收集是本实验设计中的关键步骤。在收获用于Luminex检测的上清液时，应将其分装后保存于-80 °C，以避免因反复冻融导致蛋白质降解。冻融过程可能对蛋白质造成较大损伤，通过尽量减少冻融次数，可在检测中获得更强的信号。因此，在进行实验时，使用经历相同次数冻融的分装样品，更易于获得可重复且更准确的数据。
我们此前已对 HIV-Gag 多肽混合物刺激后细胞因子分泌及 mRNA 水平的动力学进行了分析12。根据这些动力学数据，我们选择在刺激后 48 小时进行细胞因子分泌的检测。鉴于 mRNA 与蛋白分泌之间以及不同刺激物之间存在差异，研究人员必须根据所使用的刺激物以及检测目标（mRNA 表达或蛋白细胞因子分泌）开展自身的动力学分析。
当分选细胞亚群（使用图3所示方法）时，需根据分选出的细胞数量调整培养体系的体积。在标准实验中，我们通常将100万个CD8耗竭的外周血单个核细胞（PBMCs）在500 μl培养基中孵育。然而，当我们分选特定细胞亚群（如CD4 T细胞）时，通常分...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Gordon Freeman提供了抗PD-L1阻断抗体。我们感谢马萨诸塞州总医院的临床和实验室工作人员以及所有研究参与者在本项目中所发挥的宝贵作用。
本研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所（PO1 AI-080192；D.E.K）和国家心肺血液研究所（RO1 HL-092565；D.E.K）资助。D.E.K 获魁北克健康研究基金（FRQS）研究学者职业奖支持。FP 获麻省总医院研究执行委员会和哈佛全球健康研究所（HGHI）博士后资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hanks 平衡盐溶液 | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| 人 AB 型血清 | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| 青霉素/链霉素 | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-谷氨酰胺 | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES 缓冲液 | Mediatech | 25060CI | |
| 人 FcR 封闭试剂 | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep 人 CD8+ 细胞去除试剂盒 | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒（适用于紫外激发） | Invitrogen | L23105 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II 逆转录系统 | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒 | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ 引物 | Invitrogen | 正向引物：CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA 反向引物：TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH 引物 | Invitrogen | 正向引物：TCATCATCTCTGCCCCCTCT 反向引物：AGTGATGGCATGGACTGTGG |
参考文献
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