方法文章

BMP-2的共价结合利用表面上的自组装单层膜法

DOI：

10.3791/50842

⸱

2013年8月26日

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

本文内容

摘要

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我们描述了用于实现BMP-2的有效固定化在表面上的方法。我们的方法是基于一个自组装单层实现共价通过其游离胺残基的BMP-2的结合的形成。这个方法是研究信令在细胞膜的有用工具。

摘要

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骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是嵌入在骨组织中的细胞外基质的生长因子。 BMP-2作为间充质细胞分化为成骨细胞的触发器，从而刺激愈合和新生骨形成。与支架结合临床使用的重组人BMP-2（的rhBMP-2）提出了一些争议，根据演示文稿的方式和交付量。这里介绍的协议提供了一种简单而有效的方式提供的BMP-2的体外研究细胞。我们描述了如何形成自组装单分子层组成的异双功能连接物，并显示在下面的结合步骤中获得的rhBMP-2的共价固定。用这种方法，可以实现BMP-2的持续文稿，同时保持了蛋白质的生物活性。事实上，BMP-2的表面固定允许有针对性的调查，防止非特异性的广告orption，同时减少的生长因子的量和，最值得注意的是，阻碍了从表面不受控制的释放。由BMP-2引起的短期和长期的信号传导事件正在发生时，细胞暴露于表面呈共价固定的rhBMP-2，使得该方法适于在体外研究细胞对BMP-2刺激。

引言

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骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是转化生长因子（TGF-β）家族，并作为新生骨形成的诱导剂，以及几种组织的胚胎发育和成年人中调节动态平衡1-3的成员。 具有生物活性的同型二聚体的BMP-2蛋白的每个单体包含一个"半胱氨酸结"的主题，它是高度保守的所有骨形成蛋白4。六七个半胱氨酸残基形成稳定的每个单体分子内二硫键，而第七个半胱氨酸参与二聚化，形成了两种单体5,6之间的分子键。这个高度保守的半胱氨酸结定义了BMP-2蛋白的三维结构，并确定其独特的性能，如对热，变性剂和酸性pH 7-9的阻力。 BMP-2的结合的丝氨酸/苏氨酸激酶的跨膜受体，从而诱导信号转导 10-12。取决于受体寡聚化的模式下，不同的信号通路被激活:一个Smad蛋白非依赖性信号传导级联通过p38信号导致的碱性磷酸酶诱导，而Smad蛋白依赖性途径通过受体磷酸化的结果中的Smad复合物的核转位和活化的转录活化具体靶基因，例如分化的抑制剂（ID）12-14。

在骨，BMP-2诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，从而刺激愈合和从头形成骨。目前，重组表达的BMP-2是临床应用，以提高骨折部位的愈合。在骨组织工程常见的策略是利用注射生长因子，相比本地投递系统，是创伤小。然而， 在体内研究和临床应用表明，短的生物半衰期，非特异性禄alization和BMP-2的快速局部间隙可能导致一些地方，异位和系统性问题15。因此，为了获得有效的演示，BMP-2的范围内或之上的材料的包封或固定是必要的，它的本地和持续递送于靶位点。持续释放可以通过非共价的保留的方法，如物理截留，吸附或离子络合16来实现。然而，它是已知的蛋白质的非特异性吸附到表面可导致分子17的变性。为共价的生长因子结合，已经开发了不同类型的支撑件，在过去十年。使用双官能连接基的分子靶向的蛋白质的氨基或羧基基团例如，是一种类型的，这并不一定需要的蛋白质修饰，以实现其固定的方法。事实上，当蛋白质修饰提供调控蛋白定向的优势，引入人工结构域，肽标记和特定于站点的链可改变生长的生物活性因子17。因此，为了规避变性由于与支撑材料的相互作用，表面可以事先官能化，例如，有自组装单分子层的连接分子（SAM），接着是所需的因子18的耦合。我们已经使用了基于SAM的方法，共价固定化的BMP-2在表面上通过靶向其游离胺残基且已经表明，固定化的蛋白保留其短期和长期的生物活性19。这个协议提供了一种简单而有效的方式提供的BMP-2的细胞的体外研究在其上发生在细胞膜和调节负责信令成骨细胞内信号传导的机制。

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方案

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1。 11-Mercaptoundecanoyl-N-琥珀酰亚胺酯（MU-NHS）的合成

  1. 逐滴加入500毫克N-羟基琥珀酰亚胺的溶液和30mg 4 - （二甲氨基）吡啶在10ml丙酮（PA）的1克11-巯基十一酸的40ml二氯甲烷（PA）在室温（RT）。
  2. 将反应冷却至0℃，并逐滴加入1.1克N，N' -二环己基碳在10毫升二氯甲烷中（氮气氛下）。保持在低温下进行1小时反应，然后在室温搅拌过夜。
  3. 过滤出沉淀，干燥，减压。通过快速色谱纯化，用石油苯和乙酸乙酯（PA）以1:1的比率提纯产物。

2。齐金层的制备

  1. 干净的玻璃盖玻片精确湿巾含有乙酸乙酯（PA）和甲醇（PA）1:1混合物的溶液超声仪处理他们5分钟。 RINSË基板用甲醇和在氮气流中干枯脱落。
  2. 将干净的基板中的溅射涂覆装置。疏散室。通过溅射60秒从铬靶中取出最上面的氧化铬层。将样品在金属梁和涂层它们与10纳米的铬层，接着用40nm金层覆盖的下面。

3。 BMP-2的表面固定

  1. 溶解的MU-NHS在N，N-dimethlyformamide酰胺（DMF），以约1mM的终浓度和孵育金衬底中的MU-NHS的溶液在室温氮气气氛下4小时。
  2. 在DMF中的声处理的表面，持续2分钟，冲洗，用DMF和MeOH，并在氮气流干燥关闭。
  3. 制备的rhBMP-2的储备溶液在无菌4mM的盐酸与100微克/毫升（店铺等份在-80℃下）的浓度。对于工作稀释液（3.5微克/毫升），稀原液在PBS /氯化钠（PBS含有1M NaCl的）和一个djust至pH 8.5在使用前立即。
  4. 孵育功能化MU-NHS在4℃的的rhBMP-2工作液过夜表面。除去培养上清。在PBS / NaCl中2分钟声处理的表面和洗3次，用无菌PBS / NaCl洗涤。

4。表面表征

  1. 以阻止抗体的非特异性吸附，孵育用5％BSA的表面（重量/体积）中1小时，在室温下，接着温育用抗BMP-2抗体（1:100，以1％（w / v的PBS溶液）BSA / PBS溶液）处理1小时，在室温。用PBS超声，持续30秒洗两次面。
  2. 孵育底物与HRP偶联的二抗（1:1,000以1％（重量/体积）BSA / PBS溶液）30分钟，在RT，然后用PBS洗两次。
  3. 使用Ampliflu红测定法测量的HRP酶的活性在570nm处用酶标仪。

5。生物活性分析

  1. 种子1×10 5个鼠C2C12每孔在6孔PL成肌细胞阿泰在生长培养基中，由含有丙酮酸补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素和37℃/ 5％CO 2孵育在他们24小时的高葡萄糖DMEM中。
  2. 饥饿的细胞在无血清的DMEM培养前3-5小时至播种到装饰有固定的BMP-2的表面上。
  3. 对于短期的信号感应的调查，以200μl的新鲜的无血清DMEM替换培养基，然后将固定化的BMP-2的表面上的细胞。表面应该用细尖镊子处理，以避免刮伤。
  4. 轻轻地取出面和吸出培养基用移液管，用PBS洗细胞两次。进到细胞反应的分析。
  5. 对于长期的生物活性，板单元的分析到六天表面并对其进行培养，在37℃/ 5％CO 2在低血清条件下（2％FBS）中。

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结果

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在我们的设置中，黄金被选为赋形剂，因为它提供了一种生物，但非特异性化学可调系统。另外，自组装单分子膜的应用嗣继承很多益处:通过自组装膜对金属和形式的单层缺陷少其"头部基团"自发地吸附，而其末端官能基团可以被进一步修饰。因此，他们提供一个平台，在受控而高度适应性的方式20定制界面的属性。

对于BMP-2对金涂覆的表面上的固定化，我们使用了两个步骤的方法:1）结合的MU-NHS接头的金层，然后2）连接体与该蛋白反应（参见图1）。证明的rhBMP-2的结合，我们使用的酶免疫测定法。在该试验中，表面呈现固定的rhBMP-2孵育用BMP-2特异性抗体和缀合辣根过氧化物酶的二次抗体。后者的结合可以是determined使用Ampliflu红色溶液。在过氧化氢存在下，HRP催化无色Ampliflu红（10 - 乙酰基-3,7 - dihydroxyphenoxazine）转化成荧光化合物试卤灵。我们检测到表面固定的rhBMP-2（IBMP-2）之前，接近贴壁细胞从上面的功能化表面后。请注意的rhBMP检测与Ampliflu红测定，样本...

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讨论

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在这个协议中，我们描述了功能化与生物活性的rhBMP-2表面的准备。该方法包括两个步骤:在金表面的双官能连接体的自组装单层（SAM）的1）初步形成，2）共价的rhBMP-2蛋白的固定化。在以前的工作中，我们验证了双官能连接子和生长因子的有效结合，并表明表面固定化的rhBMP-2保持其生物活性19。在固定化的形式呈现的生长因子的生物活性也已显示在其他研究中，表明该蛋白的释放以及随后的内化是不是为细胞刺激24,25必不可少的。实际上，生长因子的共价固定可在靶细胞的持续刺激，同时保持，因为不同类型的受体的增强的占用率的有效剂量在细胞膜22,23,26-28。

对于表面呈现固定的rhBMP-2，护理的准备，应采取在处理整个过程的表面和编制的rhBMP-2的解决方案。玻璃盖玻片应清洁，干燥，缺陷或杂质的迹象应该是可见的。划伤表面用镊子和移液管，应该避免。对于使用的rhBMP-2的表面官能化步骤中，有必要在准备使用无载体的重组蛋白， 即不加入牛血清白蛋白，以避免表面上的载流子的不期望的固定化。该的rhBMP-2...

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

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我们感谢教授太平绅士斯帕茨（生物物理化学系，海德堡大学以及新材料和生物系统学系，马克斯普朗克研究所的智能系统，斯图加特）对他的鼎力支持。从马克斯 - 普朗克协会与德意志研究联合会（DFG SFB/TR79到EAC-A）的财政支持也大大承认。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N-羟基琥珀酰亚胺Sigma-Aldrich130672 
4-（二甲氨基）吡啶Sigma-Aldrich522805 
丙酮AppliChemA2282 
11-巯基十一酸Sigma-Aldrich674427 
二氯甲烷默克106050 
N，N'-二环己基碳二亚胺Sigma-AldrichD80002 
石油苯默克公司 
玻璃盖玻片Carl RothM 875 
乙酸乙酯AppliChemA3550 
甲醇Carl Roth4627 
N，N-二甲基甲酰胺Carl RothT921 
rhBMP-2R&D Systems355-BM无载体蛋白;以 大肠杆菌
>PBSPAAH15-002 
氯化钠Carl RothHN00.2 
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）道康宁 
Sylgard 184 有机硅弹性体套件Dow Corning 
抗 rhBMP-2SigmaB9553 
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta Cruzsc-2005二抗
Ampliflu Red 检测Sigma90101 
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） （1x），液体Gibco41966高葡萄糖
胎牛血清 （FBS）SigmaF7524过滤，经细胞培养检测
Pen/StrepGibco15140 
胰蛋白酶 0.05% （1x） 含 EDTA 4NaGibco25300 
甘氨酸 （0.1 M）Riedel-de Haë编号33226 
IGEPAL CA-630 （1%）SigmaI8896裂解缓冲液（ALP 测定）19
氯化镁 （MgCl2）（1 mM）Carl RothHNO3.2 
氯化锌 （ZnCl2） （1 mM）Carl Roth3533.1 
对硝基苯磷酸酯 （pNPP）SigmaS0942磷酸酶底物
抗肌蛋白重链 （MHC）发育研究 爱荷华大学杂交瘤库MF20单克隆抗体
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgGInvitrogenA11001 
DAPISigmaD9542 
设备
Ultrsonic 浴缸 （Sonorex Super RK 102H），频率 35 kHzBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 溅射镀膜系统BAL-TEC AG镀膜条件
Cr：120 mA，1.3 x 10-2 mbar，30 秒
Au：60 mA，5.0 x 10-2 mbar，45 秒
Tecan Infinite M200 读板Tecan 
表达无菌器

参考文献

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BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

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