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方法文章

采用自组装单分子层方法将BMP-2共价结合至表面

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DOI：

10.3791/50842

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2013年8月26日

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

本文内容

摘要

我们描述了一种在表面高效固定BMP-2的方法。该方法基于自组装单分子层的形成，通过BMP-2的游离胺基实现其共价结合。此方法是研究细胞膜信号传导的有用工具。

摘要

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是一种嵌入骨组织细胞外基质中的生长因子。BMP-2可触发间充质细胞向成骨细胞分化，从而促进骨组织修复与愈合 从头合成 骨形成。近年来，重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）与支架材料联合应用于临床时引发了争议，主要涉及其呈递方式和递送剂量。本文所述方案提供了一种简单高效递送BMP-2的方法 体外 关于细胞的研究。我们描述了如何形成由异双功能连接分子组成的自组装单分子层，并展示了随后的结合步骤以实现rhBMP-2的共价固定。通过该方法，可在维持蛋白生物学活性的同时实现BMP-2的持续呈递。事实上，BMP-2的表面固定化可通过防止非特异性吸附而实现靶向研究，同时减少生长因子的用量，尤其重要的是可抑制其从表面的不受控释放。当细胞接触呈递共价固定化rhBMP-2的表面时，可触发BMP-2介导的短期和长期信号事件，表明该方法适用于 体外 细胞对BMP-2刺激反应的研究。

引言

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是转化生长因子β（TGF-β）家族的一员，具有诱导作用 从头合成 骨形成以及在胚胎发育和成体稳态过程中多种组织的调控者1-3. 生物活性同源二聚体BMP-2蛋白的每个单体均包含一个 "半胱氨酸结" 在所有骨形态发生蛋白（BMPs）中高度保守的基序4七个半胱氨酸残基中有六个形成分子内二硫键，从而稳定每个单体结构，而第七个半胱氨酸参与二聚化，介导两个单体之间的分子间二硫键形成。5,6这种高度保守的半胱氨酸结构决定了BMP-2蛋白的三维结构，并赋予其独特的性质，例如对热、变性剂和酸性pH的抗性。7-9BMP-2 与丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜受体结合，从而诱导信号转导10-12根据受体寡聚化方式的不同，会激活不同的信号通路：一种非Smad依赖性信号级联通过p38信号通路诱导碱性磷酸酶的表达；而另一种由受体磷酸化激活的Smad依赖性通路则导致Smad复合物向细胞核转位，进而激活特定靶基因（如分化抑制因子（Id））的转录12-14.

在骨组织中，BMP-2 可诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，从而促进骨愈合与修复 从头合成 骨的形成。目前，临床上应用重组表达的BMP-2以促进骨折部位的愈合。在骨组织工程中，一种常见策略是使用可注射的生长因子，相较于局部递送系统，该方法侵入性更小。然而 体内 研究表明，BMP-2 的短生物半衰期、非特异性定位以及快速的局部清除可能导致多种局部、异位及全身性问题15因此，为了实现有效的递送，必须将BMP-2包埋或固定于材料内部或表面，以实现其在靶向部位的局部持续释放。通过非共价保留方法（如物理包埋、吸附或离子络合）可实现持续释放。16然而，已知蛋白质非特异性吸附到表面可能导致分子变性17. 近十年来，为实现生长因子的共价结合，已开发出多种类型的载体。其中一种方法是使用双功能连接分子，靶向蛋白质的氨基或羧基，从而无需对蛋白质进行修饰即可实现其固定化。事实上，尽管蛋白质修饰具有可控制蛋白质取向的优势，但引入人工结构域、肽标签和位点特异性链可能会改变生长因子的生物活性17因此，为了规避因与支撑材料相互作用而导致的变性，可预先对表面进行功能化处理，例如，先修饰一层连接分子的自组装单分子层（SAM），再偶联目标因子18我们采用基于SAM的方法，通过靶向BMP-2的游离胺基团将其共价固定于表面，并证实固定化后的蛋白仍保持其短期和长期的生物学活性19. 本方案提供了一种简单高效的方法，将BMP-2递送至细胞 体外 研究发生在细胞膜上的机制及其调控成骨信号相关细胞内信号传导的过程。

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方案

1. 11-巯基十一烷酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MU-NHS）的合成

  1. 在室温下，将500 mg N-羟基琥珀酰亚胺和30 mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10 ml丙酮（p.a.）的溶液逐滴加入含有1 g 11-巯基十一烷酸的40 ml二氯甲烷（p.a.）溶液中。
  2. 将反应液冷却至0 °C，在氮气氛围下，逐滴加入1.1 g N,N'-二环己基碳二亚胺溶于10 ml二氯甲烷的溶液。保持低温反应1小时，随后在室温下搅拌过夜。
  3. 过滤析出的沉淀，并在减压条件下干燥。通过快速柱层析法纯化产物，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯（p.a.）按1:1比例混合的溶液。

2. 均匀金层的制备

  1. 使用精密擦拭纸清洁玻璃盖玻片，并在含有1:1比例的乙酸乙酯（p.a.）和甲醇（p.a.）的溶液中超声处理5分钟。用甲醇冲洗基底，并在氮气流下吹干。
  2. 将清洁的基底放入溅射镀膜仪中。抽真空至腔室达到所需真空度。通过溅射60秒去除铬靶材最上层的氧化铬层。将样品置于金属束下方，先镀上一层10 nm的铬层，随后再镀上一层40 nm的金层。

3. BMP-2 的表面固定化

  1. 将MU-NHS溶解于 N,N-将二甲基甲酰胺（DMF）加入至终浓度约为1 mM，在氮气氛围下室温孵育金基底4小时。
  2. 在DMF中对表面进行2分钟超声处理，用DMF和甲醇冲洗，并在氮气流下吹干。
  3. 在无菌的4 mM HCl中配制浓度为100 μg/ml的rhBMP-2储备液（分装后于-80 °C保存）。工作液稀释时，用PBS/NaCl（含1 M NaCl的PBS）将储备液稀释至3.5 μg/ml，并在使用前立即调节pH至8.5。
  4. 将功能化处理的MU-NHS表面置于rhBMP-2工作溶液中，4 °C孵育过夜。移除孵育后的上清液。用PBS/NaCl超声处理表面2分钟，并用无菌PBS/NaCl洗涤3次。

4. 表面表征

  1. 为阻断抗体的非特异性吸附，先将表面与含5% BSA（w/v）的PBS溶液在室温下孵育1小时，随后与抗BMP-2抗体（1:100，溶于含1%（w/v）BSA的PBS溶液）在室温下孵育1小时。用PBS洗涤表面两次，并超声处理30秒。
  2. 将基底与HRP标记的二抗（1:1,000，溶于含1%（w/v）BSA的PBS溶液）在室温下孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。
  3. 使用Ampliflu Red检测试剂盒，通过酶标仪在570 nm处测定HRP的酶活性。

5. 生物活性分析

  1. 在6孔板中，每孔接种1 × 105个鼠源C2C12成肌细胞，培养基为含丙酮酸的高糖DMEM，补充10% FBS和1%青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  2. 在接种至固定化BMP-2修饰的表面之前，用无血清DMEM对细胞进行3–5小时的饥饿处理。
  3. 为研究短期信号诱导，将培养基更换为200 μl新鲜的无血清DMEM，然后将固定化BMP-2的表面置于细胞上方。操作时应使用精细尖头镊子，避免刮伤表面。
  4. 轻柔移除表面材料，用移液器吸除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。随后进行细胞反应的分析。
  5. 为分析长期生物学活性，将细胞接种于上述表面，在低血清条件（2% FBS）下，于37 °C、5% CO2环境中培养六天。

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结果

在我们的实验设计中，选择金作为辅料，因为它提供了一个生物学上非特异性但化学上可调控的体系。此外，自组装单分子层的应用具有诸多优势：SAMs通过其“头部基团”在金属表面自发吸附，形成缺陷较少的单分子层，而其功能化的末端基团可进一步修饰。因此，SAMs提供了一个可控且高度可调的平台，用于定制界面的性质20。

为了将BMP-2固定在镀金表面上，我们采用两步法：1）将MU-NHS连接剂结合到金层上，然后2）使该连接剂与蛋白质反应（见图1）。为验证rhBMP-2的结合，我们使用了酶联免疫测定法。在此实验中，含有固定化rhBMP-2的表面与BMP-2特异性抗体以及HRP标记的二抗共同孵育。通过Ampliflu Red溶液可检测后者二抗的结合。在过氧化氢存在下，HRP催化无色的Ampliflu Red（10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪）转化为荧光产物试卤灵（resorufin）。我们在功能化表面从上方接近贴壁细胞之前和之后，均检测了表面固定的rhBMP-2（iBMP-2）。请注意，在使用Ampliflu Red法检测rhBMP时，样品需经...

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讨论

在本实验方案中，我们描述了用生物活性重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）功能化修饰表面的制备方法。该方法包括两个步骤：1）在金表面上首先形成双功能连接分子的自组装单分子层（SAM）；2）rhBMP-2蛋白的共价固定。在前期研究中，我们已验证了双功能连接分子与生长因子的有效结合，并证明表面固定的rhBMP-2能够保持其生物学活性19。其他研究也证实了以固定化形式呈现的生长因子具有生物活性，表明蛋白的释放及其后续的细胞内化并非细胞刺激所必需24,25。事实上，生长因子的共价固定可实现对靶细胞的持续刺激，同时由于提高了细胞膜上多种受体的占据率，从而维持有效的剂量效应22,23,26-28。

在制备固定化rhBMP-2的表面时，整个操作过程中应谨慎处理表面材料，并小心配制rhBMP-2溶液。玻璃盖玻片应保持清洁、干燥，表面不得有缺陷或杂质可见。应避免使用镊子或移液器刮伤表面。在采用rhBMP-2进行表面功能化步骤时，必须使用无载体蛋白的重组蛋白。 即 不添加牛血清白蛋白进行制备，以避免载体在表面发生非...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢斯图加特马克斯·普朗克智能系统研究所生物物理化学系（海德堡大学）和新材与生物系统系的 J.P. Spatz 教授提供的大力支持。同时，我们衷心感谢马克斯·普朗克学会以及德国研究基金会（DFG SFB/TR79 项目，资助 E.A.C.-A.）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NN-羟基琥珀酰亚胺Sigma-Aldrich130672 
4-(二甲氨基)吡啶Sigma-Aldrich522805 
丙酮AppliChemA2282 
11-巯基十一烷酸Sigma-Aldrich674427 
二氯甲烷默克106050 
N,N'二环己基碳二亚胺Sigma-AldrichD80002 
石油苯默克 
玻璃盖玻片卡尔·罗斯M 875 
乙酸乙酯AppliChemA3550 
甲醇卡尔·罗特4627 
N,N二甲基甲酰胺卡尔·罗特T921 
rhBMP-2R&D Systems355-BM无载体；在...中表达 大肠杆菌
PBS聚丙烯酸H15-002 
NaCl卡尔·罗特HN00.2 
聚二甲基硅氧烷（PDMS）道康宁 
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒道康宁 
抗-重组人骨形态发生蛋白-2SigmaB9553 
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta Cruzsc-2005二抗
Ampliflu Red 检测Sigma90101 
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（1×），液体Gibco41966高葡萄糖
胎牛血清（FBS）SigmaF7524经无菌过滤，细胞培养测试
青霉素/链霉素Gibco15140 
0.05% 胰蛋白酶（1×）含 EDTA 4NaGibco25300 
甘氨酸（0.1 M）Riedel-de Haën33226 
IGEPAL CA-630（1%）SigmaI8896碱性磷酸酶检测裂解缓冲液19
氯化镁（MgCl2)(1 mM)卡尔·罗特HNO3.2 
氯化锌（ZnCl₂）2) (1 mM)卡尔·罗特3533.1 
对硝基苯基磷酸酯（pNPP）SigmaS0942磷酸酶底物
抗肌球蛋白重链（MHC）发育研究杂交瘤库，爱荷华大学MF20单克隆抗体
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgGInvitrogenA11001 
DAPISigmaD9542 
设备
超声波清洗仪（Sonorex Super RK 102H），频率 35 kHzBANDELIN electronic GmbH & Co. KG 
MED 020 溅射镀膜系统BAL-TEC AG镀膜条件
Cr：120 mA，1.3 × 10-2 毫巴，30 秒
Au：60 mA，5.0 × 10-2 毫巴，45 秒
Tecan Infinite M200 酶标仪Tecan 

参考文献

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