通过鸟类消化系统传播后鉴定传染性朊病毒的实验步骤

摘要

食腐动物可能通过其粪便将具有感染性的可传播性海绵状脑病朊病毒转运至无疫区。我们详细描述了用于确定鼠源适应性羊痒病朊病毒在通过美洲乌鸦（Corvus brachyrhynchos）——一种常见以动物尸体为食的鸟类——消化道后是否仍具有感染性的实验方法。

摘要

传染性朊病毒（PrP^Res）物质可能是导致致命性神经退行性可传播海绵状脑病（TSE）的病因¹。TSE疾病的传播，例如慢性消耗性疾病（CWD），被认为既可通过动物之间的直接接触^2,3，也可通过环境来源进行传播^4-6。食腐动物和食肉动物有可能通过摄食和排泄受CWD污染的动物尸体，将PrP^Res物质转移至其他区域。最近的研究已证实，PrP^Res物质可穿过美洲乌鸦（Corvus brachyrhynchos）——一种常见的北美食腐鸟类——的消化系统⁷。

我们描述了用于记录传染性PrP^Res物质通过美洲乌鸦体内过程的实验方法。将RML毒株的小鼠适应型痒病病原经灌胃方式给予乌鸦，并在灌胃后4小时收集其粪便。随后将乌鸦粪便混合后腹腔注射至C57BL/6小鼠体内。对小鼠进行每日观察，直至其出现小鼠痒病的临床症状，随后实施安乐死。无症状小鼠则持续观察至接种后365天。通过蛋白质印迹分析确认小鼠的疾病状态。结果表明，朊病毒在经过乌鸦消化系统后仍具有传染性，并存在于其粪便中，可导致实验小鼠发病。

引言

可传播性海绵状脑病（TSE）是一类致命的传染性神经退行性疾病，可影响野生动物、家养动物以及人类。TSE疾病的传染因子似乎是朊病毒蛋白的错误折叠或致病性异构体（PrP^Res）¹。动物TSE疾病包括骡鹿（Odocoileus hemionus）、白尾鹿（Odocoileus virginianus）、马鹿（Cervus elaphus）和驼鹿（Alces alces）中的慢性消耗性疾病（CWD）；绵羊和山羊中的痒病；家牛中的牛海绵状脑病（BSE）；养殖貂中的可传播性貂脑病；猫中的猫科动物海绵状脑病；牛科家族外来动物园反刍动物中的外来偶蹄动物海绵状脑病；以及非人灵长类动物中的海绵状脑病⁸。唯一的人类TSE疾病——变异型克雅氏病——较为罕见，被认为因摄入被PrP^Res污染的食物而感染⁹。类似地，若食用被污染的牛肉，人类也可能感染BSE¹⁰。在所有TSE疾病中，仅有痒病和CWD被认为具有自我维持的流行病特征，其感染来源推测为动物间传播^2,3,11，以及环境来源^4-6。研究表明，大多数TSE疾病在自然暴露于PrP^Res物质后，需经历显著的潜伏期才会出现临床症状^2-4,6,8，而明显的物种屏障虽可降低但并不能完全消除跨物种传播的可能性^12-14。

确定传染性朊病毒（PrP^Res）物质传播机制对于解答TSE疾病如何在环境中扩散的问题至关重要。实验研究表明，昆虫^15,16、家禽和猪¹⁷，以及美洲乌鸦（Corvus brachyrhynchos）^7,18可能是PrP^Res物质的被动携带者或传播媒介。最近已有研究记录了PrP^Res物质通过乌鸦消化系统的全过程，证实了其在TSE疾病扩散中可能发挥的作用⁷。这些结果表明，作为食腐动物的乌鸦有可能接触并摄取感染性物质，并通过排泄粪便将传染性物质运输至无病区域。

本文所展示的方法用于记录PrP^Res物质在乌鸦消化系统中的传递过程，将极大促进这些方法在未来相关研究中应用于其他食腐动物和食肉动物物种特异性模型。本研究采用常规方法探究了一种非传统的PrP^Res物质传播途径，该途径可能促进PrP^Res物质的扩散及其总体负荷。

方案

本方案改编自我们先前发表的一项研究⁷。所有涉及动物的实验程序均经美国农业部（USDA）动植物卫生检验局（APHIS）野生动物服务局（WS）国家野生动物研究中心（NWRC）机构动物照护与使用委员会批准。

1. 乌鸦灌胃

1. 估算“伪脑组织”通过美洲乌鸦消化道的通过时间。
   1. 将5 ml煮熟并搅匀的全蛋与蓝色染料混合，使用2 in 灌胃针对1只乌鸦进行灌胃（图1）。
   2. 每30分钟检查一次乌鸦，直至不再排出蓝色或绿色染色的粪便为止。
2. 获取未感染及终末期感染RML（Chandler株）的C57BL/6小鼠脑组织。
3. 在子弹式匀浆器中，使用1×磷酸盐缓冲液（PBS）和玻璃珠，将正常和感染的小鼠脑组织分别制成20%（w/v）的匀浆，随后在3,000 × g离心1分钟以去除较大颗粒物质。收集上清液，并加入等体积的1× PBS稀释，得到10%（w/v）的无菌PBS匀浆液。储存于-80 °C，待用时取出。
4. 在灌胃前17小时，停止向乌鸦笼舍提供食物，但保持供水。
5. 将乌鸦随机分配至不同处理组，使用2 in 灌胃针，每只乌鸦口服灌胃5 ml正常或感染的小鼠脑匀浆液。
6. 将乌鸦转移至单独的笼子中，在灌胃后4小时内收集并合并每个笼子内的全部粪便（图2）。
7. 将每只乌鸦的合并粪便在子弹式匀浆器中加入玻璃珠匀浆，直至获得均匀质地。*乌鸦粪便主要为液态，易于混合。
8. 对每只乌鸦，取500 µl粪便匀浆液加入9.5 ml 1× PBS中，总体积为10 ml。
9. 将粪便匀浆液在1,400 × g离心15分钟，并收集上清液。
10. 为降低继发性微生物感染的风险，每100 µl匀浆液中加入1 µl浓度为100单位/ml的青霉素和100 µg/ml的链霉素（Invitrogen, NY），然后在室温下置于紫外灯照射20分钟，以减少病毒和细菌污染风险。紫外照射后，在3000 Mp超声仪上以70档超声处理30秒，以破坏任何残留微生物的细胞膜。

2. 小鼠接种

1. 将小鼠随机分配至以下处理组（表1）：
   1. 第1组——阳性处理组小鼠，通过腹腔注射（IP）接种1 ml来自经口灌胃5 ml感染小鼠脑组织的乌鸦的粪便匀浆。
   2. 第2组——阴性处理组小鼠，通过腹腔注射（IP）接种1 ml来自经口灌胃5 ml正常小鼠脑组织的乌鸦的粪便匀浆。
   3. 将感染性和正常小鼠脑匀浆按1:100 w/v比例用1×PBS稀释，用于第3组和第4组。
   4. 第3组——阳性对照组小鼠，通过腹腔注射（IP）接种1 ml感染性小鼠脑匀浆。
   5. 第4组——阴性对照组小鼠，通过腹腔注射（IP）接种1 ml正常小鼠脑匀浆。

	处理组	动物数量
第1组	痒病 + 乌鸦粪便	100
第2组	痒病 - 乌鸦粪便	25
第3组	痒病 + 小鼠脑组织	10
第4组	痒病 - 小鼠脑组织	5

表1. 接种物的痒病状态（阳性 +，阴性 -）及所用动物数量⁷。

2. 小鼠腹腔接种：
   1. 用拇指和食指捏住小鼠背部颈部皮肤使其固定，并轻轻旋转以暴露腹部。
   2. 抬高小鼠后端，使头部略低于身体。
   3. 使用带锁针筒，将25 G针头从皮肤刺入1 cm，位于中线外侧1 cm处，骶髂关节前1–2 cm。
   4. 缓慢向小鼠体腔内注射1 ml接种物。

3. 小鼠监测

1. 每天观察小鼠，直至其出现小鼠瘙痒病的临床症状。临床症状可能包括：脊柱后凸、共济失调、尾巴僵硬、缺乏理毛行为、消瘦和嗜睡。
2. 当上述6种临床症状中的任何一种明显可见时，对其进行评分，评分标准为：0 = 无可见症状，1 = 中等，2 = 严重。
3. 当小鼠每日总评分达到以下任一标准时实施安乐死：单日总分≥8分，或连续3天每日总分≥6分，或接种后365天（dpi）。
4. 安乐死后立即采集脑组织，并于-70 °C保存。
5. 为确诊瘙痒病，使用3 µl蛋白酶K溶液（PK，50 µg/ml）消化脑组织样本，PK溶液稀释方法如下：3.1 µl PK、12.5 µl 500 mM EDTA（pH 8）、109.39 µl 1x PBS，45 °C孵育30分钟；随后加入8 µl上样缓冲液，在95 °C孵育5分钟以灭活PK。将样本上样至12% SDS-PAGE凝胶，电泳后转至Immobilon PVDF膜，用含5%脱脂奶粉和0.2% Tween 20的PBS溶液室温封闭1小时。然后使用与辣根过氧化物酶偶联的Bar224抗PrP单克隆抗体（用Superblock稀释）室温孵育1小时进行探针杂交。用含0.2% Tween 20的PBS溶液漂洗膜1小时。为显影，将Western blot膜与化学发光底物孵育5分钟，并在G-box凝胶成像系统上成像。

结果

所采用的实验步骤表明，乌鸦的消化系统在经口灌胃接种痒病脑组织匀浆后4小时，并未消除PrP^Res的感染性⁷。所有20只经PrP^Res材料灌胃的乌鸦随后均通过粪便将PrP^Res物质传播给小鼠。通过观察小鼠出现临床痒病症状，并结合蛋白质印迹分析完成疾病确诊，从而确认了患病小鼠的存在。

对乌鸦摄入物质的滞留时间进行研究发现，通过灌胃给药的乌鸦，其消化道通过时间为4小时，依据是粪便中染料的出现（图1）。所有粪便均使用一次性移液管收集，并为每只乌鸦分别合并（图2）。在初步试验中，将未经处理的乌鸦粪便上清液腹腔注射入小鼠后，出现了急性毒性反应。通过用青霉素和链霉素处理粪便接种物，并结合紫外线照射和超声波处理，我们解决了这一问题。

所有接种了朊病毒阳性小鼠脑组织（9/9）或接种朊病毒后乌鸦粪便（66*/84）的小鼠均出现临床症状，并通过蛋白质印迹分析检测呈阳性（图3

讨论

我们展示了一种用于记录PrP^Res物质通过乌鸦消化系统的操作流程。我们采用常规方法检测乌鸦是否能够将PrP^Res物质转移至无疫病的地理区域。此前已有研究评估了PrP^Res对反刍动物^19-21和啮齿类动物^22,23消化液的抗性，结果均显示这些消化液无法将其消除。未来应将这些技术应用于其他食肉动物²⁴，因为它们也可能在食用腐肉时接触PrP^Res物质，并将该物质携带至不同地理区域，从而促进朊病毒疾病的传播。

我们在炒鸡蛋“伪脑”材料中加入蓝色食用色素，以简单评估匀浆小鼠脑组织通过乌鸦消化道的大致通过时间。建议采用该技术的研究者首先检查研究动物现有粪便的颜色，然后选用与之对比最明显的食用色素。这将有助于轻松识别已通过研究动物体内的、被食用色素染色的物质。我们选择使用食用色素来估算通过时间，但也有其他研究者使用荧光颜料²⁵、氧化铁²⁶、彩色塑料标记物²⁷以及彩色金属薄片（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RML Chandler株小鼠适应性羊瘙痒病	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6小鼠	Hilltop Lab Animals
美洲乌鸦	野外捕获
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Invitrogen	15140-122
磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered Saline）	Invitrogen	70011-044
超声波破碎仪（Sonicator）	Misonix
蛋白酶K溶液（Proteinase-K solution）	Roche	3115887001
上样缓冲液（Loading buffer）	Invitrogen	NP0007 和 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% 胶	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF 膜	Millipore	1SEQ00010
吐温20（Tween 20）	Sigma Aldrich	P2287
子弹式搅拌器均质仪（Bullet blender homogenizer）	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm 氧化锆/二氧化硅珠（Zirconia/silica beads）	BioSpec Products	11079125Z
Bar224抗PrP单克隆抗体	Cayman Chemical	10009035
Superblock封闭液	Thermo Scientific	37517
化学发光底物（chemiluminescent substrate）	Millipore	WBKLS0500
G-box凝胶成像系统	Syngene