利用共培养检测化学介导的种间相互作用

摘要

细菌会产生分泌性化合物，这些化合物可能影响其邻近微生物的生理活动。本文介绍了一种共培养筛选方法，通过在固体培养基上将土壤微生物与荧光转录报告菌株 Bacillus subtilis 混合培养，从而检测此类由化学物质介导的种间相互作用。

摘要

在自然界中，细菌很少孤立存在；它们通常被多种多样的其他微生物包围，这些微生物通过分泌代谢物改变局部环境。这些代谢物有可能调节邻近微生物的生理状态和分化过程，在复杂微生物群落的建立与维持中可能发挥重要作用。我们开发了一种基于荧光的共培养筛选方法，用于识别此类由化学物质介导的微生物相互作用。该筛选方法涉及将一种携带荧光转录报告基因的菌株与环境微生物在固体培养基上共同培养，使菌落处于共培养状态下生长。该荧光转录报告系统经过设计，使得目标细菌在表达特定感兴趣表型时产生荧光信号即 生物膜形成、孢子形成、毒力因子产生 等等在该表型表现的生长条件下进行筛选 不 表达（因此报告菌株通常不发荧光）。当环境微生物分泌能够激活该表型的代谢物时，该代谢物会扩散通过琼脂并激活荧光报告系统。由此可检测出产生诱导性代谢物的微生物：它们是位于荧光菌落附近、距离最近的非荧光菌落。因此，该筛选方法可用于鉴定能够产生可扩散代谢物、并激活报告菌株特定生理反应的环境微生物。本文将介绍如何：a）选择合适的共培养筛选条件；b）制备用于筛选的报告菌株和环境微生物；c）实施共培养筛选；d）分离潜在的诱导性微生物；e）通过二次筛选验证其活性。本研究开发该方法旨在筛选能够激活生物膜基质合成的土壤微生物。 枯草芽孢杆菌；但我们也讨论了将该方法应用于其他遗传操作可行的细菌时需考虑的因素。

引言

我们致力于研究细菌分泌的代谢物如何影响邻近微生物的生理状态和发育过程。许多代谢物已被证实对其他微生物具有生物活性作用。其中两个研究较为深入的例子包括抗生素——可抑制其他微生物的生长，以及群体感应分子——可改变其他微生物的整体基因表达。然而，细菌还会产生大量其他的小分子天然产物，其生物活性目前尚不明确¹。我们推测，细菌在进化过程中保留了合成其中部分代谢物的能力，是因为这些代谢物能够帮助它们在复杂的微生物群落中调控邻近微生物的细胞生理活动，而大多数细菌正是存在于此类群落环境之中。

Bacillus subtilis 细胞类型

我们的研究重点是涉及Bacillus subtilis的化学介导的微生物相互作用。这不仅因为它是革兰氏阳性菌的模式生物，并且拥有丰富的可用于遗传操作的工具，还因为它能够分化为多种特征明确的细胞类型。这些细胞类型包括：能够游动的细胞；产生形成稳定生物膜所需胞外基质的细胞；具有摄取环境中DNA能力的感受态细胞；以及形成芽孢的细胞等²。每种细胞类型都表达特定的转录调控网络，使其在生理和/或形态上与其基因完全相同的同胞细胞相区别。在多种生长条件下，多种细胞类型可在单个B. subtilis菌落内以不同亚群的形式共存³。尽管许多细菌物种可能表现出类似的细胞类型异质性，但这一现象在B. subtilis中得到了尤为深入的研究。

特别是，已在每种特定的 B. subtilis 细胞类型中鉴定出上调表达的基因。鉴定这些上调基因对于本文所述的研究工作至关重要，因为许多感兴趣的微生物表型难以甚至无法直接观察。例如，我们无法在固体（1.5%）琼脂平板上直观地检测到“游动”这一性状，尽管在这些条件下，B. subtilis 的部分细胞群体能够产生鞭毛³。另一个例子是生物膜基质的产生。基质的产生可通过菌落形态进行观察（因其会导致菌落在宏观上呈现皱褶状），但仅能在特定培养基上，并且需要经过数天培养后才能显现⁴。然而，通过了解在细胞分化过程中哪些基因被上调，我们可以构建转录报告系统，用作这些细胞类型发生分化的标记。

报告基因载体构建

这些荧光转录报告系统由细胞类型特异性基因的启动子驱动报告基因（例如荧光蛋白）的表达构成。例如 P_hag-yfp（用于游动细胞）、P_tapA-yfp （用于生物膜基质产生细胞）和 P_sspB-yfp （用于孢子形成细胞），其中 P_x 表示基因 x 的启动子区域。这些报告载体被整合到染色体上的一个中性位点（图1，见下文），从而保持表型原有调控机制的完整性。然而，当细胞表达该表型时，同时也表达荧光蛋白。这为特定表型行为的激活提供了易于观察的读出信号，使我们能够筛选出激活这种生理反应的微生物。尽管此类报告系统在微生物学中已被广泛使用，但在本方法提出之前，尚未被广泛应用于筛选微生物间代谢相互作用的研究中⁵。

在设计和构建细胞类型特异性报告基因菌株时，有若干重要事项需要考虑。我们仅使用转录型荧光报告基因，尽管其他类型的构建体也是可能的。然而，出于以下两个原因，我们不建议在筛选中使用翻译融合蛋白作为细胞类型分化的标记：1）希望保持天然的细胞类型特异性蛋白不受干扰；2）认识到在整个细胞内弥散分布的荧光信号将比细胞内局部分散的荧光点（常见于翻译融合蛋白）更容易被检测到。

报告基因选择

在决定使用转录作为检测读数后，必须选择报告基因（例如 LacZ、荧光或荧光素酶）。LacZ 的优势在于检测所需的专用设备最少，但在环境微生物中出现假阳性的可能性显著更高。根据我们的实验结果，LacZ 的背景水平⁺ 土壤微生物中蓝色个体（Lac）的比例过高（>>10%），使得在土壤微生物中筛选目标生物体变得极为困难⁺) 在X-gal平板上；数据未显示）。通过调整培养基中X-gal的浓度，或许可优化该系统以使用X-gal报告基因，但我们未尝试此方法。荧光素酶检测具有高灵敏度，且为最正交的报告系统：环境中微生物本身具有发光特性的可能性极低。然而，我们发现本机构难以找到可在整个培养皿范围内检测发光信号的仪器，因为大多数设备仅设计用于扫描多孔板中的局部区域。此外，以同时实现诱导菌株的物理分离为目的来可视化发光菌落时，也可能存在技术困难。尽管使用定位标记物（fiducials）可能解决该问题，但我们最终选择使用已被证实有效的荧光转录报告系统，该系统在 B. subtilis，前提是检测具有足够的灵敏度，且在土壤生物中假阳性率较低，并可使用易于获得的仪器进行可视化和分离操作。

荧光染料选择

所选的特定荧光染料将取决于您的细菌种类、所使用的琼脂培养基以及可用的特定荧光滤光片组合。在我们的仪器条件下，我们发现使用YFP（黄色荧光蛋白）滤光片时，B. subtilis 菌落本身及其生长的琼脂背景荧光均较低，因此在我们的实验中，该报告蛋白优于GFP（绿色荧光蛋白）。荧光蛋白的密码子使用频率通常针对真核生物进行了优化，因此选择在文献中已知适用于目标细菌种类的荧光染料，或使用组成型启动子对其进行明确测试，显得尤为重要。目前已有大量不断发展的荧光蛋白变体可供选择⁶，这些变体已在多个文献中进行了综述^7,8，其中一些文献还明确提供了针对实验选择合适荧光蛋白的指导建议⁹。

启动子选择

启动子的选择在很大程度上取决于您感兴趣的细胞类型或表型。对于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）等生物，文献中已建立了一些细胞类型特异性的报告基因。对于其他细菌菌株，则需要分析基因芯片或转录数据，以获取在目标细胞类型显现的条件下哪些基因显著上调的信息。最近一项研究利用覆盖式基因芯片对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）在104种不同生长条件下的转录情况进行了系统整理¹⁰。该研究提供了不同条件下显著上调基因的全面信息，对于特征尚不明确的表型研究具有重要价值。

通常，我们并不精确绘制每个目的基因的启动子区域，而是简单地使用基因上游200-500 bp的序列作为启动子。具体序列长度取决于基因组背景：在必要时采用较短的区域，以避免包含相邻开放阅读框的上游编码区。

中性位点与整合

如何在细菌菌株中维持报告基因构建体，成为设计荧光转录报告菌株时的最终问题。在细菌中，目的基因通常通过抗生素筛选保留在质粒上。然而，在共培养过程中使用抗生素可能会杀死环境微生物，因此可能无法采用抗生素。如果质粒能在目标细菌物种中稳定维持，则可先在含抗生素的条件下培养携带质粒报告基因的细菌，以制备用于筛选的报告菌株，随后在共培养过程中去除抗生素，期望质粒仍能充分保留以实现荧光检测。但如果目标细菌容易丢失质粒，或在胁迫条件下丢失质粒，则此方法不可行。在多数情况下，最佳解决方案是将报告基因构建体整合至细菌染色体中，从而在无选择压力的情况下也能稳定维持报告基因。为避免整合影响目的基因的正常表达或调控，建议将构建体整合至染色体上的一个异位位点，该位点可作为 "中性位点" 在 B. subtilis 这些整合位点是某些基因，当其发生突变时，在特定的最低培养基中会产生可识别的表型（从而无需抗生素筛选即可鉴定整合子），但在丰富培养基中不会改变细胞的生长或孢子形成速率，其中包括诸如 amyE、lacA、thrC、pyrD、gltA 和 sacA （分别表示能够利用淀粉、β-半乳糖苷、苏氨酸、尿嘧啶、谷氨酸和蔗糖）^11-13 .

尽管这些基因的整合在B. subtilis中已可靠使用多年（特别是在amyE和lacA位点），但许多其他细菌物种的基因可能尚无类似的明确信息。噬菌体附着位点是中性染色体整合位点的极佳替代选择：许多物种特异性的^14-16以及通用整合位点（如Tn7附着位点（attTn7））已被鉴定并广泛用于多种细菌中的基因插入^17,18。

环境微生物

我们直接使用土壤作为环境微生物的来源进行共培养筛选。土壤中含有高度多样化的微生物，其中许多生物是天然产物的丰富来源。通过将土壤的液体悬浮液直接接种到含有荧光转录报告菌株的平板上（无需事先从土壤中分离细菌），我们极大地简化了实验流程。土壤可在采集后立即使用，也可在 -80 °C 冻存以备后续使用。立即使用的优势在于可能培养出更丰富的微生物多样性，包括那些对冷冻耐受性较差的微生物；其缺点是这些样品中可培养的土壤微生物浓度未知，从而增加了所需筛选平板的数量。延迟使用的优点是可预先测定每种土壤来源的每毫升菌落形成单位（cfu/mL），从而可在每个筛选平板上优化接种的菌落数量；但其前提是土壤中的微生物必须能够耐受冷冻保存。

请注意，要多样化正在检测的诱导剂组合（即 土壤来源）在识别新的种间相互作用方面似乎比对同一土壤进行更深入的筛选更为有效：随着检测的土壤来源增加，我们在矩阵诱导筛选中鉴定出的阳性结果显示出更高的系统发育多样性，而并非通过对相同土壤来源进行更彻底的筛选所获得（E.A. Shank 和 R. Kolter，哈佛医学院，未发表结果）。

概述

本文所述方法在技术要求方面简单直接，包括以下步骤：1）在B. subtilis或其他目标细菌物种中构建荧光转录报告系统；2）确定该报告系统不被激活的培养条件；3）制备该报告菌株及待筛选生物样品（本研究中为土壤，但也可使用其他来源）的等分试样；4）在固体培养基上将这两类微生物混合共培养；5）识别并分离潜在的诱导生物；6）通过二次筛选验证这些生物是否确实能够激活该表型。一旦获得这些生物及其代谢产物，便可作为化学工具用于调控细菌行为、研究细菌生理学及微生物相互作用，并有望作为未来治疗性化合物的新型骨架结构。

方案

1. 选择报告基因并构建荧光转录报告系统

对于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）：

1. 参见参考文献¹⁹中的 JoVE 文章，了解在Bacillus subtilis中构建荧光转录报告系统的实验方案。

对于其他细菌种类：

1. 确定在目标生理反应过程中表达上调的基因。该基因的确定可基于现有文献，或在特定条件下对微生物进行转录分析。
2. 构建该基因的荧光转录报告系统，以作为表型变化的替代指标。该构建体应包含此上调基因的启动子，用以驱动适当荧光蛋白的表达（参见 图1).
3. 将该构建体整合到染色体的中性位点。这可确保目标基因的天然调控不受干扰，并避免使用质粒筛选机制例如。 抗生素）可能会干扰环境微生物的生长。

2. 确定共培养条件

对于枯草芽孢杆菌 P_tapA-yfp 报告系统：

1. 使用0.1x LB，Lennox（每升含1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl）培养基进行本报告菌株实验，因为B. subtilis在Luria肉汤培养基上的基质生成极少²⁰。该培养基可使B. subtilis菌落生长至亚毫米但可观察的大小，同时允许土壤中多种类群微生物生长⁵。
2. 添加100 mM MOPS缓冲液以最大限度减少可能的pH变化。

对于其他细菌种类：

1. 利用已发表的转录组数据或通过实验测试多种培养条件，筛选出一种能够支持微生物生长但荧光报告基因激活水平可忽略的条件（以便在报告菌株与诱导性微生物共培养时能够检测到其激活信号）。
2. 在筛选来自寡营养环境（如土壤）的环境微生物时，应使用营养成分较低的培养基（相对于传统的富营养微生物培养基），因为许多寡营养细菌在高营养条件下无法生长²¹。低营养培养基还可减小菌落尺寸，从而提高筛选通量。
3. 选择背景荧光低且光学透明性良好的培养基。
4. 优化培养温度，以确保报告菌株和环境微生物能够同时生长。
5. 考虑添加缓冲剂。在培养平板中使用缓冲液可降低检测到由pH介导的生理变化的可能性²²，除非此类相互作用正是研究关注的重点。

3. 准备报告分子分装液

对于枯草芽孢杆菌 P_tapA-yfp 报告系统：

1. 使用无菌牙签或接种棒，将保存于 -80 °C 的报告菌株划线接种至新鲜的 LB 平板上。
2. 在 30 °C 下过夜培养。
3. 在液体培养基中进行连续稀释培养，以减少因在固体培养基上生长而产生的背景荧光：
   1. 接种 5 ml LB 液体培养基，并在 37 °C 下振荡培养。
   2. 当菌液 OD₆₀₀ 达到约 0.6 时，按 OD₆₀₀ 为 0.02 的比例稀释至 5 ml 新鲜 LB 培养基中。
   3. 再次于 37 °C 振荡培养，直至菌液 OD₆₀₀ 达到约 0.6。
   4. 重复上述连续稀释培养，共进行 3 次。
   5. 使最后一次稀释的菌液继续生长至 OD₆₀₀ 约为 0.4。
4. 加入甘油至终浓度为 15–20%。
5. 将 50–200 μl 分装至 0.5 ml 微量离心管中，并于 -80 °C 冻存。
6. 对报告菌株的非荧光亲本菌株制备等量分装样品（后续二次筛选时将需要使用）。

对于其他细菌物种：

1. 使用背景荧光较低的细胞（即 在报告基因所用启动子表达水平极低的条件下培养。
2. 制备并冻存含有已知cfu/ml（每毫升菌落形成单位）的报告菌株分装样品，以便在每块共培养筛选平板上获得适当数量的菌落（详见上文相关部分）。
3. 为非荧光亲本菌株制备等量的分装样品（在二次筛选过程中需要使用）。

4. 获取土壤样品

1. 使用刮勺将土壤采集至无菌锥形管或无菌袋中，弃去暴露的表层土壤最上层的0.5 cm。
2. 按每1 g土壤加入10 ml无菌生理盐水（0.85% NaCl）的比例，制备土壤悬液。
3. 选择从土壤颗粒上分离细菌的方法：a) 立即使用新鲜样品，或 b) 冷冻样品后延迟使用。
   1. 如需立即使用，将悬液涡旋振荡1分钟。
   2. 如需延迟使用，将土壤悬液在搅拌器中进行三次、每次1分钟的搅拌处理，每次搅拌间隔将搅拌杯置于冰上静置1分钟。
4. 静置土壤悬液约1分钟，使其沉淀。
5. 将上层水相转移至新的离心管中。
6. 加入甘油，使其终浓度达到15–20%。
7. 将50–200 μl分装至0.5 ml离心管中，并于-80 °C冷冻保存。

5. 测定冻存报告菌株和土壤样品的cfu/ml

1. 解冻一份冻存的土壤样品和报告菌分装液。土壤微生物可在冰上解冻。由于 B. subtilis 在 4 °C 下会发生裂解，因此这些分装液应迅速在室温下解冻，以尽量减少低温暴露时间。
2. 用 0.1x LB 或其他等渗缓冲液进行两份平行的系列稀释（至 10^-8）。
3. 将每一系列稀释液各取 5 μl 点样于将用于共培养筛选的相同培养基的琼脂平板上。
4. 在室温（或用于筛选的温度）下培养。
5. 次日，计数每个点样区域内的菌落数量，并计算每份冻存分装液的 cfu/ml。

6. 确认涂布筛选平板的分装浓度

1. 按照步骤5.1解冻一份冷冻样品。
2. 稀释至 1 x 10⁵，2.5 × 10⁵，5 × 10⁵，1 × 10⁶，以及 2.5 x 10⁷ cfu/ml
3. 将每种稀释液各取 50 μl 点于单独培养皿的中心。这些稀释度应产生每皿约 25,000 个菌落的理论最佳值，以及该值的 2 倍和 5 倍稀释度，从而确定实际最佳的稀释倍数。
4. 轻轻将约20颗无菌玻璃珠（3 mm）敲入平板中。与弯头玻璃涂布器相比，玻璃珠可使菌落在平板上分布更均匀。
5. 通过将培养板置于实验台面上并前后摇动，同时在操作过程中旋转培养板，使液体被完全吸收。一旦培养板变干，即停止摇动珠子，否则会开始杀死细菌。
6. 将培养板翻转，弃去珠子至含有乙醇的废液杯中。
7. 让平板在你的实验所需时间内生长（例如 24 小时）在适合您实验的正确温度下例如 24 °C/室温
8. 使用解剖体视显微镜，在两个或更多视野中计数菌落数量。
9. 计算单位面积的菌落数量，并确定每块培养皿上的菌落数。
10. 根据需要调整后续稀释比例。实际菌落数并不关键，关键的是每个可比较的筛选平板上的菌落数量应保持一致。

7. 准备共培养板

1. 按照步骤 5.1 的方法解冻报告菌分装液（如果土壤样品被冷冻，则同时解冻土壤分装液）。
2. 将报告菌用 0.1x LB 或其他低营养等渗溶液稀释至第 6 节中优化确定的浓度。
   1. 对于冷冻土壤：使用 0.1x LB 或其他低营养等渗溶液，将土壤稀释至第 6 节中优化确定的浓度。
   2. 对于新鲜土壤：根据预测，新鲜土壤悬液中的菌落形成单位（cfu/ml）浓度可能在 10^-4 至 10^-9 cfu/ml 范围内，据此制备土壤悬液的系列稀释液。
3. 取 50 μl 土壤稀释液和报告菌稀释液，点样于共培养筛选平板的中心位置。同时设置仅土壤和仅报告菌的单独接种作为对照。
4. 按照步骤 6.4–6.6 所述方法，使用玻璃珠涂布均匀。
5. 如果已知可激活报告荧光的生长条件，应将报告菌在这些条件下划线或涂布培养，以获得用于筛选过程中的阳性对照。
6. 在 24 °C 下培养 24–28 小时（或根据所用报告菌/检测方法的适宜条件进行调整）。

8. 荧光筛选共培养板

1. 使用明场照明，调节体视显微镜的焦距，使菌落清晰可见。
2. 观察仅含土壤的平板，判断土壤样品中是否存在自发荧光的菌落。如果存在，则该土壤可能导致假阳性率较高（并伴随二次筛选工作量的增加）。
   1. 在共培养平板中使用较高的报告菌与土壤比例，以增加诱导物周围被多个报告菌菌落包围的可能性，从而降低被误判为假阳性的几率（图2）。
   2. 使用另一种荧光蛋白（即在不同通道发射荧光的蛋白）。
3. 确定检测的时间点。对于大多数新构建的报告菌株，其可能的诱导时间尚不明确，因此需通过实验经验确定。
   1. 一旦在解剖体视显微镜（放大倍数约30X）下可清晰观察到菌落，即开始定期检查荧光信号，持续观察平板直至菌落停止生长和/或背景荧光过高。
   2. 一旦确定了某一特定报告菌株的潜在诱导时间窗口，则在所有含有该报告菌株的共培养平板中，该时间窗口应大致相同，从而简化对筛选平板的监测。对于 B. subtilis P_tapA-yfp 报告菌株，适宜的观察时间为接种后24–28小时；对于 B. subtilis P_sspB-yfp 报告菌株，则为生长26–32小时之间。
4. 最大化荧光检测的灵敏度：
   1. 确保荧光解剖显微镜处于黑暗环境或被遮光帘包围。诱导产生的荧光强度通常低于组成型表达的荧光蛋白，因此需要更高的检测灵敏度。
   2. 在尝试检测共培养平板的荧光信号前，应留出足够时间使荧光灯稳定，并让眼睛适应黑暗环境（至少1–2分钟）。
5. 使用阳性对照（如有），确认当前使用的放大倍数足以检测到荧光信号。通常，当视野范围约为典型菌落直径的30–50倍时（即200–400X），放大倍数较为合适。
6. 关闭明场光源，打开荧光通道的快门。
7. 待眼睛适应黑暗后，缓慢地在视野范围内来回移动平板，寻找明亮的荧光点。
   1. 从平板顶部开始，采用锯齿形路径，在向平板底部移动的同时左右移动平板。
   2. 可在明场下练习移动平板，以掌握合适的移动速度，并确保覆盖整个表面区域。
   3. 移动速度应足够慢，以避免菌落模糊。宁可对表面进行过度采样，也不要遗漏任何区域。
   4. 完成一次完整扫描后，将平板旋转90°并重复扫描。人眼通过这种方法能够非常有效地检测到微弱的荧光信号。
8. 若检测到荧光信号，停止移动平板，返回并定位荧光区域。
9. 缓慢开启明场照明，判断荧光信号是否与细菌菌落相关（而非来自自发荧光的土壤碎屑或培养基组分）。若是，则荧光菌落附近的非荧光菌落即为潜在的诱导菌株。

9. 分离潜在的诱导生物体

1. 一旦鉴定出（荧光）菌落，即分离出分泌诱导化合物的菌落。
   1. 如果平板上生长的报告菌落浓度过高（>0.5:1 报告菌:土壤菌落形成单位），假定的诱导菌落将被多个荧光菌落包围（同样参见 图2).
   2. 在共培养生长情况复杂而难以确定诱导菌落时，应分离多个潜在的诱导菌落，用于在次级筛选中进行后续测试。
2. 将需要挑取的菌落定位在视野中央。
   1. 如果它们靠近培养皿边缘，请旋转培养皿，使培养皿的边缘远离你的惯用手即 如果你是右利手，将培养皿的边缘放在左侧）。这样可以低角度接近菌落，提高挑取的准确性。
3. 放置新鲜的平板用于划线接种疑似诱导菌株，并准备一个废液杯以丢弃使用过的移液枪头。
4. 在保持荧光灯开启的情况下，缓慢打开白光光源，以便根据菌落的形态和位置识别出荧光菌落及其周围可能具有诱导作用的微生物。当无荧光、仅有白光时，你可能需要反复切换光源数次，以准确识别出需要挑取的菌落。
5. 使用一根玻璃棒（200 mm 长 × 5 mm 直径）夹取一个无菌的圆形 200 μl 加样枪头，握持方式如同铅笔。此即用于分离单个菌落的挑取工具。
6. 将外侧手掌靠在载物台上，以稳定其在工作台面上的位置。用另一只手扶住持针工具内侧的拇指一侧，以稳定拾取工具。
7. 如有必要，可在荧光和明场视野之间反复切换，以识别需要挑取的菌落。
8. 保持移液器吸头位于培养皿表面之上，将其移动至视野范围内，并对准拟挑选的菌落上方居中。此时吸头将处于失焦状态。
9. 用放置在显微镜载物台或工作台面上的手外侧边缘，将移液器枪头缓慢转动至待挑选的菌落处。轻轻接触菌落，尽量减少枪头接触到的其他菌落数量。
10. 不旋转挑取工具，直接在新鲜培养皿的表面划线。轻轻涂抹以避免划破琼脂。由于此方法转移的细胞数量较少（菌落远小于常规操作中的菌落），单次连续划线即可获得单菌落。
11. 用其他假定的诱导生物重复此过程。
12. 在24 °C（或根据实验要求的温度）孵育培养板。

10. 划线接种疑似诱导微生物以获得分离的单菌落

1. 使用体视显微镜，根据菌落结构或形态，判断每个疑似挑选出的诱导生物中是否含有不同类型的菌落。
   1. 使用可从上方和下方同时照亮菌落的载物台观察菌落，以检测可能存在的菌落差异。
2. 将每种不同的形态型重新划线接种至新的培养皿上，并培养至菌落生长。
3. 再次重新划线并使其生长。若不同形态型仍然存在，则继续划线纯化。

11. 在二次筛选中重新检测假定的诱导生物体

1. 在二次筛选中重新测试所有潜在的诱导生物，以确定哪些能够激活荧光转录报告系统。二次筛选包括在含有荧光转录报告菌株的微菌落草坪平板上（同时设置对照平板），点种或划线接种潜在的诱导生物。
2. 设置三个相同的平板：一个平板上铺有荧光转录报告菌株的微菌落草坪（浓度与共培养筛选时相同）；一个平板上铺有无荧光报告系统的野生型亲本菌株的微菌落草坪；第三个平板不铺任何菌液。
   1. 标记每个平板背面的顶部，以确定平板的方向。
   2. 为点种或划线位置添加定位标记；每组平板最多可测试十个潜在的诱导生物（图3）。
   3. 如步骤5.1所述，解冻菌液分装样品（报告菌株和非荧光亲本菌株）。
   4. 使用无菌涂布珠，将50 μl浓度为5 × 10⁵ cfu/ml的稀释菌液（或其他优化稀释度）均匀涂布于草坪平板上，操作同步骤6.4。
   5. 让平板自然干燥。
3. 点种或划线接种潜在的诱导生物：
   1. 若希望采用更简便快速的方法，且可接受接种细胞数量不够精确的情况，则选择划线法。操作如下：
      1. 用无菌牙签轻轻接触待测菌落，不要挑取全部细胞。
      2. 在空白平板上划线（划出一小段短划线）。
      3. 使用新的无菌牙签，在报告菌株平板上重复划线。
      4. 使用新的无菌牙签，在对照平板上重复划线。
   2. 若需要定量且可重复的方法，则选择点种法。点种法可使接种细胞数量标准化（详见参考文献5），并允许比较不同诱导生物的相对诱导强度。操作如下：
      1. 将潜在的诱导生物重悬于1 ml液体培养基中，使用无菌塑料比色皿。
      2. 测定重悬液的OD₆₀₀值。
      3. 根据公式 X = 250 ÷ (OD₆₀₀ - 0.5)，将每种重悬液取体积X加入500 μl液体培养基中，使最终溶液的OD₆₀₀达到0.5。该方法在进行多个稀释以标准化OD值时可简化移液步骤，因为所有稀释液均可使用相同的体积（500 μl）。
      4. 将每种OD标准化后的重悬液各取1 μl，点种于三个平板的对应位置。
4. 在24 °C下培养24–28小时（或根据您的报告系统/检测需求选择合适时间）。
5. 使用荧光解剖显微镜观察，鉴定那些能够激活荧光报告菌株但不能激活亲本对照菌株的潜在诱导生物。这些分离株即为阳性结果——即分泌可诱导您目标表型的化合物的环境微生物。

结果

该筛选用于鉴定分泌能够改变B. subtilis生理状态化合物的土壤生物。本文所述结果聚焦于B. subtilis中产生基质的细胞类型，该类型可产生形成稳定生物膜所必需的蛋白质和胞外多糖。我们选择tapA-sipW-tasA操纵子的启动子构建荧光报告系统（P_tapA-yfp）。该操纵子编码基质的蛋白质结构组分，并在生物膜基质生成过程中上调表达²³。我们的基质报告系统（图1）按先前所述方法构建¹⁹。

先前的研究表明 B. subtilis 响应自身产生的类似群体感应分子的表面活性素以及由其他土壤细菌产生的纯化代谢物，从而生成基质²⁰我们希望拓展这些研究，以更广泛地探究哪些土壤微生物能够产生可诱导基质生成的代谢物 B. subtilis我们选择使用稀释的LB培养基进行培养，因为已知该培养基会导致菌膜生成较差。²⁰，从而为我们提供了一种使报...

讨论

本方案的一个固有局限性在于其依赖于微生物的可培养性。已有充分文献记载²⁴，地球上大多数微生物生命目前尚无法在已探索的培养条件下进行培养。因此，使用该方法将无法检测到在自然环境中大量存在的微生物物种间的相互作用。然而，由于我们的目标不仅是识别此类相互作用的存在，还要进一步研究介导这些相互作用的机制和分子，因此必须能够培养这些微生物。即使在可培养的物种中，这一领域也尚未得到充分探索，因此本文所述方法作为识别微生物间化学介导相互作用的一种手段，具有重要价值。此外，尽管本方案已针对筛选Bacillus subtilis的基质诱导效应进行了优化，但从理论上讲，该方法可应用于任何其他细菌物种中的转录荧光报告系统。

该方法的另一个相关局限性在于，此筛选方法（根据定义）需要共培养。在自然环境中，具有不同生长速率的微生物仍可能在空间上相互靠近，同时占据不同的生态位。然而，此类微生物相互作用将无法被我们的共培养筛选方法检测到，因为该方法仅允许营养需求和生长速率与报告菌株相似的环境微生物生长。当然，有可能对方法进行改进，使潜在诱导生物的生长与报告菌株的生长分离。我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分光光度计			任何能够测量OD的分光光度计600 吸光度值
LB培养基，Lennox配方	VWR	80017-484	必要时可使用其他媒体来源。
玻璃珠，3 mm	VWR	26396-508
圆头凝胶上样吸头	VWR	29442-666
玻璃棒	VWR	59060-069
荧光解剖体视显微镜	Zeiss	N/A	作者使用了配备 EXFO X-cite 120 荧光光源、长通 YFP 滤光立方、消色差 0.63X 物镜、10X 目镜和 Axio HRC HR 数字相机的蔡司 Stemi SV6 解剖体视显微镜。大多数筛选工作在聚焦装置放大倍数为 2.0–3.2X 的条件下进行。任何具备荧光功能的解剖体视显微镜均可使用，前提是配备与所用荧光蛋白（FP）匹配的正确滤光片。若显微镜配有可便捷切换明场与荧光模式的快门，以及支持透射光和落射光照明的载物台，则更为理想。如需采集图像，还需配备连接的相机。