利用共培养检测化学介导的种间相互作用

摘要

细菌会产生分泌性化合物，这些化合物可能影响其邻近微生物的生理活动。本文介绍了一种共培养筛选方法，通过在固体培养基上将土壤微生物与荧光转录报告菌株 Bacillus subtilis 混合培养，从而检测此类由化学物质介导的种间相互作用。

摘要

在自然界中，细菌很少孤立存在；它们通常被多种多样的其他微生物包围，这些微生物通过分泌代谢物改变局部环境。这些代谢物有可能调节邻近微生物的生理状态和分化过程，在复杂微生物群落的建立与维持中可能发挥重要作用。我们开发了一种基于荧光的共培养筛选方法，用于识别此类由化学物质介导的微生物相互作用。该筛选方法涉及将一种携带荧光转录报告基因的菌株与环境微生物在固体培养基上共同培养，使菌落处于共培养状态下生长。该荧光转录报告系统经过设计，使得目标细菌在表达特定感兴趣表型时产生荧光信号即 生物膜形成、孢子形成、毒力因子产生 等等在该表型表现的生长条件下进行筛选 不 表达（因此报告菌株通常不发荧光）。当环境微生物分泌能够激活该表型的代谢物时，该代谢物会扩散通过琼脂并激活荧光报告系统。由此可检测出产生诱导性代谢物的微生物：它们是位于荧光菌落附近、距离最近的非荧光菌落。因此，该筛选方法可用于鉴定能够产生可扩散代谢物、并激活报告菌株特定生理反应的环境微生物。本文将介绍如何：a）选择合适的共培养筛选条件；b）制备用于筛选的报告菌株和环境微生物；c）实施共培养筛选；d）分离潜在的诱导性微生物；e）通过二次筛选验证其活性。本研究开发该方法旨在筛选能够激活生物膜基质合成的土壤微生物。 枯草芽孢杆菌；但我们也讨论了将该方法应用于其他遗传操作可行的细菌时需考虑的因素。

引言

我们致力于研究细菌分泌的代谢物如何影响邻近微生物的生理状态和发育过程。许多代谢物已被证实对其他微生物具有生物活性作用。其中两个研究较为深入的例子包括抗生素——可抑制其他微生物的生长，以及群体感应分子——可改变其他微生物的整体基因表达。然而，细菌还会产生大量其他的小分子天然产物，其生物活性目前尚不明确¹。我们推测，细菌在进化过程中保留了合成其中部分代谢物的能力，是因为这些代谢物能够帮助它们在复杂的微生物群落中调控邻近微生物的细胞生理活动，而大多数细菌正是存在于此类群落环境之中。

Bacillus subtilis 细胞类型

我们的研究重点是涉及Bacillus subtilis的化学介导的微生物相互作用。这不仅因为它是革兰氏阳性菌的模式生物，并且拥有丰富的可用于遗传操作的工具，还因为它能够分化为多种特征明确的细胞类型。这些细胞类型包括：能够游动的细胞；产生形成稳定生物膜所需胞外基质的细胞；具有摄取环境中DNA能力的感受态细胞；以及形成芽孢的细胞等²。每种细胞类型都表达特定的转录调控网络，使其在生理和/或形态上与其基因完全相同的同胞细胞相区别。在多种生长条件下，多种细胞类型可在单个B. subtilis菌落内以不同亚群的形式共存³。尽管许多细菌物种可能表现出类似的细胞类型异质性，但这一现象在B. subt....

方案

1. 选择报告基因并构建荧光转录报告系统

对于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）：

1. 参见参考文献¹⁹中的 JoVE 文章，了解在Bacillus subtilis中构建荧光转录报告系统的实验方案。

对于其他细菌种类：

1. 确定在目标生理反应过程中表达上调的基因。该基因的确定可基于现有文献，或在特定条件下对微生物进行转录分析。
2. 构建该基因的荧光转录报告系统，以作为表型变化的替代指标。该构建体应包含此上调基因的启动子，用以驱动适当荧光蛋白的表达（参见 图1).
3. 将该构建体整合到染色体的中性位点。这可确保目标基因的天然调控不受干扰，并避免使用质粒筛选机制例如。 抗生素）可能会干扰环境微生物的生长。

2. 确定共培养条件

对于枯草芽孢杆菌 P_tapA-yfp 报告系统：

1. 使用0.1x LB，Lennox（每升含1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl）培养基进行本报告菌株实验，因为B. ....

结果

该筛选用于鉴定分泌能够改变B. subtilis生理状态的化合物的土壤生物。本文所述结果聚焦于B. subtilis中产生基质的细胞类型，该类型可产生形成稳定生物膜所必需的蛋白质和胞外多糖。我们选择tapA-sipW-tasA操纵子的启动子构建荧光报告系统（P_tapA-yfp）。该操纵子编码基质的蛋白质结构组分，并在生物膜基质生成过程中上调表达²³。我们的基质报告系统（图1）按先前所述方法构建¹⁹。

先前的研究表明 B. subtilis 在响应自身产生的类似群体感应分子的表面活性素以及由其他土壤细菌产生的纯化代谢物时，会生成基质²⁰我们希望拓展这些研究，以更广泛地探究哪些土壤微生物能够产生可诱导基质生成的代谢物 B. subtilis我们选择使用稀释的LB培养基进行培养，因为已知该培养基会导致菌膜生成不良。²⁰，为我们提供了一种生长.......

讨论

本方案的一个固有局限性在于其依赖于微生物的可培养性。已有充分文献记载²⁴，地球上大多数微生物生命目前尚无法在已探索的培养条件下进行培养。因此，使用该方法将无法检测到在自然环境中大量存在的微生物物种间的相互作用。然而，由于我们的目标不仅是识别此类相互作用的存在，还要进一步研究介导这些相互作用的机制和分子，因此必须能够培养这些微生物。即使在可培养的物种中，这一领域也尚未得到充分探索，因此本文所述方法作为识别微生物间化学介导相互作用的一种手段，具有重要价值。此外，尽管本方案已针对筛选Bacillus subtilis的基质诱导效应进行了优化，但从理论上讲，该方法可应用于任何其他细菌物种中的转录荧光报告系统。

该方法的另一个相关局限性在于，此筛选方法（根据定义）需要共培养。在自然环境中，具有不同生长速率的微生物仍可能在空间上相互靠近，同时占据不同的生态位。然而，此类微生物相互作用将无法被我们的共培养筛选方法检测到，因为该方法仅允许营养需求和生长速率与报告菌株相似的环境微生物生长。当然，有可能对方法进行改进，使潜在诱导生物的生长与报告菌株的生长分离。我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分光光度计			任何能够测量OD的分光光度计600 吸光度值
LB培养基，Lennox配方	VWR	80017-484	必要时可使用其他媒体来源。
玻璃珠，3 mm	VWR	26396-508
圆头凝胶上样吸头	VWR	29442-666
玻璃棒	VWR	59060-069
荧光解剖体视显微镜	Zeiss	N/A	作者使用了配备 EXFO X-cite 120 荧光光源、长通 YFP 滤光立方、消色差 0.63X 物镜、10X 目镜和 Axio HRC HR 数字相机的蔡司 Stemi SV6 解剖体视显微镜。大多数筛选工作在聚焦装置放大倍数为 2.0–3.2X 的条件下进行。任何具备荧光功能的解剖体视显微镜均可使用，前提是配备与所用荧光蛋白（FP）匹配的正确滤光片。若显微镜配有可便捷切换明场与荧光模式的快门，以及支持透射光和落射光照明的载物台，则更为理想。如需采集图像，还需配备连接的相机。