通过将脑组织切片与癌细胞进行器官型共培养，可以在癌细胞侵袭脑组织的过程中，利用荧光显微镜以及明场（视频）显微镜观察其形态学变化。该模型系统还支持细胞交换与补充操作，并可进行多种实验干预和分析。
方法文章
具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统 关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
癌细胞发生脑转移的患者预后较差。然而，转移灶局部发生的过程却鲜有研究，尤其是局部定居的（间质性）细胞所起的作用。原发性癌的研究表明，微环境对转移过程甚至预后均有影响1,2。特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可促进癌细胞的迁移、侵袭和增殖3。值得注意的是，主要的转移靶器官均含有组织特异性巨噬细胞，例如肝脏中的枯否细胞或中枢神经系统（CNS）中的小胶质细胞。此外，转移部位还存在其他组织特异性细胞，如星形胶质细胞。最近研究表明，星形胶质细胞可促进癌细胞的增殖和持续存活4,5。因此，这些组织特异性细胞类型的功能在脑转移过程中似乎具有非常重要的作用6,7。
然而，尽管有这些观察结果，迄今为止仍缺乏合适的体内/体外模型，用于直接可视化脑转移形成过程中胶质细胞的反应，尤其是通过明场显微镜进行观察。近期对癌细胞进行的体内活体成像揭示了它们在脑内的定植行为8。然而，该方法极为耗时、成本高昂且技术复杂。此外，此类动物实验仅限于小规模系列研究，并会给实验动物带来显著负担（包括颅骨植入玻璃窗、肿瘤细胞注射、反复麻醉及长期固定等操作）。更重要的是，目前的体内成像技术仅局限于对癌细胞的可视化，尚无法展示其与脑内常驻细胞之间的相互作用。最后，在免疫健全动物体内研究人类癌细胞是不可能的8。
基于这些原因，我们建立了一种共培养系统，该系统由小鼠脑组织切片与嵌入Matrigel中的上皮细胞（三维细胞球）组成。将三维癌细胞球直接放置于脑切片边缘附近，以研究其对邻近脑组织的侵袭情况。该方法可使我们通过荧光显微镜甚至明场显微镜观察胶质细胞与癌细胞之间的形态学变化及相互作用。共培养实验结束后，可收集脑组织或三维细胞球用于后续分子分析。例如 qRT-PCR、IHC 或免疫印迹）以及共聚焦显微镜观察。该方法可用于连续数天监测活体脑组织中的动态变化，而不会对脑片造成有害影响。该模型还允许通过供体组织的细胞选择性抑制并替换定居细胞，以确定特定基因型的独立作用。最后，共培养模型是一种可行的替代方案 体内 在测试靶向药理学干预时采用的方法。
方案
该新模型是对先前发表的器官型海马脑切片方法9-12的一种改进。通过引入修改和补充，优化了癌细胞与脑组织之间的相互作用，并确保实验的可重复性。本研究已通过当地伦理委员会的审查和批准。动物实验严格按照哥廷根大学医学中心的动物护理指南进行操作。器官型脑切片共培养模型可分为两个步骤：第一步为器官型脑切片的制备；第二步包括肿瘤细胞的准备及其在共培养体系中的接种。
1. 器官型脑切片
- 准备解剖培养基，其成分为最低必需培养基（MEM），添加 0.2 mM 谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素和 4.5 mg/ml 葡萄糖。
- 取出生后第6至第8天（P6-8）的任何小鼠品系，将其处死并断头。
- 在无菌条件下迅速将脑组织从颅骨中取出，并转移至冰冻的解剖培养基中。
- 从完整脑组织切片中去除额极和小脑。
- 使用冷冻胶和5%琼脂糖将脑组织固定并稳定在切片台上。
- 使用振动切片机将脑组织水平切成350 μm厚度的切片。
- 根据物种和年龄，从单个小鼠脑组织中收集4至6片完整的脑切片。
- 准备培养基，其成分为50% MEM、25% Hanks平衡盐溶液（HBSS）、25% 正常马血清（NHS）、0.2 mM 谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素（Sigma，德国慕尼黑）和4.5 mg/ml 葡萄糖。
- 将每一片器官型脑切片置于六孔板中的0.4 μm聚碳酸酯Transwell膜插件上，下室加入1 ml培养液。
- 将器官型脑切片在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养过夜。
2. 脑片共培养模型
- 嵌入 105 GFP转染的肿瘤或其他细胞例如 MCF-7-GFP 细胞置于 20 μl 凝胶基质中，该基质由 15% RPMI 培养基和 85% ECM 凝胶组成。
- 将MCF-7-凝胶基质混合物放入无菌金属垫片（直径3.8 mm）中，紧邻脑片培养切片的皮质区域，并孵育2小时。
- 移除间隔器，使3D肿瘤球体与类器官切片共培养24-96小时。
- 每隔一天更换一次培养基。
3. 器官型脑切片共培养中星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫荧光染色
- 用4%多聚甲醛在4 °C下固定脑组织切片共培养物8小时。
- 用PBST（含0.5% Triton X-100的PBS）洗涤切片共培养物5分钟。
- 用正常山羊血清（1:20溶于PBST）在室温下封闭样本1小时。
- 通过将脑组织切片共培养物与抗胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体（GFAP，1:200溶于PBST）在4 °C孵育36小时，随后在室温下用山羊抗小鼠TRITC标记二抗（1:100溶于PBST）染色1小时，以标记星形胶质细胞。
- 用PBST洗涤样本3次，每次5分钟。
- 用ILB4-Alexa Fluor 647（1:100溶于PBST）在室温下对小胶质细胞染色1小时。
- 用DAPI（1:1,000）在室温下对脑组织切片共培养物进行复染3分钟。
- 使用DAKO荧光封片剂封片并加盖盖玻片。
- 根据以下评分系统评估肿瘤侵袭程度：0 = 无细胞侵袭；+ < 1/3；++ = 1/3 - 2/3；+++ ≥ 2/3的侵袭细胞（首先测量肿瘤块与切片之间的接触区域长度，然后测量侵袭细胞可检测到的接触部分所占比例）。
4. 胶质细胞与肿瘤细胞相互作用的活体成像
- 在 Leica 倒置 DMI 6000B 显微镜下使用 10 倍物镜，并配合 Leica DFC 350 FX CCD 相机进行实验。
结果
首先，所有使用的人类（MCF-7）和小鼠（410.4）癌细胞均侵入了类器官小鼠脑切片，表明该侵袭行为具有物种非依赖性。图1A），表明其具有广泛的应用性，且不受物种限制。此外，小胶质细胞以及星形胶质细胞如先前所述在界面处聚集 体内 以及在患者样本中13长时间的延时成像不仅揭示了脑片的存活状态，还为观察细胞间的相互作用提供了良好的平台。通过延时实验，记录到小胶质细胞进入三维细胞球，而癌细胞也同时侵入脑片。图1B1-B2此外，我们先前已证实小胶质细胞能够通过一种尚不明确的机制转运癌细胞，从而促进癌细胞的侵袭。利用免疫荧光标记技术，我们描述了肿瘤细胞与基质细胞的共定位现象例如 小胶质细胞和星形胶质细胞），无论是在脑组织中还是在肿瘤细胞团块中（图1C-D)，表明这些细胞在侵袭过程中存在紧密的相互作用。当将小鼠脑切片与人类（图1C1-C3）或小鼠（图1D1-D3) 癌细胞——展示了研究来自不同物种、基因型和品系细胞的广泛应用范围。
图1. 小鼠和人源癌细胞三维球状体与脑切片共培养模型。A) 在器官型全脑切片共培养体系中，对小鼠乳腺癌细胞系410.4和人乳腺癌细胞系MCF-7的癌细胞侵袭情况进行定量分析。数据表示每组中细胞侵入脑切片程度的百分比，n ≥ 38。两组之间无显著差异（Kruskal-Wallis检验）。B) 器官型全脑切片与MCF-7-GFP细胞共培养的时间推移图像，显示第2天（B1）和第5天（B2）的代表性图像。C-D) 共聚焦显微镜图像展示了癌细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的分布情况。对整个共培养体系进行双重染色：星形胶质细胞（抗GFAP-TRITC，红色）和小胶质细胞（ILB4-Alexa Fluor 647，紫色），并与350 μm厚的器官型脑切片及GFP转染的肿瘤细胞团（绿色）合并成像：3D-MCF-7-GFP（C1-C3）和3D-410.4-GFP（D1-D3）。白色虚线表示脑切片边缘及肿瘤侵袭前沿。比例尺为50 μm。图中显示了共培养脑切片中的小胶质细胞、星形胶质细胞与肿瘤细胞的共定位（C1 和 D1），星形胶质细胞-肿瘤细胞共定位（C2 和 D2），以及小胶质细胞-肿瘤细胞共定位（C3 和 D3）。点击此处查看高清图像
讨论
既往对脑转移瘤的组织学研究表明，脑内常驻胶质细胞（尤其是星形胶质细胞和小胶质细胞）会发生快速而显著的变化13。为了研究这些变化及其与癌细胞的相互作用，这种新型的共培养系统非常适用。其他研究领域早已广泛使用海马区脑片的器官型培养。其优势之一在于，器官型海马脑片培养物可存活并有效保存数天至数周，适用于长期实验。自Stoppini于1991年首次提出器官型海马脑片培养系统以来，该系统已被广泛应用于退行性疾病等研究领域。因此，这一创新的共培养系统是对一种成熟方法的改进，具有在肿瘤生物学中广泛应用的潜力9,11。该改进为我们提供了一种可重复的模型，可用于后续评估肿瘤侵袭程度，而采用界面法培养的组织更适合需要三维结构的实验。已有多种技术用于将器官型海马脑片与其他细胞进行共培养，包括巨噬细胞与器官型脑片之间的间接共培养系统14，以及来自海马区的两种不同脑片的直接共培养15。胶质瘤聚集体也已被与脑片进行共培养16。这些模型可用于分析脑片中的细胞和分子事件，但无法实现肿瘤细胞、小胶质细胞与脑实质之间的直接生理性接触。此外，该方法可在无骨髓来源的外周单核细胞/巨噬细胞污染的情况下观察小胶质细胞。使用CCR2和CX3CR1转基因小鼠模型是一项关键改进，因为基于这些细胞的相似特性，很难区分常驻小胶质细胞与浸润的单核细胞17,18,19。尽管向脑内注射癌细胞可用于研究肿瘤进展，但无法明确周围类似巨噬细胞的细胞是来源于脑内常驻的小胶质细胞群体，还是来源于骨髓来源的外周单核细胞/巨噬细胞17。Kettenmann团队曾提出一种器官型脑片模型，通过显微操作仪将胶质瘤细胞接种至脑片中20。然而，原发性恶性胶质瘤在许多方面与转移性癌显著不同。首先，恶性胶质瘤起源于间充质组织，不会向神经系统外转移，且以单个细胞形式迁移/侵袭，肿瘤与脑组织之间无明确边界。相反，浸润性生长是其典型的病理特征，而此类癌通常以细胞群（cohorts）形式迁移/侵袭。其次，癌细胞常试图在脑内重建上皮样结构，而胶质细胞则倾向于通过（假）包膜将肿瘤与脑组织分隔开来。从生物学和形态学特征来看，恶性胶质瘤与癌的转移灶实际上并不具备可比性。基于上述原因，我们改进并开发了一种共培养系统：不采用注射方式，而是将癌细胞团块与脑片相邻共培养。此外，我们观察到小胶质细胞和星形胶质细胞在肿瘤团块边缘聚集，表明小胶质细胞可进入肿瘤团块，并可通过明场显微镜轻松检测，随后通过共聚焦显微镜加以确认。癌细胞向脑片内侵袭，这一过程与真实的in vivo情况相似，也与Baumert及其同事的观察结果一致：他们在63%的脑转移瘤尸检病例中发现了浸润带21。
由于缺乏血液灌注，该培养体系中仅存在常驻巨噬细胞/小胶质细胞。此外，由于缺乏T细胞，因而不存在同种异体反应性，因此即使使用免疫功能健全的小鼠或大鼠（NMRI、B6或Wistar品系）的脑切片，也可与人源癌细胞进行共培养。这种方法可作为裸鼠模型的一种替代方案。由于每只小鼠可获得四至五片脑组织切片，与现有的注射模型相比，所需实验动物数量显著减少。此外，动物不会经历长时间的转移性疾病过程，也无需反复接受手术操作22。
利用该共培养系统，我们证实了肿瘤细胞可激活小胶质细胞，并具有促进肿瘤细胞侵袭的能力。此外，据我们所知，这是首次发现小胶质细胞能够主动转运癌细胞23。
尽管具有上述所有优势，共培养系统确实也存在一些局限性。它仍然是一种 体外 模型缺少转移过程中定植前的步骤。由于缺乏灌注，无法研究细胞外渗过程。因此，研究外渗的替代方法是使用以下任一方法 体内 注射模型或改良型Boyden小室系统联合细胞外基质、HUVEC和星形胶质细胞以模拟血脑屏障22,24脑片共培养方法仍是一种可靠且可重复的模型，具有多种优势和广泛的应用潜力，例如可用于分析定植过程，尤其适用于研究常驻细胞所起的作用。该方法结合其他成熟技术（如免疫组织化学、共聚焦显微镜和延时显微镜），有助于深入探究细胞间的直接相互作用。它是一种简便的替代和补充手段，为研究转移性微环境所施加的信号及其效应提供了有效途径。
披露
我们无任何披露事项。
致谢
作者感谢 Chalid Ghadban 提供的出色技术协助，感谢 Andreas Wodarz 和 Stephan Heermann 在共聚焦显微镜和延时显微镜技术方面的指导。所有作者均无利益冲突。本研究由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为研究小组 942（FOR942 BI 703/3-1）中的第 2 项，同时获得德国巴登-符腾堡州癌症奖（Dres. Bayer-Stiftung）以及德国哥廷根乔治-奥古斯特大学医学院研究计划的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco, Darmstadt, Germany | 24020 | |
| 最低必需培养基（MEM） | Gibco, Darmstadt, Germany | 32360 | |
| RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
| Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（PBS） | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
| 正常马血清（NHS） | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
| 胎牛血清（FCS） | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
| 葡萄糖 | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
| L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液 | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
| 振动切片机 | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
| 切片机 | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
| 聚碳酸酯膜 | BD Falcon, Heidelberg, Germany | 353090 | transwell 膜插件（0.4 μm 孔径） |
| ECM 凝胶 | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | 基底膜提取物 |
| 金属垫片 | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
| 延时显微镜及相机 | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B 显微镜和 DFC 350 FX CCD 相机 | |
| 解剖显微镜 | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
| 多聚甲醛 | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
| 小鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体 | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
| 山羊抗小鼠 IgG, F(ab')2-TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
| 来自 Griffonia simplicifolia 的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 647 偶联物 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
| DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
| 荧光封片介质 | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |
参考文献
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