本方案描述了在真核细胞上应用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的方法。在此，我们通过分析巨噬细胞对其微环境刺激所产生的多种活化状态，展示了该技术的准确性。
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本文内容
摘要
摘要
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）是化学和生物化学领域广泛使用的一种质谱技术，也已应用于医学中以鉴定分子和生物标志物。近年来，该技术在微生物学中被用于常规鉴定来自临床样本的细菌，无需样品制备或分级步骤。我们及其他研究者已成功将这种全细胞MALDI-TOF质谱技术应用于真核细胞。目前的应用范围涵盖细胞类型鉴定、细胞培养的质量控制评估以及诊断应用。本文描述了该技术用于研究巨噬细胞在细胞因子或热灭活细菌刺激下不同极化表型的应用。该方法能够识别出代表巨噬细胞蛋白质组反应多样性的特异性指纹图谱。此应用展示了该方法的准确性与简便性。本文所述方案可能有助于研究病理条件下宿主的免疫应答，也可拓展至更广泛的诊断应用。
引言
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）是一种研究生物样品的常用质谱技术。该技术利用激光束和吸能基质实现软电离过程：使大分子生物分子（通常为单电荷）蒸发并生成离子。这一过程称为解吸/电离，由此得名MALDI。随后，这些离子在电压作用下被加速，并进入飞行时间（TOF）分析器，从而实现离子的分离及其相应质量的定量1。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已广泛应用于生物学、化学和医学领域，用于鉴定分子和生物标志物2-4 或监测 蛋白质5,6上的翻译后修饰。近年来，多个研究团队已将MALDI-TOF MS应用于临床样本中微生物的鉴定7,8。这种微生物学应用目前已在临床实践中常规使用。与MALDI-TOF MS的传统应用相比，全细胞MALDI-TOF具有多种优势：含有完整细胞的样本可直接处理，避免了耗时的组分分离或大量物质纯化步骤。此外，无需对各个质谱峰进行表征——整个质谱图被视为样本的“指纹”，通过匹配算法将待测样本的谱图与参考谱图数据库进行比对。
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方案
在本实验方案中，采用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术获得被视为样品指纹的质谱图。通过生物信息学分析，实现对这些指纹图谱的比较与分类。本方案主要包括以下三个部分：
- 生物样本的制备：对照组巨噬细胞及用不同激动剂刺激的巨噬细胞。
- 采用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对每种样本进行技术重复分析。
- 原始数据的生物信息学分析。
制备用于细胞分离和培养的无菌溶液。所有试剂均需在 4 °C 下配制和保存
1. 人单核细胞的制备
- 准备细胞培养基。向 RPMI 1640 培养基（500 ml）中加入 55 ml 人 AB+ 血清或胎牛血清（FBS）以及 5 ml 抗生素溶液（青霉素浓度为 10,000 UI/ml，链霉素浓度为 10,000 μg/ml；最终浓度分别为青霉素 100 UI/ml 和链霉素 100 μg/ml ）。
- 从白细胞浓缩物（leukopacks）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 准备含有 15 ml Ficoll 的 50 ml 离心管。用生理盐水按体积比 1:10 稀释血液。将 30 ml 稀释后的 PBMCs ....
- 从白细胞浓缩物（leukopacks）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
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结果
本实验方案的目的是展示全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在评估巨噬细胞对其微环境响应能力方面的准确性。
图1 描述了从血液样本中制备刺激后巨噬细胞的过程。图2 展示了通过流式细胞术对单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）的分析结果。请注意，单核细胞表达CD14但不表达CD68（图1A）；相反，MDMs表达CD68但不表达CD14（图1B）。
图3 描述了全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的原理。细胞与基质一同点样于靶板上。在质谱仪内，激光束对样品进行多次照射（共240次），诱导分子的脱附与电离。所产生的离子在磁场作用下被加速，并根据其m/z比值在管中分离。飞行时间（TOF）分析器记录各类离子在管末端的撞击信号。根据飞行时间，每次撞击被转换为相应的m/z比值.......
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讨论
本方案描述了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）在真核细胞全细胞分析中的应用。在此，我们通过分析巨噬细胞对其微环境刺激所产生的多种活化状态，展示了该方法的准确性。
该方案的成功依赖于几个关键步骤。首先，任何溶液中的污染物都可能改变光谱结果。例如，在将细胞沉积到靶板上之前，用 PBS 清洗细胞以去除培养基和血清蛋白至关重要。细胞浓度应为 1 × 105 细胞/µl 也是确保结果可重复的重要因素。其次，结晶是本方案中的关键步骤。为获得高质量的结果，必须仔细清洗靶板，并在将样品点样至靶板前预先配制基质溶液。最佳效果是在点样到靶板之前立即加入基质溶液（避免在点样前将样品与基质混合）。样品与基质溶液之间正确的自发混合依赖于均匀的点样。第三，全细胞 MALDI-TOF-MS 是一种高通量技术，可在短时间内产生大量原始数据。因此，生物信息学分析是系统化处理这些数据并在合理时间内完成分析的主要工具。质量评估、背景校正和归一化等步骤可实现自动化。相关峰的筛选（例如 高于特定信噪比）以及基于这些峰的有无对谱图进行比较，需要重要的.......
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披露
作者声明无利益冲突。RO、JLM 和 CC 是一项国际专利 WO 2011/154650 的发明人，该专利名为“Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF”。
致谢
Richard Ouedraogo 获得法国卫生部（PHRC 2010）基金资助。我们感谢 Laurent Gorvel、Christophe Flaudrops 和 Nicolas Amstrong 提供的技术支持。
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参考文献
- Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
- Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
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重印与许可
