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方法文章

完整细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是一种准确且快速分析巨噬细胞不同活化模式的方法

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DOI：

10.3791/50926

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2013年12月26日

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

本文内容

摘要

本方案描述了在真核细胞上应用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的方法。在此，我们通过分析巨噬细胞对其微环境刺激所产生的多种活化状态，展示了该技术的准确性。

摘要

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）是化学和生物化学领域广泛使用的一种质谱技术，也已应用于医学中以鉴定分子和生物标志物。近年来，该技术在微生物学中被用于常规鉴定来自临床样本的细菌，无需样品制备或分级步骤。我们及其他研究者已成功将这种全细胞MALDI-TOF质谱技术应用于真核细胞。目前的应用范围涵盖细胞类型鉴定、细胞培养的质量控制评估以及诊断应用。本文描述了该技术用于研究巨噬细胞在细胞因子或热灭活细菌刺激下不同极化表型的应用。该方法能够识别出代表巨噬细胞蛋白质组反应多样性的特异性指纹图谱。此应用展示了该方法的准确性与简便性。本文所述方案可能有助于研究病理条件下宿主的免疫应答，也可拓展至更广泛的诊断应用。

引言

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）是一种研究生物样品的常用质谱技术。该技术利用激光束和吸能基质实现软电离过程：使大分子生物分子（通常为单电荷）蒸发并生成离子。这一过程称为解吸/电离，由此得名MALDI。随后，这些离子在电压作用下被加速，并进入飞行时间（TOF）分析器，从而实现离子的分离及其相应质量的定量1。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已广泛应用于生物学、化学和医学领域，用于鉴定分子和生物标志物2-4 或监测 蛋白质5,6上的翻译后修饰。近年来，多个研究团队已将MALDI-TOF MS应用于临床样本中微生物的鉴定7,8。这种微生物学应用目前已在临床实践中常规使用。与MALDI-TOF MS的传统应用相比，全细胞MALDI-TOF具有多种优势：含有完整细胞的样本可直接处理，避免了耗时的组分分离或大量物质纯化步骤。此外，无需对各个质谱峰进行表征——整个质谱图被视为样本的“指纹”，通过匹配算法将待测样本的谱图与参考谱图数据库进行比对。

我们及其他研究者已将这种全细胞分析技术应用于真核细胞。该技术可衍生出多种应用：（1）从混合样本中鉴定主要的细胞类型9-11；（2）随时间评估细胞培养物的活力（包括工业质量控制应用）12；（3）监测单一细胞类型的激活状态13；（4）评估临床样本的恶性转化情况14,15。

本文描述了利用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，研究巨噬细胞在细胞因子或热灭活细菌刺激下所呈现的多种极化表型。巨噬细胞在机体抵御微生物病原体的免疫应答中发挥关键作用。它们通过模式识别受体识别组织中的病原微生物，这些受体能够识别微生物中保守的分子模式，例如脂多糖（LPS）16。巨噬细胞是专职的抗原呈递细胞，可与T细胞相互作用，启动适应性免疫应答。T细胞通过释放细胞因子影响巨噬细胞，增强或调控其杀菌活性。类比于Th1/Th2淋巴细胞的极化模式，具有促炎、杀菌和杀瘤活性的巨噬细胞被归类为M1型巨噬细胞，而具有免疫调节功能的巨噬细胞则被归类为M2型巨噬细胞17-19。术语M1指巨噬细胞在I型细胞因子（如干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF））或细菌产物（如LPS）作用下的经典活化途径18,20-23，而通过替代途径（如白细胞介素（IL）-4、IL-10、转化生长因子-β1）激活的巨噬细胞则被视为M2型巨噬细胞19,24,25。巨噬细胞对其微环境具有高度的表型和功能可塑性，这使其成为利用MALDI-TOF MS技术分析细微变化的理想对象。

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方案

在本实验方案中，采用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术获得被视为样品指纹的质谱图。通过生物信息学分析，实现对这些指纹图谱的比较与分类。本方案主要包括以下三个部分：

  1. 生物样本的制备：对照组巨噬细胞及用不同激动剂刺激的巨噬细胞。
  2. 采用全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对每种样本进行技术重复分析。
  3. 原始数据的生物信息学分析。

制备用于细胞分离和培养的无菌溶液。所有试剂均需在 4 °C 下配制和保存

1. 人单核细胞的制备

  1. 准备细胞培养基。向 RPMI 1640 培养基（500 ml）中加入 55 ml 人 AB+ 血清或胎牛血清（FBS）以及 5 ml 抗生素溶液（青霉素浓度为 10,000 UI/ml，链霉素浓度为 10,000 μg/ml；最终浓度分别为青霉素 100 UI/ml 和链霉素 100 μg/ml ）。
    1. 从白细胞浓缩物（leukopacks）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
      1. 准备含有 15 ml Ficoll 的 50 ml 离心管。用生理盐水按体积比 1:10 稀释血液。将 30 ml 稀释后的 PBMCs 小心铺加在 Ficoll 液面上，操作如前文所述26。
      2. 以 700 × g 离心 20 分钟。收集位于 Ficoll（密度为 1.077 g/ml）与稀释血浆之间的界面层中的 PBMCs。用培养基稀释 PBMCs 后，以 300 × g 离心 5 分钟。
    2. 使用包被抗 CD14 抗体的磁珠从 PBMCs 中制备 CD14+ 单核细胞。
      注意：在获得单核细胞前，请将所有试剂和细胞保持在 4 °C。
      1. 配制运行缓冲液，成分为磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2，含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。
      2. 将沉淀的 PBMCs（每检测 107 个细胞）轻柔重悬于 80 μl 运行缓冲液中。
      3. 向 PBMCs 中加入 20 μl CD14 MicroBeads。 混匀后于 4 °C 孵育 15 分钟。 用 5 ml 运行缓冲液洗涤 PBMCs，并以 300 × g 离心 5 分钟。将沉淀的 PBMCs 轻柔重悬于 500 μl 运行缓冲液中（适用于 108 个 PBMCs）。
        注意：当 PBMCs 浓度低于 108 时，使用 500 μl 运行缓冲液。
      4. 进行磁性分离。
        注意：当 PBMCs 数量少于 2 × 108 时使用 MS 柱；当 PBMCs 数量在 2 × 108 至 2 × 109 之间时使用 LS 柱。
      5. 用运行缓冲液冲洗预柱和层析柱（MS 柱使用 500 μl ，LS 柱使用 3 ml ）。 将 PBMCs 加入预柱中（等待未标记细胞流过柱子）。 用运行缓冲液冲洗 3 次（MS 柱每次 500 μl ，LS 柱每次 3 ml ）。 移除预柱。
      6. 将层析柱置于 15 ml 离心管上。 向柱中加入运行缓冲液（MS 柱加 1 ml ，LS 柱加 5 ml），并通过施加压力洗脱 CD14+ 细胞。
      7. 将洗脱液以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。 用 10 ml 培养基洗涤单核细胞沉淀。
        注意：使用抗 CD14 抗体结合流式细胞术分析单核细胞制备物的纯度（通常高于 95%）。
  2. 将单核细胞分化为巨噬细胞。
    1. 将单核细胞（每孔 106 个细胞，接种于 6 孔板）在含 10% 人 AB+ 血清的 3 ml 培养基中于 37 °C 培养。4 天后，将含人血清的培养基更换为含 10% FBS 的 3 ml 培养基，继续培养 3 天。
    2. 通过流式细胞术鉴定所获得的细胞群体为单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）（见 图 1）。
      1. 将培养基更换为 3 ml PBS。用细胞刮刀刮取 MDMs 并收集细胞悬液。以 400 × g 离心 5 分钟。向 MDMs 沉淀中加入含 2% BSA 的 PBS，轻柔振荡重悬细胞。调整细胞浓度至（106 个 MDMs 溶于 200 ml PBS），并在 4 °C 下孵育。
      2. 向 MDM 悬液中加入 10 ml 抗 CD14 抗体和 10 ml 抗 CD68 抗体，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
        注意：这些抗体必须标记两种不同的荧光染料，以便进行流式细胞术分析。例如，抗 CD14 抗体可偶联藻红蛋白（用于单核细胞染色），抗 CD68 抗体可偶联 Alexa Fluor 647（用于巨噬细胞染色）。
      3. 以 400 × g 离心 MDMs 5 分钟，弃去上清液。轻柔重悬细胞沉淀，并将 MDMs 在 250 ml 3% 多聚甲醛（PFA）中于室温孵育 15 分钟。将经 PFA 固定的 MDMs 以 400 × g 离心 5 分钟。用 3 ml PBS 洗涤 MDMs，并再次以 400 × g 离心 5 分钟。将 MDMs 沉淀轻柔重悬于 400 ml PBS 中。
      4. 分析单核细胞（表达 CD14 但不表达 CD68）向巨噬细胞（表达 CD68 但不表达 CD14）的分化情况。注意：通常超过 95% 的细胞为 MDM。
  3. 对 MDMs 进行 18 小时 刺激。
    1. 将贴壁生长的 MDMs 的培养基更换为新鲜的 3 ml 培养基（含 10% FBS）。
    2. 为诱导 M1 或 M2 极化，使用以下人重组细胞因子：IFN-γ 和 TNF 用于诱导 M1 极化，IL-4 用于诱导 M2 极化。M1 巨噬细胞也可通过 LPS 刺激获得。注意：细胞因子储备液保存于 -80 °C，LPS 储备液保存于 -20 °C。
      1. 将 IFN-γ 储备液（1 mg/ml）用培养基按 1:100 稀释，得到 10 ng/ml 的工作液。向 MDMs 中加入 6 μl 该稀释液，使最终 IFN-γ 浓度为 20 ng/ml。
      2. 将 TNF 储备液（1 mg/ml）用培养基按 1:100 稀释，得到 10 ng/ml 的工作液。向 MDMs 中加入 6 μl 该稀释液，使最终 TNF 浓度为 20 ng/ml。
      3. 将 IL-4 储备液（1 mg/ml）用培养基按 1:100 稀释，得到 10 ng/ml 的工作液。向 MDMs 中加入 6 μl 该稀释液，使最终 IL-4 浓度为 20 ng/ml。
      4. 向 MDMs 中加入 3 μl LPS 储备液（1 mg/ml），使最终 LPS 浓度为 1 μg/ml。
    3. 若需用细菌刺激 MDMs，可使用热灭活细菌。将活菌用 PBS 洗涤后，在 95 °C 加热 1 小时。使用 Orientia tsutsugamushi（Kato 菌株（CSUR R163））、Mycobacterium bovis（卡介苗，BCG CIP 671203 菌株）和 Coxiella burnetii（I 相 Nine Mile 菌株），因为这些病原体已知可感染巨噬细胞。因此，配制浓度为 109 个细菌/ml 的 O. tsutsugamushi 悬液，向 MDMs 中加入 50 μl。对 M. bovis 和 C. burnetii 重复相同操作。
  4. 为 MALDI-TOF 质谱分析准备生物样品。
    1. 用不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS 洗涤经刺激的 MDMs（Ca2+ 或 Mg2+ 存在时细胞可能发生聚集）。用细胞刮刀刮取 MDMs 并收集细胞悬液。离心收集 MDMs。再用不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS 以 400 × g 离心 5 分钟，以去除 FBS 污染。
    2. 调整细胞浓度（每检测样本含 2 × 106 个 MDMs）。以 400 × g 离心 MDMs 5 分钟，弃去上清液。将细胞沉淀收集于 20 μl 不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS 中。
    3. 立即进行分析，或在分析前将样品保存于 PBS 中并置于 -80 °C。

2. 通过全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析巨噬细胞

  1. CHCA 基质的制备。
    1. 向一个样品瓶中加入 500 μl 乙腈、250 μl 10% 三氟乙酸和 250 μl 高效液相色谱（HPLC）用水。将 10 mg CHCA 溶解于该溶液中，终浓度为 10 mg/ml。混合后超声处理至少 20 分钟。
      注意：超声处理有助于提高基质的饱和度，但此步骤并非必需。
    2. 在 13,000 x g 条件下离心 5 分钟。弃去沉淀，保留上清液。
      注意：基质溶液应在使用前新鲜配制。 若基质溶液中含有晶体，则会影响样品分子的良好电离，进而影响质谱图的质量。
  2. MALDI 钢靶的制备。
    1. 用热水润湿抛光的钢靶表面，用精密擦拭纸轻轻擦拭。加入 70% 乙醇并擦拭，再用去离子水冲洗并擦拭。再次加入 70% 乙醇，并用精密擦拭纸擦拭。
    2. 将钢靶浸入 70% 乙醇中，超声处理至少 15 分钟。在钢靶表面覆盖 500 μl 至 1 ml 的 80% 三氟乙酸，轻轻擦拭后用精密擦拭纸擦净。用 HPLC 用水冲洗（勿擦拭），然后在室温下自然干燥。
      注意：清洗不充分的钢靶可能会影响质谱图的质量。
  3. 样品点样的制备。
    1. 将清洁的钢靶置于水平支撑面上，以获得均匀的样品沉积。
    2. 将 MDM 样品在冰上轻柔解冻。注意：快速或剧烈解冻可能改变样品状态，从而影响质谱图质量。在点样前通过反复吹打使细胞悬液均匀化，取 1 μl（约含 1 × 105 个细胞）点于 MALDI 钢靶上。随后加入 1 μl MALDI 基质溶液。避免使用移液枪头混合样点，因移液枪头混合会降低质谱图质量。每次实验建议点样 12–16 个样品/检测（技术重复）。
    3. 在室温下自然蒸发。注意：蒸发过程应逐步进行，有助于形成基质/样品共结晶。样品点可立即进行分析，也可在避光条件下保存数天（最长可达 2 周）后再分析。
    4. 用户应确认实验中使用的细胞因子或热灭活细菌在刺激巨噬细胞的质谱检测范围内不会产生干扰峰。本研究中已验证单独的细胞因子和热灭活细菌在检测范围（0–20 kDa）内无任何信号峰。
  4. 质谱仪调谐与数据采集。
    1. 将含有样品的钢靶插入质谱仪中。
    2. 设置质谱仪参数并开始数据采集。可采用默认配置进行自动化数据采集。
    3. 注意：flexControl 软件的具体配置详见附录/表 1。具体设置可能因所用质谱仪及软件版本不同而有所差异。

3. 生物信息学分析

注意：生物信息学分析使用免费开源的统计分析软件 R 及其特定分析库（MALDIquant）完成。R 软件可从其官网 http://cran.r-project.org/ 免费下载。脚本的详细说明作为补充材料提供。

  1. 原始数据的加载与预处理
    1. 将原始数据以多个文件和文件夹的形式存储在与质谱仪相连的计算机上。获取包含所有子文件夹的实验根文件夹，随后将该根文件夹复制到个人计算机以进行分析。
    2. 使用 读取Bruker Flex数据 和 MALDIquant 用于加载和分析原始数据的库。
      注意： 读取Bruker Flex数据 允许将质谱仪的原始数据加载到 R 中的特定对象中，以进行后续分析。参见 MALDIquant 如需更多信息，请参阅说明27.
    3. 分析生成的光谱。
      注意：每个质谱图由一系列峰组成，每个峰包含其相应的质荷比（m/z）和强度（相对丰度）。为增强质谱图的可视化效果，使用强度的平方根进行处理。采用基于统计敏感的非线性峰裁剪算法进行基线估计，以校正背景信号。27. 采用6的信噪比来检测峰。当质荷比（m/z）值位于 2,000 ppm 窗口范围内。
  2. 评分定义与计算。使用层次聚类法对谱图进行分类，采用 Ward 算法进行聚类合并，并基于 Jaccard 距离构建相异度矩阵。
    注：Jaccard 指数用于衡量布尔样本集之间的相似性（即 峰列表的有无
  3. 光谱比较与观察
    1. 分析原始光谱图。注意：x 轴代表 m/z x轴表示质荷比（单位为道尔顿），y轴表示强度（相对丰度）。
    2. 通过层次聚类评估光谱之间的相似性。将相似性（或差异性）以树状图表示。
    3. 通过虚拟凝胶图谱表示法的均值评估可重复性。注：虚拟凝胶图谱表示法是一种改良的热图，其中相对丰度以蓝色强度递增的方式进行颜色编码。

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结果

本实验方案的目的是展示全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在评估巨噬细胞对其微环境响应能力方面的准确性。

图1 描述了从血液样本中制备刺激后巨噬细胞的过程。图2 展示了通过流式细胞术对单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）的分析结果。请注意，单核细胞表达CD14但不表达CD68（图1A）；相反，MDMs表达CD68但不表达CD14（图1B）。

图3 描述了全细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的原理。细胞与基质一同点样于靶板上。在质谱仪内，激光束对样品进行多次照射（共240次），诱导分子的脱附与电离。所产生的离子在磁场作用下被加速，并根据其m/z比值在管中分离。飞行时间（TOF）分析器记录各类离子在管末端的撞击信号。根据飞行时间，每次撞击被转换为相应的m/z比值...

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讨论

本方案描述了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）在真核细胞全细胞分析中的应用。在此，我们通过分析巨噬细胞对其微环境刺激所产生的多种活化状态，展示了该方法的准确性。

该方案的成功依赖于几个关键步骤。首先，任何溶液中的污染物都可能改变光谱结果。例如，在将细胞沉积到靶板上之前，用 PBS 清洗细胞以去除培养基和血清蛋白至关重要。细胞浓度应为 1 × 105 细胞/µl 也是确保结果可重复的重要因素。其次，结晶是本方案中的关键步骤。为获得高质量的结果，必须仔细清洗靶板，并在将样品点样至靶板前预先配制基质溶液。最佳效果是在点样到靶板之前立即加入基质溶液（避免在点样前将样品与基质混合）。样品与基质溶液之间正确的自发混合依赖于均匀的点样。第三，全细胞 MALDI-TOF-MS 是一种高通量技术，可在短时间内产生大量原始数据。因此，生物信息学分析是系统化处理这些数据并在合理时间内完成分析的主要工具。质量评估、背景校正和归一化等步骤可实现自动化。相关峰的筛选（例如 高于特定信噪比）以及基于这些峰的有无对谱图进行比较，需要重要的...

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披露

作者声明无利益冲突。RO、JLM 和 CC 是一项国际专利 WO 2011/154650 的发明人，该专利名为“Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF”。

致谢

Richard Ouedraogo 获得法国卫生部（PHRC 2010）基金资助。我们感谢 Laurent Gorvel、Christophe Flaudrops 和 Nicolas Amstrong 提供的技术支持。

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