细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。
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方法文章
成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由于视网膜感光细胞丧失导致的视力障碍和失明 即 光感受器退化是工业化国家致残的主要原因。通过细胞移植替代退化的光感受器，可能是未来临床应用中的一种治疗选择。事实上，近期的临床前研究表明，从出生后第4天小鼠视网膜中分离出的未成熟光感受器，在经视网膜下移植后具有整合入成年小鼠视网膜的潜力。供体细胞可发育出成熟的光感受器形态，包括内节和外节结构、位于外核层的圆形胞体，以及与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末。近期多项报告进一步证实，供体光感受器能够功能性地整合入宿主小鼠的神经环路中。为了实现此类细胞替代疗法在未来的临床应用，必须制备出高纯度的目标细胞悬液，并将其准确植入眼部的适当位置，以实现有效整合。为富集光感受器前体细胞，应基于特定的细胞表面抗原进行分选，以避免对供体细胞进行遗传报告基因修饰。本文展示了利用磁珠相关细胞分选技术（MACS），基于细胞表面标志物CD73，对来自光感受器特异性报告基因小鼠的新生视网膜中可移植的视杆光感受器前体细胞进行富集。通过抗CD73抗体孵育，随后加入偶联微珠的二抗，可利用MACS将视杆光感受器前体细胞富集至约90%。与流式细胞术相比，MACS的优势在于更易于符合GMP标准，且可在相对较短时间内分选大量细胞。将富集后的细胞悬液注射至成年野生型小鼠的视网膜下腔，其细胞整合率较未分选细胞悬液提高了3倍。
引言
视觉是人类最重要的感官之一。视觉功能受损和失明是工业化国家致残的主要原因之一。导致视力障碍或失明的主要原因是视网膜变性，其特征是感光细胞的丧失，如在黄斑变性、视网膜色素变性、锥-杆细胞营养不良及其他疾病中所观察到的那样。迄今为止，尚无有效疗法能够恢复已丧失的视力。2006年和2008年，两个不同的实验室分别独立报道了将视杆感光前体细胞成功移植到成年野生型小鼠视网膜中的研究结果1,2。这使得将感光前体细胞移植到已变性的视网膜中以替代退化的感光细胞并恢复视力成为可能。事实上，最近的研究已证明，这些移植的感光前体细胞表现出成熟野生型感光细胞的形态学特征，例如发育良好的外节段3、与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末，以及位于外核层的圆形细胞体2-4，同时还具备整合入宿主神经环路并发挥功能的能力5-7。 该策略的主要原则之一是使用出生后第4天（PN 4，PN0定义为出生日）的小鼠视网膜，从而获得用于移植的多种细胞类型的混合物。基于未来治疗应用的背景 ，这种混合物必须进一步纯化以获得感光前体细胞。CD73已被描述为视网膜中幼年感光细胞特异性的首个细胞表面标志物8-10。本文中，我们展示了一种基于该细胞表面标志物并结合磁珠偶联细胞分选（MACS）技术的感光前体细胞纯化方法。相较于荧光激活细胞分选技术，MACS可能具有分选速度快以及更易于满足GMP条件的优势。我们证明，在将纯化后的细胞群移植至成年野生型视网膜的视网膜下腔时，可实现约90%的富集度，并使整合率提高....
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方案
动物使用与护理的伦理声明：
所有动物实验均严格遵循欧盟和德国法律（Tierschutzgesetz）以及ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。所有动物实验均获得德累斯顿工业大学动物伦理委员会和德累斯顿地方管理局的批准（批准编号：24D-9168.11-1/2008-33）。
1. 细胞解离与细胞分选前的准备
- 标记三个15 ml离心管，分别标注为：洗涤组（W）、阳性组（+）和阴性组（-）。
2. 视网膜解离
- 使用剪刀将出生4天的小鼠幼崽断头。
- 将幼崽头部在70%乙醇中短暂冲洗，随后用PBS洗涤。
- 将头部转移至冷HBSS中并摘除眼球（对所有头部重复此步骤）。摘除时打开眼睑，用弯头镊子夹住视神经区域固定眼球，然后小心地将眼球从眼眶中拉出。
- 在所有眼球摘除后，分离视网膜：将闭合的剪刀插入视神经处，然后打开剪刀刀片。剥离视网膜色素上皮（RPE）/脉络膜组织。使用弯头镊子去除晶状体和血管。
- 将分离出的视网膜转移至含有木瓜蛋白酶溶液（来自木瓜蛋白酶解离试剂盒）的1.5 ml离心管中。
- 将视网膜在37 °C水浴或摇床（400 rpm）中孵育30–60分钟。
- 在视网膜孵育于木瓜蛋白酶溶液期间，....
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结果
为了评估视杆光感受器整合到小鼠视网膜中的能力，使用了一种小鼠报告基因品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）由神经视网膜亮氨酸拉链蛋白（Nrl, Nrl-GFP）启动子驱动11。Nrl 是视杆光感受器最早期的标志物，从胚胎12.5天（E12.5）开始表达，并持续至成年期，因此可实现对供体视杆光感受器细胞的特异性标记。
取出生4天的Nrl-GFP幼鼠，断头处死并摘除眼球。随后按照上述方法分离并解离视网膜组织。将所得的单细胞悬液利用基于CD73的磁珠分选法（MACS）进行分选（图1 和 图2）。完成MACS分选后，我们分析了该步骤所达到的细胞富集效果。
如图所示 图3A初始细胞悬液（Input）中含有30.4%的GFP阳性细胞， 即. 视杆光感受器。通过基于CD73的磁珠分选后，流式细胞术检测显示CD73阳性组分（CD73+）中富集率最高达86.9%。在CD73阴性组分（CD73-）中，仅有9.9%.......
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讨论
光感受器前体细胞的视网膜下移植是一种可靠的方法，可实现大量这类光敏细胞整合到宿主视网膜中1,2这可能为未来视网膜变性疾病的细胞治疗奠定基础6. 目前从出生后第4天（PN 4）视网膜分离的供体细胞群体为多种细胞类型的混合物，其中仅有光感受器前体细胞在经脉络膜下注射后能够整合入视网膜。通过基于CD73的MACS分选技术，可提高供体细胞悬液中光感受器细胞的比例至 ≈ 90%，与未分选细胞群体相比，可在野生型宿主视网膜中实现约3倍更高的整合效率8与流式细胞术相比，MACS 的优势在于分选过程快速，且相对容易符合 GMP 标准。鉴于近期在可移植感光细胞纯化方面的进展，这一技术尤其值得关注 体外 由多能干细胞生成感光细胞12-14分化后的多能干细胞培养物包含多种细胞类型，因此特定分选步骤的建立是其未来应用于细胞移植治疗的必要前提。
根据MACS纯化操作流程，有几个要点需要注意，以确保整个流程顺利进行而无重大干扰。待分选的视网膜数量越多，其消化所需时间越长。消化完成后，在分选过程中必须避免细胞发生聚集，这种情况尤其容易在加入二抗之前以及二抗孵育期.......
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披露
作者声明 不存在相互竞争的经济利益。
致谢
我们感谢 Anand Swaroop 提供 Nrl-GFP 小鼠，感谢 Jochen Haas 提供技术支持，感谢 Sindy Böhme 和 Emely Lessmann 在动物饲养方面的工作。
本工作由德国研究基金会（DFG）：FZT 111 - 德累斯顿再生疗法中心、CRTD 种子基金项目、SFB 655 项目、ProRetina e.V. 基金会、德累斯顿 DIGS-BB 研究生项目以及葡萄牙科技基金会（SFRH/BD/60787/2009）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 木瓜蛋白酶解离系统 | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | 方法中未使用所提供的DNase I |
| 纯化大鼠抗小鼠CD73，克隆株TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | 储存浓度为0.5 mg/ml |
| 羊抗大鼠IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | 总体积为2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | 用于计数细胞总数 |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | 用于视网膜组织的解离 |
| 台盼蓝 | Sigma | Fluka93595 | 用于计数细胞总数 |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| 氯胺酮10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| 去氧肾上腺素2.5%-托吡卡胺0.5% | 德累斯顿大学医院药房 | ||
| 预分离滤器 | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS分离器 | Miltenyi | 130-090-976 | |
| 火焰抛光玻璃巴斯德吸管 | Brand | 74777 20 | 吸管’s尖端需进行火焰抛光并高压灭菌。 |
| MACS 15 ml试管架 | Miltenyi | 130-091-052 | |
| 细胞计数板 | Carl Roth | T728.1 | |
| 无菌15 ml离心管 | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | 可替代Olympus SZX10使用 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | 可替代Leica M651 MSD使用 |
| Olympus倒置体视显微镜CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Thermo Scientific MSC-Advance细胞培养罩 | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml反应管 | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml反应管 | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf离心机5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| 小鼠头部固定器 | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton微量注射器 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | 不带针头提供 |
| Hamilton RN特制针头 34 G | Hamilton | 065-207434 | 钝头，长度12 mm |
| Vannas-Tübingen弹簧剪 - 5 mm直刃 | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7镊子 - 钛合金生物镊 | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| 金刚石笔 | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm盖玻片 | Sparks | MIC3366 |
参考文献
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al.
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重印与许可
