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方法文章

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

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DOI：

10.3791/50932

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2014年2月22日

 ,  ,  , 
1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。

摘要

由于视网膜感光细胞丧失导致的视力障碍和失明 即 光感受器退化是工业化国家致残的主要原因。通过细胞移植替代退化的光感受器，可能是未来临床应用中的一种治疗选择。事实上，近期的临床前研究表明，从出生后第4天小鼠视网膜中分离出的未成熟光感受器，在经视网膜下移植后具有整合入成年小鼠视网膜的潜力。供体细胞可发育出成熟的光感受器形态，包括内节和外节结构、位于外核层的圆形胞体，以及与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末。近期多项报告进一步证实，供体光感受器能够功能性地整合入宿主小鼠的神经环路中。为了实现此类细胞替代疗法在未来的临床应用，必须制备出高纯度的目标细胞悬液，并将其准确植入眼部的适当位置，以实现有效整合。为富集光感受器前体细胞，应基于特定的细胞表面抗原进行分选，以避免对供体细胞进行遗传报告基因修饰。本文展示了利用磁珠相关细胞分选技术（MACS），基于细胞表面标志物CD73，对来自光感受器特异性报告基因小鼠的新生视网膜中可移植的视杆光感受器前体细胞进行富集。通过抗CD73抗体孵育，随后加入偶联微珠的二抗，可利用MACS将视杆光感受器前体细胞富集至约90%。与流式细胞术相比，MACS的优势在于更易于符合GMP标准，且可在相对较短时间内分选大量细胞。将富集后的细胞悬液注射至成年野生型小鼠的视网膜下腔，其细胞整合率较未分选细胞悬液提高了3倍。

引言

视觉是人类最重要的感官之一。视觉功能受损和失明是工业化国家致残的主要原因之一。导致视力障碍或失明的主要原因是视网膜变性，其特征是感光细胞的丧失，如在黄斑变性、视网膜色素变性、锥-杆细胞营养不良及其他疾病中所观察到的那样。迄今为止，尚无有效疗法能够恢复已丧失的视力。2006年和2008年，两个不同的实验室分别独立报道了将视杆感光前体细胞成功移植到成年野生型小鼠视网膜中的研究结果1,2。这使得将感光前体细胞移植到已变性的视网膜中以替代退化的感光细胞并恢复视力成为可能。事实上，最近的研究已证明，这些移植的感光前体细胞表现出成熟野生型感光细胞的形态学特征，例如发育良好的外节段3、与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末，以及位于外核层的圆形细胞体2-4，同时还具备整合入宿主神经环路并发挥功能的能力5-7。 该策略的主要原则之一是使用出生后第4天（PN 4，PN0定义为出生日）的小鼠视网膜，从而获得用于移植的多种细胞类型的混合物。基于未来治疗应用的背景 ，这种混合物必须进一步纯化以获得感光前体细胞。CD73已被描述为视网膜中幼年感光细胞特异性的首个细胞表面标志物8-10。本文中，我们展示了一种基于该细胞表面标志物并结合磁珠偶联细胞分选（MACS）技术的感光前体细胞纯化方法。相较于荧光激活细胞分选技术，MACS可能具有分选速度快以及更易于满足GMP条件的优势。我们证明，在将纯化后的细胞群移植至成年野生型视网膜的视网膜下腔时，可实现约90%的富集度，并使整合率提高达3倍。因此，基于MACS的感光前体细胞富集与视网膜下腔移植，是开发针对视网膜变性疾病的再生治疗策略中可靠且具有前景的技术。

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方案

动物使用与护理的伦理声明：

所有动物实验均严格遵循欧盟和德国法律（Tierschutzgesetz）以及ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。所有动物实验均获得德累斯顿工业大学动物伦理委员会和德累斯顿地方管理局的批准（批准编号：24D-9168.11-1/2008-33）。

1. 细胞解离与细胞分选前的准备

  1. 标记三个15 ml离心管，分别标注为：洗涤组（W）、阳性组（+）和阴性组（-）。

2. 视网膜解离

  1. 使用剪刀将出生4天的小鼠幼崽断头。
  2. 将幼崽头部在70%乙醇中短暂冲洗，随后用PBS洗涤。
  3. 将头部转移至冷HBSS中并摘除眼球（对所有头部重复此步骤）。摘除时打开眼睑，用弯头镊子夹住视神经区域固定眼球，然后小心地将眼球从眼眶中拉出。
  4. 在所有眼球摘除后，分离视网膜：将闭合的剪刀插入视神经处，然后打开剪刀刀片。剥离视网膜色素上皮（RPE）/脉络膜组织。使用弯头镊子去除晶状体和血管。
  5. 将分离出的视网膜转移至含有木瓜蛋白酶溶液（来自木瓜蛋白酶解离试剂盒）的1.5 ml离心管中。
  6. 将视网膜在37 °C水浴或摇床（400 rpm）中孵育30–60分钟。
    1. 在视网膜孵育于木瓜蛋白酶溶液期间，用移液器将1 ml卵黏蛋白溶液加入15 ml离心管中（标记为“1”）。
    2. 向另一15 ml离心管中加入60 µl DNase I（10 mg/ml）+ 60 µl 卵黏蛋白溶液（来自试剂盒）+ 520 µl EBSS（标记为“2”）。
  7. 木瓜蛋白酶孵育结束后，将含有部分消化视网膜的木瓜蛋白酶溶液转移至离心管“2”中。
  8. 使用火焰抛光的移液管进行机械解离（上下吹打10次）。
  9. 将单细胞悬液转移至离心管“1”中。通过轻轻将细胞悬液叠加在卵黏蛋白溶液上方，尽量形成两层液体。
  10. 以 300 x g（约 1,300 rpm）离心5分钟。
  11. 弃去上清液，将细胞重悬于500 µl MACS缓冲液中。

3. 使用磁性相关细胞分选（MACS）进行细胞分选

  1. 加入 X μl 大鼠抗 CD73 抗体至 500 µl 样品中，以达到终浓度为 10 μg/ml。
  2. 冰上孵育 5 分钟。
  3. 用 MACS 缓冲液将 15 ml 反应管补至 10 ml，以 300 × g 的速度离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液。
  5. 将沉淀重悬于 480 μl MACS 缓冲液中，并加入 120 μl 羊抗大鼠 IgG 磁珠。
  6. 冰上孵育 15 分钟；期间不得振荡、摇动或混合。
  7. 用 MACS 缓冲液将 15 ml 反应管补至 5 ml，以 300 × g 离心 5 分钟。
  8. 在反应管离心过程中：
    1. 将 LS 柱安装至磁力架上。
    2. 将预分离滤器置于 LS 柱顶部。
    3. 用 3 ml MACS 缓冲液润洗预分离滤器和 LS 柱，并将流出的 MACS 缓冲液收集至洗涤（W）管中。
  9. 弃去上清液。
  10. 将沉淀重悬于 500 μl MACS 缓冲液中。
  11. 将 500 μl 细胞悬液上样至滤器，随后向滤器中加入 1 ml MACS 缓冲液，并将未结合的细胞（阴性组分）收集至阴性组分（-）反应管中。
  12. 接着，向柱中分三次加入共 3 × 3 ml MACS 缓冲液，以洗去未结合在柱上的细胞。
  13. 当这 9 ml 洗液完全通过 LS 柱后，将柱从磁力架上取下，并安装至阳性组分（+）反应管上方。
  14. 迅速向 LS 柱中加入 5 ml MACS 缓冲液，并将推杆插入 LS 柱中，向下推动直至全部缓冲液通过柱体。
  15. 将含有阳性组分的反应管以 300 × g 离心 5 分钟。
  16. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µl MACS 缓冲液中，并置于 4 °C 保存。
  17. 使用常规细胞计数设备对细胞总数进行计数。
  18. 用 MACS 缓冲液制备阳性分选组分的细胞悬液，浓度为 2 × 105 个细胞/μl，并置于 4 °C 保存。

4. 将经MAC分选的光感受器前体细胞移植到小鼠视网膜中

  1. 确保准备好以下所有溶液：1 ml 无菌 PBS 或 HBSS，10 µl DNA酶I，1–2 ml 无菌去离子 H2O，以及在 4 °C 下保存的细胞悬液分装样品。
  2. 通过腹腔注射盐酸美托咪啶（0.01 mg/10 g 体重）和氯胺酮（0.75 mg/10 g 体重）对成年小鼠（i.e. 2–4 月龄）进行麻醉。随后皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重）以缓解疼痛。
  3. 滴加一滴去氧肾上腺素 2.5%-托吡卡胺 0.5% 溶液以扩大瞳孔。
  4. 将小鼠固定在小鼠头部固定装置上，并置于体视显微镜下。
  5. 滴加一滴维西迪克凝胶以防止眼球干燥。
  6. 使用无菌 30 G ½ 英寸 针头在巩膜与角膜交界处（即锯齿缘 ora serrata）刺一个小孔。
  7. 使用金刚石笔将普通盖玻片切割成小块（约 5 mm × 5 mm），取其中一块置于角膜上，以便直接观察视网膜。
  8. 用去离子水反复冲洗预灭菌的微量注射器数次。
  9. 用微量注射器吸取 1 µl 细胞悬液，将针头沿结膜和巩膜切线方向穿入，并在视觉控制下将其置于视网膜鼻侧半部。
  10. 轻柔地在视网膜上穿孔，直至进入视网膜下腔，将细胞悬液注入视网膜下腔。
  11. 观察视网膜出现的水泡样脱离，应均匀分布，覆盖约 ¼ 的视网膜区域，且无出血现象。
  12. 缓慢撤出注射器，视网膜上的小孔会自动闭合。
  13. 用去离子水反复冲洗微量注射器数次。
  14. 将小鼠从头部固定装置中取出。
  15. 注射盐酸阿替帕唑以逆转盐酸美托咪啶的作用，使小鼠苏醒。
  16. 将小鼠置于温暖的暗室（约 25 °C）中直至完全恢复意识。
  17. 移植后接下来的 2 天内，应于上午和下午分别皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重）以缓解疼痛。

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结果

为了评估视杆光感受器整合到小鼠视网膜中的能力，使用了一种小鼠报告基因品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）由神经视网膜亮氨酸拉链蛋白（Nrl, Nrl-GFP）启动子驱动11。Nrl 是视杆光感受器最早期的标志物，从胚胎12.5天（E12.5）开始表达，并持续至成年期，因此可实现对供体视杆光感受器细胞的特异性标记。

取出生4天的Nrl-GFP幼鼠，断头处死并摘除眼球。随后按照上述方法分离并解离视网膜组织。将所得的单细胞悬液利用基于CD73的磁珠分选法（MACS）进行分选（图1 和 图2）。完成MACS分选后，我们分析了该步骤所达到的细胞富集效果。

如图所示 图3A初始细胞悬液（Input）中含有30.4%的GFP阳性细胞， 即. 视杆光感受器。通过基于CD73的磁珠分选后，流式细胞术检测显示CD73阳性组分（CD73+）中富集率最高达86.9%。在CD73阴性组分（CD73-）中，仅有9.9%...

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讨论

光感受器前体细胞的视网膜下移植是一种可靠的方法，可实现大量这类光敏细胞整合到宿主视网膜中1,2这可能为未来视网膜变性疾病的细胞治疗奠定基础6. 目前从出生后第4天（PN 4）视网膜分离的供体细胞群体为多种细胞类型的混合物，其中仅有光感受器前体细胞在经脉络膜下注射后能够整合入视网膜。通过基于CD73的MACS分选技术，可提高供体细胞悬液中光感受器细胞的比例至 ≈ 90%，与未分选细胞群体相比，可在野生型宿主视网膜中实现约3倍更高的整合效率8与流式细胞术相比，MACS 的优势在于分选过程快速，且相对容易符合 GMP 标准。鉴于近期在可移植感光细胞纯化方面的进展，这一技术尤其值得关注 体外 由多能干细胞生成感光细胞12-14分化后的多能干细胞培养物包含多种细胞类型，因此特定分选步骤的建立是其未来应用于细胞移植治疗的必要前提。

根据MACS纯化操作流程，有几个要点需要注意，以确保整个流程顺利进行而无重大干扰。待分选的视网膜数量越多，其消化所需时间越长。消化完成后，在分选过程中必须避免细胞发生聚集，这种情况尤其容易在加入二抗之前以及二抗孵育期...

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披露

作者声明 不存在相互竞争的经济利益。

致谢

我们感谢 Anand Swaroop 提供 Nrl-GFP 小鼠，感谢 Jochen Haas 提供技术支持，感谢 Sindy Böhme 和 Emely Lessmann 在动物饲养方面的工作。

本工作由德国研究基金会（DFG）：FZT 111 - 德累斯顿再生疗法中心、CRTD 种子基金项目、SFB 655 项目、ProRetina e.V. 基金会、德累斯顿 DIGS-BB 研究生项目以及葡萄牙科技基金会（SFRH/BD/60787/2009）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
木瓜蛋白酶解离系统Worthington Biochemical CorporationLK003150方法中未使用所提供的DNase I
纯化大鼠抗小鼠CD73，克隆株TY/23BD Pharmingen550738储存浓度为0.5 mg/ml
羊抗大鼠IgG MicroBeadsMiltenyi130-048-501总体积为2 ml
PBSGibco10010-015用于计数细胞总数
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050用于视网膜组织的解离
台盼蓝SigmaFluka93595用于计数细胞总数
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
氯胺酮10%Ratiopharm7538843
AntisedanPfizer76590
去氧肾上腺素2.5%-托吡卡胺0.5%德累斯顿大学医院药房
预分离滤器Miltenyi130-041-407
LS柱Miltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
QuadroMACS分离器Miltenyi130-090-976
火焰抛光玻璃巴斯德吸管Brand74777 20吸管’s尖端需进行火焰抛光并高压灭菌。
MACS 15 ml试管架Miltenyi130-091-052
细胞计数板Carl RothT728.1
无菌15 ml离心管Greiner Bio-One188271
Leica M651 MSDLeicaM651 MSD可替代Olympus SZX10使用
Olympus SZX10OlympusSZX10可替代Leica M651 MSD使用
Olympus倒置体视显微镜CKX41OlympusCKX41
Thermo Scientific MSC-Advance细胞培养罩Thermo Scientific51025411
1.5 ml反应管Sarstedt727706400
2 ml反应管Sarstedt72695
Eppendorf离心机5702VWR (Eppendorf)521-0733
小鼠头部固定器myNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
Hamilton微量注射器 5 µl, 75RNHamilton065-7634-01不带针头提供
Hamilton RN特制针头 34 GHamilton065-207434钝头，长度12 mm
Vannas-Tübingen弹簧剪 - 5 mm直刃Fine Science Tools15003-08
Dumont #7镊子 - 钛合金生物镊Fine Science Tools11272-40
金刚石笔Tools-tech
15 mm x 15 mm盖玻片SparksMIC3366

参考文献

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  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

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