一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

摘要

在标准培养方法中，细胞被从其生理环境中取出，并在培养皿的塑料表面进行生长。为了研究原代人骨髓细胞的行为，我们建立了一种三维培养系统，使细胞在能够模拟组织天然微环境的条件下生长。

摘要

组织培养是研究细胞功能诸多方面的宝贵工具，从正常发育到疾病机制均可涵盖。传统的细胞培养方法依赖于细胞在组织培养皿的固体基质上贴壁生长，或在液体培养基中悬浮生长。尽管已利用这些方法建立并培养了多种永生化细胞系，但当需要在体外（ex vivo）培养原代细胞时，这些方法常常失败。这种失败被认为源于标准培养系统中缺乏组织微环境所必需的适当细胞外基质成分，而常规系统通常使用组织培养级塑料作为细胞生长的表面。细胞外基质是组织微环境的重要组成部分，其存在对于维持细胞极性、存活和增殖等生理功能至关重要。本文介绍一种三维组织培养方法，即在模拟人类骨组织微环境的细胞外基质中培养原代骨髓细胞（rBM系统）。细胞被包埋于细胞外基质中，并通过添加人血浆的培养基获得营养，从而构建了一个综合性的培养体系，可在维持原代组织细胞组成的同时，支持细胞存活和增殖长达30天。利用rBM系统，我们已成功培养了来自正常供者以及淀粉样变性患者和多种血液系统恶性肿瘤患者的原代骨髓细胞。rBM系统支持在基质内直接、实时观察细胞行为，并可用于评估新型治疗药物的临床前疗效。此外，细胞可从rBM系统中分离出来，用于后续的体内（in vivo）移植、细胞分选、流式细胞术以及核酸和蛋白质分析。综上所述，rBM方法为在生理条件下培养原代骨髓细胞提供了一个可靠的系统。

引言

组织培养技术的发展旨在通过可控环境研究细胞行为，以减少在完整生物体中比较各种过程时的系统性差异。该方法最早建立于20世纪初^1,2，指将组织外植体在玻璃培养皿中进行离体（ex vivo）培养的技术。20世纪中期，该系统被改进为培养分散的单个细胞而非完整的组织碎片，因此“组织培养”与“细胞培养”这两个术语逐渐成为同义词³。在传统的细胞培养系统中，细胞生长于组织培养级塑料表面，并覆盖含有多种生长因子的培养基。根据细胞的贴壁能力，形成了两种类型的培养方式：贴壁细胞培养，即细胞附着并铺展在组织培养级塑料表面；以及非贴壁培养，即细胞在悬浮状态下增殖。自细胞培养技术发展初期以来，已建立了多种永生化细胞系，例如HeLa⁴，这是第一个人类癌细胞系。这些细胞系能够在体外持续无限增殖，且大多数无需特殊处理即可维持其活性。

最初的细胞培养方法采用还原论策略，旨在通过仅包含维持细胞存活和增殖所必需的最基本组分，尽可能简化系统。然而，这种简化的细胞培养方法无法支持大多数具有有限寿命的原代人类细胞在体外（ex vivo）的生长。因此，目前正设计新的培养系统，以尽可能接近地模拟组织微环境，从而使细胞外植体能够在生理条件下生长。与传统的/还原论的细胞培养方法相比，三维（3-D）培养系统现已成为一种优选方法，可在支持性微环境背景下高效培养多种人类细胞系和原代细胞，进而研究健康与疾病相关的机制。这类3-D系统通常....

方案

1. 预先准备

1. 将无菌刻度移液管和移液器吸头保存在 4 °C。
   问题排查： Matrigel 在室温（RT）下会凝固；使用预冷的移液管和吸头可防止 Matrigel 在培养建立过程中提前凝固。
2. 在 4 °C 下过夜解冻一瓶 Matrigel。

2. 试剂的准备

1. 纤连蛋白储备液的制备：将100 mg人纤连蛋白溶于100 ml蒸馏水中，配制成1 mg/ml的储备液。待纤连蛋白完全溶解后，经无菌过滤，分装，4 °C保存，可稳定存放长达6个月。
   问题排查： 如果纤连蛋白未能迅速溶解，将溶液置于37 °C水浴中孵育几分钟。
2. 10倍稀释液的制备 PBS：溶解 80 g 氯化钠 NaCl、14.4 g Na₂HPO₄，2 g KCl 和 2.4 g KH₂PO₄ 在1 L蒸馏水中溶解。调节pH至7.4，经无菌滤器过滤后，4 °C保存，可保存长达6个月。
3. 中和缓冲液的制备²⁰：配制含有100 mM HEPES的2x溶液 磷酸盐缓冲液（PBS），使用 1 M HEPES 和 10x PBS 储存液。将溶液的 pH 值调节至 7.0。于 4 °....

结果

由于原代骨髓细胞在标准组织培养条件下无法增殖，因此建立了rBM系统以高度模拟骨髓微环境，提供一种用于培养和扩增骨髓细胞的体系 离体骨髓细胞外基质的主要成分，包括纤连蛋白、I型胶原、IV型胶原和层粘连蛋白²¹，被加入到rBM基质中，为该三维培养体系提供结构支架。通过在组织培养皿表面包被I型胶原和纤连蛋白，重建了富含这些成分的骨内膜——即骨组织与骨髓（BM）之间的界面。骨髓内多个细胞区室间的相互作用共同维持组织的整体稳态。为确保不遗漏任何细胞组分，本研究采用人骨髓穿刺活检标本中的非分选单个核细胞建立rBM培养体系。为保证体系中含有循环环境中存在的激素、生长因子和细胞因子，培养基中添加了与所培养标本对应的新人血浆。即 将正常供者的血浆加入非恶性骨髓细胞的重组骨髓（rBM）培养体系中，而将患者血浆加入恶性细胞的培养体系中。 （图1）.

在获得普渡大学和阿尔伯塔大学机构研究委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》取得书面知情同意后，采集了健康供体及各类血液系统恶性肿瘤患者的骨髓和血液样本 （.......

讨论

rBM 模型提供了一个综合系统，可维持骨髓的细胞组成 离体 长达30天。在rBM中培养的骨髓细胞会根据其功能自发分层，紧密模拟体内骨髓的结构特征 体内此外，这是首个能够扩增多发性骨髓瘤克隆的系统⁸确保骨髓细胞稳健生长及培养整体成功最关键的步骤是：1）获得健康的骨髓细胞群体， >70% 的存活率且基本不含红细胞，2）确保基质成分充分混匀，并使细胞在基质中均匀分布，3）在向体系中添加生长培养基时需小心操作，避免破坏基质。为确保恶性细胞的稳健增殖，生长培养基中应补充与所培养细胞患者诊断相匹配的人源血浆。观察到rBM体系的一个局限性是，在缺乏骨髓基质组分的情况下，无法支持纯化的CD34+造血干细胞、CD20+ B细胞以及CD138+浆细胞的生长。

rBM 系统具有高度的多功能性，可根据特定研究的目标进行多种修改。可向该系统中添加血管内皮组分以模拟骨髓的血管化，还可添加额外的细胞外基质成分，使基质组成尽可能接近天然状态 体内 可根据疾病状态调整基质膜（BM）和基质成分的浓度，以反映不同基质组分浓度可能发生改变.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CellTrace CFSE 增殖检测试剂盒 - 用于流式细胞术	Invitrogen/Life Technologies	C34554
人血浆来源纤连蛋白	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel 基底膜基质	BD Biosciences	354234
大鼠尾胶原 I 型	BD Biosciences	354249	使用本方案时，Millipore 来源的胶原 I 型无法正常聚合
VECTASHIELD 荧光封片介质（常规套装）	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/萘酚 AS-MX 片剂	Sigma-Aldrich	F4648	用于 TRAP 染色
SigmaFast BCIP/NBT 片剂	Sigma-Aldrich	B5655	用于碱性磷酸酶染色
Zeiss 共聚焦 LSM 510 显微镜	Carl Zeiss
Zeiss 510 软件	Carl Zeiss		共聚焦图像分析软件
Zeiss Axiovert 200M 倒置显微镜	Carl Zeiss
MetaMorph 软件	Molecular Devices		Axiovert 200M 图像分析软件
FACSort 流式细胞仪	BD Biosciences
CellQuest Pro 软件	BD Biosciences		流式细胞术数据分析软件