用于蛋白质印迹中实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照的 V3 免染工作流程

摘要

V3 工作流程是一种使用免染胶进行的蛋白质印迹实验。免染技术可使研究人员直观评估蛋白质分离质量，验证转膜效率，更重要的是，可通过总蛋白定量作为可靠的上样对照，来验证目的蛋白的变化。

摘要

Western blot 是一种非常有用且被广泛采用的实验室技术，但其操作具有挑战性。该实验流程通常被描述为一个 "黑箱" 因为实验者在完成多个步骤之前，无法确定实验是否成功。此外，由于缺乏贯穿整个Western印迹过程的有效质量控制工具，Western印迹数据的质量有时会受到质疑。本文介绍了V3 Western工作流程，该流程应用免染色技术，以解决传统Western印迹实验方案中的主要问题。该工作流程使研究人员能够：1）在约20–30分钟内完成凝胶电泳；2）在电泳结束后5分钟内观察样品分离的质量；3）在3–10分钟内完成蛋白质转膜；4）定量验证转膜效率；最重要的是，5）利用总蛋白上样量对照来验证目标蛋白表达水平的变化。这一新方法无需对内参蛋白（如β-actin、β-tubulin、GAPDH）进行膜剥离和重新杂交。 等等。 V3 免染工作流程使 Western 印迹过程更快速、透明且更具定量性 且可靠。

引言

Western blot 是一种非常有用的技术⁹，但该技术存在两个主要挑战：过程耗时且劳动强度大，以及数据质量的控制问题。传统实验流程大约需要两天时间，涉及多个步骤，包括样品制备、凝胶制备、蛋白质电泳与转膜、膜的封闭、抗体孵育、成像，以及经常需要进行的 stripping、重新探针杂交，最后是数据分析。在整个过程中，缺乏可靠且灵活的过程控制工具。因此，每个步骤都可能引入误差，而这些误差有可能导致数据假象的产生；因此，上样对照在 Western blot 实验中至关重要，用于识别并校正这些误差。上样对照通常是通过检测每个样品中参考蛋白的蛋白水平，以确认其是否均等表达。人们常使用看家蛋白，如 β-actin、β-tubulin、GAPDH，作为上样对照。

Western blot 数据的质量依赖于可靠的上样对照。但在使用看家蛋白作为上样对照时存在两个合理关切：1）针对看家蛋白条带的抗体免疫检测信号常出现饱和，因而无法区分样品之间的上样量差异³⁰；2）在某些实验条件下，如siRNA处理、细胞死亡、细胞分化等，样本中的持家蛋白表达水平可能发生变化， 等等。^{11,28,3,6,10,21}由于这些担忧，科学期刊现在要求 "为了进行定量比较，应使用适当的试剂、对照以及具有线性信号范围的成像方法" （《自然》指南）。同样，《临床研究杂志》的编辑们也要求使用更可靠的上样对照²⁴因此，需要对管家蛋白进行验证，以确认其可作为上样对照。首先，必须确保其检测值处于免疫检测方法的线性动态范围之内。^14,29其次，必须确保其在所有样本中的表达具有一致性。^{26,31,25,19,20}.

一种替代可靠的上样对照方法是利用印迹膜上的总蛋白测量。一些研究人员已使用总蛋白染色剂（如考马斯亮蓝、Flamingo Pink、Sypro Ruby、氨基黑、Ponceau S 以及无染料技术）对印迹膜进行染色，以测定每条泳道中的总蛋白信号作为上样对照^{16,20,13,27,1,4,12}。总蛋白上样对照可避免管家蛋白相关的问题。首先，它能真实反映每个样本所上样的蛋白量；其次，总蛋白染色在蛋白质印迹分析常用的上样范围（10–50 μg 复杂细胞裂解液蛋白）内具有优异的线性动态范围，能够准确区分各样本之间的上样差异¹²。

免染技术是一种新型的总蛋白染色方法，该方法将一种独特的化合物混入丙烯酰胺凝胶溶液中，并均匀分布于制备好的凝胶内。电泳完成后，将凝胶暴露于紫外光下至少1分钟，使染色化合物与蛋白质中的色氨酸残基发生反应。蛋白质在紫外光激发下产生强烈的荧光信号，可在支持免染功能的成像系统（如ChemiDoc MP系统）中进行可视化和定量分析。然而，该免染化合物本身不吸收紫外光，因此凝胶图像背景信号较低。色氨酸残基的这一修饰是不可逆的，因此蛋白质不仅可在凝胶中显影，而且在蛋白质转膜后的任意时间点也可在印迹膜上进行检测。

V3 蛋白质印迹工作流程中应用了免染技术（图1），以解决传统工作流程中的主要问题，尤其是使用看家蛋白作为上样对照所引发的担忧。采用该工作流程，研究人员可以：1）在约20-30分钟内完成凝胶电泳；2）在电泳结束后5分钟内检查样品完整性和蛋白质分离质量；3）在3-10分钟内完成蛋白质转膜；4）定量评估转膜效率；以及5）最重要的是，利用总蛋白上样对照来验证目标蛋白水平的变化。

方案

1. 蛋白质样品制备

（本文描述了从细胞培养物中提取蛋白质的典型步骤）

1. 将 HeLa 细胞培养皿置于冰上，用预冷的 Tris 缓冲盐水（TBS；20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤细胞。
2. 吸除 TBS，然后每 100 mm 培养皿加入 1 ml 预冷的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS），并添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂。
3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，轻柔地将细胞悬液转移至预冷的微量离心管中。
4. 在 4 °C 条件下，于旋转摇床上持续震荡孵育 30 分钟。
5. 在 4 °C 预冷的离心机中，以 16,000 x g 离心 20 分钟。
6. 小心地将离心管从离心机中取出并置于冰上。将上清液转移至另一置于冰上的新离心管中，弃去沉淀。
7. 取少量裂解液（10–20 μl）用于蛋白定量检测。使用 RC DC 蛋白检测试剂盒测定各样品的蛋白浓度。
8. 如需长期保存，可将蛋白样品分装后于 -20 °C 保存。反复冻融会导致蛋白降解，应避免。
9. 取约 20 μg 的各样品，加入等体积的 2x Laemmli 上样缓冲液（4% SDS，10% 2-巯基乙醇，20% 甘油，0.004% 溴酚蓝，125 mM Tris-HCl，pH 6.8）。
10. 将细胞裂解液与上样缓冲液混合物在 95 °C 加热 5 分钟。
11. 在微量离心机中以 16,000 x g 离心 1 分钟。

2. 使用免染凝胶进行凝胶电泳（约30分钟）

1. 取一块Criterion TGX Any KD 免染预铸胶（中等尺寸胶），移除梳子以及胶盒底部的胶带。
2. 将胶盒放入Criterion电泳槽中，并向内置的上层缓冲液室加入60 ml电泳缓冲液（25 mM Tris，190 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3）。用电泳缓冲液冲洗加样孔。
3. 向下层缓冲液槽的每侧加入400 ml电泳缓冲液，至标记的液面线处。
4. 上样蛋白样品及相应的蛋白分子量标记物。
5. 盖上电泳槽盖，将颜色编码的香蕉插头与盖子上的对应插孔对齐。
6. 以200 V电压电泳约30分钟，或以300 V电压电泳20分钟。

3. 使用 Chemidoc MP 系统进行免染凝胶成像以检测蛋白质分离质量（约 5 分钟）

1. 从电泳槽中取出凝胶盒。使用Criterion电泳槽盖子上的凝胶盒开启工具撬开凝胶盒，释放凝胶。
2. 向ChemiDoc MP成像仪的紫外样品托盘中央加入数毫升水。小心地将凝胶从凝胶盒中取出，并放置于托盘上。
3. 启动Image Lab软件，并使用以下设置捕获无染色凝胶图像（图1A）：
   应用模式：无染色凝胶
   凝胶激活时间：1分钟
   成像区域：Criterion凝胶
   图像曝光时间：根据最强条带自动优化
4. 从样品托盘中取出凝胶，立即进入转膜步骤。

4. 使用 Trans-Blot Turbo 系统进行蛋白质转印（约10分钟）

1. 打开 Trans-Blot Turbo Midi PVDF 转膜试剂盒；将底部层（包含膜）放置在转膜夹的底座上。
2. 将凝胶置于膜上方，将顶部层放在凝胶上，并滚压去除气泡。
3. 盖上夹子的盖板，旋转旋钮将其锁紧。
4. 将夹子插入转膜仪的槽中。
5. 选择预设的 Turbo 程序，并选择 Criterion 凝胶尺寸（midi），然后按 RUN 开始转膜。典型的运行时间仅为 7 分钟。
6. 转膜结束后，拆开转膜“三明治”结构，将膜和凝胶一同放入盛有去离子水的容器中。

5. 使用 Chemidoc MP 系统进行无染料凝胶和印迹成像以检测蛋白质转移效率和质量（约 5 分钟）

1. 将转膜后的凝胶放置在 ChemiDoc MP 成像仪的样品托盘上。
2. 启动 Image Lab 软件，并使用以下设置捕获转膜后凝胶的免染成像图像（图 1B）：
   应用模式：免染凝胶
   凝胶激活时间：无
   成像区域：criterion 凝胶
   图像曝光时间：与转膜前凝胶图像的曝光时间相同
3. 从样品托盘中取出凝胶，然后使用以下设置对印迹膜进行成像（图 1C）。成像过程中需保持印迹膜湿润，可滴加少量水或 TBST。
   应用模式：免染印迹膜
   成像区域：criterion 凝胶
   图像曝光时间：自动优化至最强烈条带的最佳曝光
4. 从样品托盘中取出印迹膜，放入含有 TBST（含 0.1% Tween 20 的 TBS）的容器中。

6. 抗体孵育

1. 将印迹膜置于含3%牛血清白蛋白（BSA）的TBST溶液中，室温下封闭1小时。
2. 将印迹膜在含有针对第一种目标蛋白的小鼠一抗和针对第二种目标蛋白的兔一抗的溶液中，4 °C孵育过夜。
3. 倒出含一抗的溶液，随后在20 ml TBST中振荡洗涤5分钟，重复4次，共洗涤5次。
4. 在含有Dylight 650标记的 Goat-anti-mouse 抗体和Dylight 549标记的 Goat-anti-rabbit 抗体的二抗溶液中，室温孵育1小时。
5. 倒出含一抗的溶液，随后在20 ml TBST中振荡洗涤5分钟，重复4次，共洗涤5次。

7. 使用 Image Lab 软件进行成像与数据分析——总蛋白归一化（约 5 分钟）

1. 获取印迹的多重荧光图像（图1E通过打开一个新的多通道程序，设置三个荧光通道并运行该程序。
   通道 1：
   应用：印迹 Dylight 650
   成像区域：标准凝胶
   图像曝光时间：针对最强烈的条带自动优化
   通道 2：
   应用：印迹 Dylight 549
   成像区域：标准凝胶
   图像曝光时间：针对最强烈的条带自动优化
   通道 3：
   应用：免染蛋白印迹
   成像区域：标准胶；图像曝光时间：针对最强条带自动优化
2. 从分析工具箱中点击归一化图标，然后点击“是”以检测泳道和条带。
3. 选择并使用 "泳道与条带工具" 如有需要，可对泳道和条带进行调整。
4. 选择免染成像作为归一化通道。
5. 选择分子量分析工具，并通过勾选其下方的复选框指定分子量标准条带。
6. 要查看归一化体积，请点击工具栏上的分析表格。所有计算将由软件自动完成，包括归一化因子和归一化体积。目标蛋白条带强度值现已根据蛋白上样量的差异进行了校正，从而可在各样本间对目标蛋白进行准确比较。

结果

1. 使用免染胶图像评估样品完整性、蛋白质分离质量和转膜效率。

将HeLa细胞的蛋白提取物在18孔Criterion AnyKD TGX免染色凝胶上以300 V电泳分离20分钟。蛋白样品以四种不同上样量各重复上样3次（第1–3泳道，40 μg；第4–6泳道，30 μg；第7–9泳道，20 μg；第10–12泳道，10 μg）。凝胶随后在紫外光下活化1分钟。图2A展示了蛋白分离完成后立即获取的凝胶图像。通过该凝胶图像可直观评估蛋白样品的完整性（例如 降解情况）以及分离质量（例如 蛋白沉淀）。随后，蛋白在Trans-Blot Turbo系统中转印至硝酸纤维素膜，转印时间为7分钟。图2B展示了转膜后凝胶的免染色图像。两幅图像的曝光时间相同（6.8秒）。选择第3和第12泳道用于测定转印效率。在Image Lab软件中使用体积工具，分别在两张凝胶图像的第3和第12泳道区域绘制矩形框（蓝色），并基于这些框的体积值进行计算，结果显示两个泳道的转印效率均为80%（图2C）。本实验选用AnyKD TGX凝胶用于研究小至中等大小的目标蛋白，该体系未针对大分子量蛋白的转印进行优化。若需优化大蛋白的转印效率，则应使用较低浓度的凝胶（例如 4–20%）和/或调整转印时间，以促进大分子量蛋白的有效转印。2. 免染色总蛋白上样对照是一种可靠的内参对照方法，可替代传统的管家蛋白上样对照，用于Western blot中对目标蛋白表达水平微小变化的定量分析。

MCM-7 是一种DNA复制许可因子，其在经辐射处理后，于淋巴母细胞系（LCL）中的表达水平下降20-50%。本实验中，将四组对照组与辐射处理组的淋巴母细胞系（LCL）培养物裂解液（每样30 μg）在12孔Criterion AnyKD TGX 免染胶上进行分离。凝胶经紫外光照射激活1分钟，随后通过Trans-Blot Turbo系统将蛋白转移至PVDF膜用于免疫印迹检测。内参蛋白GAPDH（绿色）使用兔源抗体（Cell Signaling Technology，美国，1:2,500）及Dylight 549标记的山羊抗兔抗体（Rockland，美国，1:20,000）进行检测；目标蛋白MCM-7（红色）则使用鼠源抗体（Abcam，美国，1:1,000）及Dylight 649标记的山羊抗鼠抗体（Rockland，1:10,000）进行检测。

图3A 显示了在四个对照组和经辐射处理的LCL样本中检测到的总蛋白（蓝色）、MCM-7（红色）和GAPDH（绿色）的多重荧光图像。图3B 为同一印迹的无染色成像，显示各样本（30 μg）中的总蛋白条带模式。Image Lab软件选定了样本泳道（蓝色框），用于测量每条泳道中MCM-7、GAPDH和总蛋白的信号体积。MCM-7水平的归一化处理分别以无染色法测定的总蛋白量或GAPDH为参照。对归一化后的MCM-7蛋白水平进行统计分析，其平均蛋白条带体积及标准差（n=4）呈现在图表中（图3C）。两种归一化方法均显示，经辐射处理后MCM-7蛋白水平略有下降（约25%）。以总蛋白归一化所得数据的标准差小于以GAPDH作为上样对照时的数据。

图1. V3 Western实验流程。 V3实验流程在左栏中分为4个步骤展示。每个步骤中列出了所使用的主要仪器和试剂，并包含各步骤的预计耗时。右栏显示，在V3流程中至少可生成4幅图像。图中说明了每部分数据的用途。转移前凝胶、转移后凝胶以及印迹膜的免染图像（A, B, C）在传统Western blot技术中难以获得；这些图像和数据为实验过程提供了重要的信息和质量控制节点，有助于提高科研人员对Western blot流程的掌控力和实验可重复性。目标蛋白信号可在化学发光印迹图像（D）中捕获，前提是检测时使用了HRP标记的二抗；或者在荧光印迹图像（E）中捕获，前提是进行了多重荧光Western blot检测，以在同一张印迹膜上同时检测多个目标蛋白。 点击此处查看高清大图。

图 2. V3 Western 实验流程中转膜前与转膜后免染胶图像，用于评估样品完整性、分离质量和转膜效率。（A）转膜前胶的免染图像。（B）转膜后胶的免染图像。（C）蛋白质转膜效率测定。 点击此处查看高清图像。

图3. 比较免染色总蛋白检测与GAPDH免疫检测作为上样对照，用于归一化目标蛋白水平。（A）荧光Western印迹图像。（B）免染色印迹图像。（C）归一化后的MCM-7蛋白水平。 点击此处查看高清图像。

讨论

上述 V3 免染色方案适用于多重荧光 Western 印迹实验，也可用于化学发光检测的 Western 印迹实验。在多重荧光 Western 印迹方案中，免染色印迹图像在两个时间点获取：1）蛋白转膜后立即成像；2）抗体孵育后的多重荧光成像步骤。第一个免染色图像用于计算转膜效率，第二个免染色图像则用作上样量对照。当采用化学发光方法时，无法同时对免染色信号和目标蛋白信号进行多重成像，因为化学发光信号也会出现在免染色通道中。在此情况下，我们建议使用蛋白转膜步骤完成后立即获取的免染色图像作为上样对照和归一化分析的依据。

与使用看家蛋白作为上样对照的传统 Western 印迹实验流程相比，V3 Western 实验流程具有以下独特优势：

首先，V3 工作流程提供了一种更实用、便捷且可靠的上样对照方法，用于验证目的蛋白水平的变化。V3 方案采用总蛋白上样对照，对各样本中检测到的目的蛋白水平进行归一化处理。该方法避免了使用看家蛋白作为上样对照时可能遇到的两个问题：免疫检测信号饱和，以及在特定实验条件下不同样本之间看家蛋白表达水平不一致。因此，不再需要使用针对看家蛋白的抗体进行膜剥离和重新孵育的步骤。借助免染技术，无需再使用考马斯亮蓝（Coomassie）或 Sypro Ruby 等染料对印迹膜进行染色和脱色以测定总蛋白量。仅需几秒钟即可获取印迹图像，使用 Image Lab 软件进行总蛋白归一化分析约需 5 分钟。

其次，V3 工作流程使科研人员能够更好地掌控 Western 实验过程，因为它提高了实验的透明度，并引入了多个质量控制检查点。借助免染技术，研究人员可以在凝胶和印迹膜上直接观察其蛋白质样品。科研人员可以评估蛋白质样品的完整性（是否降解）、分离质量（是否沉淀）、转膜效率及转膜质量（是否均匀转移）。这些检查点有助于研究人员在发现实验过程中存在重大缺陷时及时终止实验，避免在质量不佳的样品和印迹膜上浪费时间。该技术还能帮助科研人员评估膜在脱抗体处理后是否存在显著的蛋白质损失，以及印迹膜是否适合用于检测其他靶标⁴。

以下是一些使用 V3 western 工作流程时确保良好体验和高质量数据的小贴士。

1. 电泳结束后立即对凝胶进行成像。在本方案的首次成像前，切勿将凝胶浸泡于任何缓冲液中，以免洗脱染料化合物。
2. 在整个实验流程中使用相同的成像区域获取所有图像。这将允许软件对图像进行叠加，用于数据分析，例如总蛋白归一化。
3. 在对转膜前和转膜后的凝胶进行成像时，保持曝光时间一致。这将使软件能够定量测定转膜效率。
4. 在获取印迹图像时，用少量水或TBST保持膜的湿润。这有助于避免目标蛋白检测时可能出现的背景污渍问题。
5. 进行多重荧光Western印迹时，使用低荧光背景的PVDF膜。

需要注意的是，免染料在紫外活化后会不可逆地结合到色氨酸残基上。这种不可逆的修饰可能会影响单克隆抗体对抗原的识别，特别是当表位中含有色氨酸时。多克隆抗体则不太可能受到影响，因为它们可识别抗原上的多个表位。未结合的免染料分子可轻松从凝胶和膜上洗脱，因此不会干扰抗体与抗原的相互作用。

总之，V3 western 流程使 western 印迹过程更快速、更透明、更定量且更可靠。研究人员现在可以轻松地在 western 印迹实验中应用总蛋白上样对照，从而使数据更加可信。V3 免染色流程已被多家实验室采用，其发表的文献表明，期刊接受将免染色数据作为 western 印迹中的上样对照^{22,17,7,8,5,23,18,15}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
4-20% Criterion TGX Stain-Free 预制胶	Bio-Rad	567-8093	根据实验的具体需求选择合适的凝胶尺寸和浓度
Trans-Blot Turbo Midi PVDF 转膜试剂盒	Bio-Rad	170-4157	选择PVDF或硝酸纤维素膜，并确保膜的尺寸与凝胶尺寸匹配
Clarity Western ECL 化学发光底物，500 ml	Bio-Rad	170-5061
仪器设备
Criterion 电泳槽	Bio-Rad	165-6100
Trans-Blot Turbo 转膜系统（基础套装）	Bio-Rad	170-4155
ChemiDoc MP 成像系统	Bio-Rad	170-8280