疾病、头部损伤、基因修饰以及药物处理均可能对小鼠的行为产生显著影响。通过使用经过充分表征和验证的方法，如弹珠埋藏实验和巢材撕碎实验，可准确记录小鼠的强迫样行为，从而作为人类强迫症和自闭症谱系障碍的动物模型。
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摘要
摘要
强迫症（OCD）和自闭症谱系障碍（ASD）是严重且致残的精神疾病，均构成重大的公共卫生问题，尤其在儿童中更为突出。这两种疾病的共同特征是反复出现无意义的行为。OCD 患者常表现出反复检查、频繁洗手和计数等行为。患有 ASD 的儿童也会出现重复性敲击、挥臂或拍手以及摇晃身体等行为。这些行为在表现强度和频率上差异较大。更强烈形式的重复行为甚至可能导致身体损伤（例如 过度梳理毛发、过度洗手和自我刺激）。因此，这些行为极具干扰性，使正常的社交互动变得困难。目前针对 OCD 和 ASD 中重复行为的治疗选择较为有限，学界迫切希望为这两种疾病开发更有效的疗法。在过去三十年中，已建立了多种用于评估类强迫行为的动物模型。其中可能最具效度且使用最简便的动物模型是弹珠埋藏实验和巢材撕碎实验。这两个实验均利用了目标行为在小鼠中可自发出现的特点。在弹珠埋藏实验中，将 20 颗弹珠均匀放置于清洁垫料表面，由对受试对象的处理或状态不知情的研究人员记录在 30 分钟内被埋藏的弹珠数量。在巢材撕碎实验中，将一份预先称重的由碎棉纤维制成的巢材置于笼内垫料上方，在 30 分钟测试期结束后测定剩余未被破坏的巢材重量。本文中，我们描述了弹珠埋藏和巢材撕碎实验的操作方案，并提供了相应的视频记录。这两个实验均易于准确评分，且均能敏感地检测因基因操作、疾病或脑损伤所引起的类强迫行为表达的微小变化。
引言
人类行为尤其是精神疾病的小鼠模型，是研究疾病机制和开发新疗法的重要且必不可少的实验手段。许多精神疾病在动物中仍然极难建模（例如 精神分裂症）。然而，动物表现出大量天然且独特的行为，这些行为可轻易与人类的类似行为相对应。运动或自主活动便是动物中存在人类对应行为的一个例子。啮齿类动物常表现出多种重复性行为，例如理毛或挖掘。一种涉及人类反复出现且不受控制行为的精神疾病是强迫症（OCD）。OCD 的典型行为包括反复检查、计数以及过度清洗或理毛。强迫症是一种高度普遍（影响1-3%的人口）且致残性强的精神障碍1。目前已采用多种药物和行为学方法治疗强迫症，但许多疗法难以提供长期缓解，治疗方案结束后复发十分常见2,3。另一种涉及重复性行为表达的精神疾病是自闭症谱系障碍（ASD）。ASD 的特征是沟通和社会互动能力缺陷 以及重复性、刻板行为，包括旋转、摇晃、弹手指 或拍打动作，以及复杂的身体运动。美国疾病控制与预防中心估计，约每88名儿童中就有1人被诊断为ASD。目前针对该疾病的治疗选择数量极少且疗效有限4,5。在强迫症和自闭症谱系障碍中，重复性行为的发生频率和强度可能高到足以取代患者大多数其他正常行为和社会互动。鉴于以重复性行为为特征的精神疾病具有高发病率和致残性，同时考虑到对其病因理解不足且治疗手段有限，利用动物模型研究这些行为显得尤为紧迫。
在过去30年中，已开发出大量用于研究强迫症（OCD）和自闭症谱系障碍（ASD）中重复性行为的动物模型，并发表了众多描述这些模型的优秀综述文章6-14。总体而言，这些已建立的模型可分为遗传性、药理学、神经发育性和行为学模型，其中大多数具有良好的表型效度、结构效度和预测效度6,7。我们采用了两种行为学模型——埋珠实验和撕纸筑巢实验——来评估因基因缺失而导致5-羟色胺缺乏的小鼠中的重复性行为15,16。这些方法具有诸多优势，尤其包括操作简便、行为评分准确、啮齿类动物可自发表现出相关行为，以及可用于对基因修饰小鼠进行高通量筛选以识别异常行为表型。此外，每项测试均在标准且小鼠熟悉的饲养笼内进行，笼中垫料与其居住笼内的垫料相同，从而最大限度减少了小鼠对新测试环境的适应需求。实验过程中无需进行食物和/或饮水限制来"激发"小鼠执行任务。埋珠实验利用了小鼠在自然环境中倾向于挖掘的行为特征（e.g. 挖掘洞穴或逃生通道），以及在标准笼具垫料中挖掘的习性；而撕纸筑巢实验则基于小鼠天生具有筑巢行为这一事实，它们会建造巢穴以保护自身及其后代免受环境因素（e.g. 声音、光照、温度）的影响。利用非专用且普遍可得的啮齿类动物饲养材料，埋珠实验和撕纸筑巢任务成为简单而有力的小鼠重复性、强迫样行为的行为学检测方法。
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方案
所有使用动物的实验方案均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。这些方案已获得韦恩州立大学机构动物护理与使用委员会的批准（许可证编号 A3310-01）。
1. 大理石埋藏与巢材撕咬实验笼具的准备
- 使用标准的聚碳酸酯大鼠笼具（26 cm × 48 cm × 20 cm），配备带过滤盖的笼盖，用于进行弹珠埋藏实验。在每个笼内加入新鲜无香的小鼠垫料，垫料厚度为 5 cm，并通过将另一个相同尺寸的笼子压在垫料表面来整平垫料。此操作还可使垫料表面留下平行线模板，便于后续放置弹珠。
- 将标准玻璃玩具弹珠（多种样式和颜色，直径 15 mm，重量 5.2 g）轻柔地放置在垫料表面，共 5 行，每行 4 颗（见图 1A）。每次使用前，用温和的实验室洗涤剂清洗弹珠，用去离子蒸馏水彻底冲洗并晾干。
- 使用标准的聚碳酸酯大鼠笼具（19 cm × 29 cm × 13 cm），配备带过滤盖的笼盖，用于进行纸团撕碎实验。在每个笼内加入新鲜无香的小鼠垫料，厚度为 0.5 cm，并通过将另一个相同尺寸的笼子压在垫料表面以压实垫料。
- 使用分析天平称量市售棉纤维纸团（5 cm × 5 cm，厚 5 mm，每片约 2.5 g），并在每个测试笼的垫料上方各放置一个纸团（见图 3A）。
- 设置秒表或计时器，用于记录实验时长（每项实验 30 分钟）。
2. 测试前的动物处理
- 将家鼠单独或分组饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的房间内。为所有小鼠提供食物和水 随意摄取在测试前3至5天内轻柔地处理小鼠。两种性别的小鼠均可用于测试。
- 在上午9:00至下午4:00之间进行行为学测试，并在测试开始前60分钟将所有饲养小鼠的家笼转移至测试房间。
3. 小鼠大理石埋藏实验
- 将一只小鼠放入装有弹珠的笼子的一个角落，注意将小鼠放置在远离弹珠的垫料上，并盖上滤盖。测试期间停止提供食物和水。让小鼠在笼内不受干扰地停留30分钟。
- 测试结束后，小心取出小鼠并将其放回原有饲养笼中，注意在取出小鼠的过程中避免移动或碰动弹珠。
- 由2-3名对处理条件或小鼠基因型不知情的评分人员统计被埋藏的弹珠数量。若弹珠表面面积的三分之二被垫料覆盖，则记为已埋藏。计算每只小鼠被埋弹珠数量的平均评分。
- 从垫料中取出全部20颗弹珠。丢弃使用过的垫料。
4. 筑巢材料撕碎实验
- 将一只小鼠放入一个笼子中，笼内放置一个预先称重的筑巢垫料，并盖上带滤膜顶盖的笼盖。测试期间不提供食物和水。让小鼠在笼内与筑巢垫料共处30分钟，期间保持不受干扰。
- 测试结束后，将小鼠取出并放回其原居住的笼子。用镊子取出笼内剩余的完整筑巢垫料，并置于室温下过夜干燥。
- 称量剩余未被撕碎的筑巢垫料重量，将其除以初始重量，计算出被撕碎筑巢垫料的百分比 。如需要，可使用明确的5分制筑巢评分标准17对实验小鼠所构建的巢形进行评分，但需注意该评分标准通常用于评估筑巢行为，而非类似强迫性的撕碎行为。
- 丢弃剩余的撕碎垫料和垫料碎屑。
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结果
大理石埋藏实验和垫料撕碎实验的一个主要优势在于，它们均依赖于小鼠自然且自发的行为，这些行为可在测试结束后进行量化，从而允许单个研究人员设置实验后，在测试期间无需进入测试房间。大理石埋藏实验的关键环节之一是测试结束后需小心地将受试动物从笼中取出。小鼠通常会试图逃避捕捉，在此过程中可能移动原本部分埋藏的大理石，或在测试结束时将原本未埋藏的大理石部分掩埋。图1A展示了在引入受试动物前，从上方观察的测试笼具。我们倾向于以这种精确方式排列大理石，以便后续不仅可记录埋藏情况（如需要），还可追踪大理石的位移。在一个示例性实验中，我们将野生型（WT）小鼠的大理石埋藏行为与缺乏色氨酸羟化酶2（TPH2）基因的小鼠进行比较；TPH2是脑内5-羟色胺（5HT）生物合成的起始且限速的关键酶。由于TPH2基因的无效突变，这些小鼠脑内无法检测到5HT15,16,18。这些小鼠表现出一种非常有趣的表型，其特征主要为重复性、强迫样挖掘和埋藏行为15,16。图1B展示了来自野生型小鼠的一个代表性笼具，图1C则为TPH2基因敲除...
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讨论
大理石埋藏实验和巢材撕碎实验是研究小鼠重复性及强迫样行为的良好行为学方法范例。这两种实验对其所模拟的人类疾病均表现出优异的表观效度、构念效度和预测效度6-11。这些重复性行为在啮齿类动物中属于自然且自发的行为，其发生频率和强度可在基因修饰后（如本文所示）或在脑外伤及药物处理后发生变化。这两种实验的价值在于它们已被验证为人类精神疾病（如强迫症 OCD 和自闭症谱系障碍 ASD）的有效模型，而这两种疾病均涉及重复性、非意愿性行为的表达。这两个实验对小鼠挖掘、埋藏和撕碎行为表达水平的显著变化具有良好的稳健性和敏感性，TPH2 基因敲除小鼠的结果已充分证明了这一点。
与现有方法（例如 遗传学、药理学和神经发育模型）相比，弹珠埋藏实验和巢材撕碎实验具有多种优势。这两种方法大多数实验室均可轻松开展，无需复杂且昂贵的设备。这些实验操作简便，可设计为高通量分析，并且评分可靠、易于实施。经过轻微修改后，这些模型还可提供额外的有价值信息，在研究更复杂行为和疾病时尤为有用。例如，可对两种实验过程进行录像，并对小鼠的运动活动、移动距离、移动时间以及在测试笼...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了美国退伍军人事务部和美国国立卫生研究院资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃玩具弹珠 | 当地玩具店 | N/A | 各种款式、颜色、透明和不透明 |
| Nestlets | Ancare | NES3600 | |
| N10 系列小鼠笼 | Ancare | N10HT | 带金属网盖的标准啮齿类动物笼具 |
| R20 系列大鼠笼 | Ancare | R20 | 带金属网盖的标准啮齿类动物笼具 |
| Bed-o'Cobs | The Andersons | 8B | 标准啮齿类动物散装垫料，1/8 英寸 |
参考文献
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