我们描述了如何使用标准光学显微镜，结合明场和微分干涉对比成像，对细胞质量、体积和密度进行定量测量。
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本文内容
摘要
摘要
我们介绍如何利用标准光学显微镜，结合明场与微分干涉差（DIC）成像技术，对细胞样本进行质量、体积和密度的定量测量。本文提出了两种主要方法：非干涉定量相位显微术（NIQPM），用于测量细胞总质量和亚细胞密度分布；以及希尔伯特变换微分干涉差显微术（HTDIC） ，用于测定体积。NIQPM基于一种简化的光波传播模型，称为近轴近似，其包含三个基本假设：低数值孔径（NA）照明、弱散射以及样本对光的弱吸收。幸运的是，未染色的细胞样本通常满足这些假设，且在商用显微镜上易于实现低NA照明。HTDIC则用于在高NA照明条件下，从沿焦平面扫描获得的DIC图像序列中提取三维体积信息。高NA照明可增强沿光轴方向的光学切片能力。对DIC图像堆栈进行希尔伯特变换处理，能够有效分离样本强度与背景的灰度值，从而显著提升边缘检测算法在三维空间中定位样本边界的能力。NIQPM与HTDIC的主要优势在于其技术可及性，仅需使用“即买即用”的常规显微镜设备即可实现。然而，这两种方法也存在两个基本局限：目前商用显微镜的z轴堆栈采集速度较慢，限制了对快于每分钟1帧的动态过程的研究；其次，衍射效应使得NIQPM和HTDIC仅适用于直径在0.2至10 μm（NIQPM）和20 μm（HTDIC）范围内的样本。因此，待测样本及其关注的时间动态过程必须满足一定的尺寸和时间尺度约束，方可适用这些方法。值得期待的是，大多数固定的细胞样本均可方便地通过这些方法进行研究。
引言
光学显微镜的使用如今已广泛应用于细胞生物的研究中。由于细胞在可见光波段具有较低的内源性吸收和微弱的散射特性，它们对穿过其中的光波振幅影响较小，因此在标准明场显微镜下成像时呈现半透明状态。然而，细胞样本确实会减缓穿过它们的光波传播速度，这种减缓程度与光波所经过空间区域的局部质量密度呈线性关系。利用显微样本透射光波所产生的这种非均匀时间延迟或“相位”分布的特性，最早由弗里茨·泽尼克（Frits Zernike）于1935年提出1，并在1942年由泽尼克本人首次实现实验验证2。泽尼克因此项成就荣获1953年诺贝尔奖。蔡司（Zeiss）公司于1945年将该技术实现商业化3。 1955年，史密斯（Smith）和诺马尔斯基（Nomarski）发表了关于微分干涉差（differential interference contrast, DIC）显微镜应用4与理论5的初步研究，该技术利用相位的空间梯度作为对比度生成机制。蔡司公司于1965年与诺马尔斯基密切合作，将DIC技术推向商业化6。1981年，两个实验室通过将摄像机整合到DIC显微镜的光路中，首次实现了活细胞DIC动态成像的记录7,8。活细胞成像时代由此开启。
自那以后，商用显微镜上相位差和微分干涉差（DIC）技术的实现基本未发生改变。生物学家主要利用这....
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方案
1. 显微镜规格
为了正确进行成像，显微镜应具备以下规格：
- 具备微分干涉差（DIC）和明场（BF）成像功能。
- 具备计算机控制的Z轴移动功能。
- 具备可调节的孔径光阑，以调节聚光镜的数值孔径。需要带有分级刻度或电子读数的光阑，以确定数值孔径的具体数值。数值孔径应能从NIQPM所需的0.1调节至HTDIC所需的0.9（或更高）。
- 显微镜应配备窄带滤光片，用于明场成像。该滤光片用于固定折射率增量（refractive increment），该参数为波长依赖性因子，用于在NIQP中将相位信息转换为质量密度。
2. 差分干涉对比（DIC）Z轴层析成像采集
- 打开 SlideBook 软件，并为图像采集创建一个新的载片。
- 接着，打开对焦窗口。在滤光片组部分，选择DIC。在显微镜选项卡的聚光镜部分，将光圈滑块调整至最右侧位置（完全打开）。这将提供高数值孔径的照明，增强样本的光学切片效果。
- 使用 DIC 物镜对样本进行对焦。调节卤素灯强度，直至样本清晰可见。为确保相机未发生饱和，请在对焦窗口中选择相机选项卡，并检查....
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结果
在焦平面扫描图像采集过程中，正确的样品照明对于成功实现NIQPM and HTDIC算法至关重要。在图2中，我们展示了聚苯乙烯微球和人结肠直肠腺癌细胞系SW620在微分干涉差（DIC）和明场对比模式下，低数值孔径（NA）和高数值孔径（NA）照明的成像效果。图2A、2C、2I和2K展示了适用于NIQPM的最佳成像条件。图2F、2H、2N和2P展示了适用于HTDIC的最佳成像条件。
图3和图4展示了NIQPM算法的参数依赖性，突出了成功与不成功的实现情况。在图3中，我们研究了一个直径为4.8 μm的聚苯乙烯微球的相位分布——该分布的理论预期值已知，因此可直接与NIQPM重建结果进行比较。图2I-L展示了该微球可获得的最佳重建结果。由于微球边界及内部的衍.......
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讨论
总体而言，NIQPM 是一种衍射受限的技术，已在0.25-44.7范围内的光程长度上得到验证。验证实验使用直径为0.11-9.8 μm、悬浮于Fluoromount G中的n = 1.596聚苯乙烯微球（未展示数据）进行。细胞的光程长度范围接近0-7。
在测量样品的密度分布时，可能会发现伪DIC图像效果良好，而密度图却存在不希望的背景贡献。这是由于用作NIQPM算法输入的明场图像中存在噪声所致。可通过两种对NIQPM方法的改进来消除这些不希望的背景贡献：首先，可采用更长的曝光时间以提高明场图像的信噪比，这在对光学薄样品成像时尤为关键；其次，可将z轴堆栈采集的轴向间距从0.1 μm减小至0.05 μm，并在输入NIQPM算法前对2–3个层面进行平均处理。
基于HTDIC的体积测定方法已在直径范围为1-20 μm的聚苯乙烯微球上得到验证，并已通过共聚焦荧光显微镜进行交叉验证35。由于光学系统点扩散函数相关的衍射效应，该技术会对小于系统衍射极限的物体体积产生高估。
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披露
作者对所展示的工作没有经济利益关系。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助（K.G.P. 和 O.J.T.M. 获 U54CA143906 项目资助，O.J.T.M. 获 R01HL101972 项目资助）以及俄勒冈医学研究基金会早期临床研究者奖（K.G.P.）。O.J.T.M. 是美国心脏协会认定的研究员（13EIA12630000）。我们感谢奈特癌症研究所的 Eric Anderson 博士为本研究准备的细胞样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔡司 Axio Imager 2 显微镜 | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | 显微镜 |
| 绿色滤光片 (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | 绿色滤光片 |
| SlideBook 5.5 软件 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | 图像采集软件 | |
| 聚苯乙烯微球 | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | 聚苯乙烯小球 |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | 封片介质 |
参考文献
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974....
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重印与许可
