使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

摘要

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像^rd 龄期 果蝇 幼虫

摘要

活体成像技术是研究细胞生物学过程的重要手段，但在活体动物中实施这一技术具有挑战性。由于线虫幼虫的角质层具有半透明特性， 果蝇 幼虫使其成为活体成像研究的理想模式生物。然而，活体成像技术面临的一个重要挑战是如何以非侵入性方式将动物固定并准确定位于显微镜下。本方案介绍了一种简单且易于操作的方法，用于固定和成像 果蝇 幼虫置于一种我们称之为“幼虫芯片”的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置上。该幼虫芯片由一个紧密贴合的PDMS微腔室组成，其附着于一片薄的玻璃盖玻片。通过注射器施加真空，可使幼虫固定，并将腹侧结构（如腹神经索、节段神经和体壁肌肉）紧贴于盖玻片下方。这使得能够进行高分辨率成像，且重要的是，无需使用麻醉剂或化学试剂，从而便于研究多种生理过程。由于幼虫在固定后可迅速恢复，因此可反复进行多次成像。这使得能够在数小时至数天的时间范围内开展纵向研究。本方案逐步描述了芯片的制备方法以及如何利用该芯片对3龄幼虫神经活动进行活体成像^rd 龄幼虫。这些事件包括轴突中细胞器的快速运输、损伤引起的钙反应，以及对光转换蛋白在长距离和长时间尺度上的运输进行延时研究。该芯片的另一个应用是研究轴突损伤后的再生与变性反应，因此本实验方案的第二部分描述了一种新的、简单的方法，通过节段性神经 crush 损伤外周神经中的轴突。

引言

果蝇， 黑腹果蝇，已被用作模式生物超过100年，且在揭示从无脊椎动物到人类保守的基本信号传导和发育通路方面发挥了关键作用。活体成像是一种研究细胞机制的重要方法，而其简单的身体结构和透明的角质层使得 果蝇 幼虫是活体成像的理想系统，尤其因为已有大量遗传工具可用于在特定细胞类型中表达荧光标记蛋白。

活体成像技术面临的一个重要挑战是如何以非侵入性的方式将动物固定并定位，以便进行显微观察。传统的固定方法包括解剖^1,2或使用氯仿，但这些方法都会导致动物死亡。麻醉剂乙醚⁴和异氟烷^5-8也曾被用于动物固定。尽管麻醉剂具有多种优势，但它们会抑制神经活动以及重要的生理功能（包括心跳）^9-11，因此可能影响所研究的生物学过程，并对动物造成应激反应。此外，使用乙醚和异氟烷还存在对操作人员的安全隐患。

我们开发了一种无药物的方法，用于在单层 PDMS 微流控装置中固定Drosophila幼虫，该装置我们称之为“幼虫芯片”¹²。 本实验方案将介绍如何获取或制备幼虫芯片，以及如何将其用于早期3^rd龄幼虫的活体成像。该芯片包含一个贴合紧密的微型腔室，通过注射器施加真空，可利用轻柔的机械力将幼虫固定。该固定方法使腹侧结构（如神经索、节段神经和体壁肌肉）紧贴玻璃盖玻片，从而能够利用高数值孔径（高倍率）物镜对这些结构进行高分辨率成像。

与其它传统技术相比，幼虫芯片具有以下优势：（i）使用幼虫芯片可替代化学试剂，从而实现 在 体内 对未麻醉动物进行成像。（ii）幼虫从芯片释放后可立即恢复（相比之下，异氟烷处理后需要2小时恢复期）^8,13）。这使得成像可在较宽的时间尺度上进行，从毫秒到分钟，再到小时乃至数天。（iii）使用具有透气性的PDMS材料，可使氧气/空气持续从环境中扩散至幼虫体内。（iv）该芯片使用简便且安全，（v）可重复使用，并能以极低的成本进行制造。

除了使用幼虫芯片的说明外，本方案还将提供多个应用实例，以研究3龄幼虫中神经元活动事件^rd 龄幼虫。包括轴突运输的活体成像、损伤后的钙反应，以及光转换蛋白在长距离和长时间尺度上的转运时程研究。

该芯片的另一个应用是研究神经元对轴突损伤的反应。为此，本文在第三部分描述了一种额外的操作步骤，即通过节段性神经挤压损伤外周神经中的轴突。这种简单的检测方法可在标准解剖体视显微镜下快速且可重复地进行，从而能够同时处理大量动物样本。通过幼虫芯片进行活体成像，可研究细胞对损伤的反应。

方案

1. 制作PDMS芯片

要从SU-8模具制备PDMS芯片，请执行步骤1.1–1.7。如果已有现成芯片但需要组装后使用，则跳至步骤1.8。

1. 将45 g PDMS基础液与4.5 g固化剂（10:1比例）从PDMS试剂盒中取出，置于小型一次性塑料容器中，使用塑料搅拌棒充分混合。
2. 将容器放入真空容器中（例如 在干燥器中静置10分钟以去除气泡。
3. 将SU-8模具置于直径150 mm的塑料培养皿底部，缓慢将PDMS混合物倾倒在模具上。倾倒PDMS时注意避免产生气泡。
4. 在 650 °C 的烘箱（或培养箱）中固化 PDMS 4 小时。
5. 从烘箱中取出固化的PDMS/SU-8模具，静置冷却几分钟。
6. 使用剃刀沿SU-8模具边缘切割固化的PDMS，并将其从SU-8模具上剥离。
7. 使用剃刀将PDMS平板分割成单个PDMS芯片。
8. 使用21 G 移液针，刺穿真空接口（如图所示） 图1APDMS芯片的）
9. 取一支23 G的分配针，从针尖基部扭转数次，使针尖从锁紧接头处断开。
10. 将23 G针头插入一小段聚乙烯管中，使管子覆盖针头至少一毫米。然后使用刀片将针头上的多余管子切除。这样可在针头一端形成一个塑料环，当其插入真空进气口时可形成密封。
11. 用于与 倒置的 显微镜（图1B 和 2A-B：将23 G针头插入真空接口孔中。用于配合 直立的 显微镜（图1C 和 2C-D）：使用21 G分配针在PDMS芯片侧面打第二个孔，此孔将从侧面通向第一个孔。然后将带管环的23 G针头插入侧面的孔中。在PDMS芯片顶部贴上一片双面胶带，以密封顶部的孔图1C).
12. 取一段长约20 cm的聚乙烯管。将管的一端连接到插入真空接口的针头尖端。
13. 将管路的另一端连接到三通阀的一个端口（参见材料列表中的“三通旋塞阀”）
14. 将一个20 ml注射器连接至两个剩余端口中的一个，最后一个端口保持向环境开放。

2. 使用幼虫芯片进行活体成像

1. 用透明胶带清洁PDMS芯片。将一段胶带贴在芯片底部，确保胶带与整个PDMS表面接触，然后将胶带撕下。
2. 重复上述步骤2–3次，以确保PDMS芯片表面无颗粒或油渍（来自先前实验的残留物）。由于PDMS芯片可重复使用，彻底清除油渍残留非常重要，因为油渍会影响PDMS与玻璃之间的粘附性，导致密封不充分。
3. 将早期（即觅食期）3^rd 龄幼虫转移至含有水的培养皿 中。（觅食期3^rd 龄幼虫位于培养基内部，而非培养管壁侧）。将幼虫浸入水中以去除培养基。
4. 取一块洁净的玻璃盖玻片，在其中心位置滴加一小滴Halocarbon 700油。
5. 用镊子轻轻从水中夹取一只洁净的早期3^rd 龄幼虫（幼虫长度约为3.5–4 mm）。将幼虫短暂放置在轻质擦拭纸或纸巾上以去除多余水分，然后将其置于油滴上。油滴应足够小，以免覆盖幼虫的气管。让幼虫在油滴上停留10秒。
6. 将幼虫从油滴中取出，然后将其放置在一块洁净的玻璃盖玻片上。
7. 将幼虫转移至另一块洁净的玻璃盖玻片。此步骤可去除多余的油。
8. 注意幼虫的朝向。若需成像神经索和节段神经，应使幼虫腹面朝下贴附于盖玻片，背面朝上；背面特征为两条纵向气管。注意：此为幼虫自然偏好的朝向。
9. 将PDMS芯片轻轻放置在幼虫上方。幼虫应居中对齐微腔中央，尾部朝向真空口。注意避免幼虫接触腔室边缘，尤其需保护前后端气管末端。注意：建议在体视显微镜下完成此步骤。
10. 将PDMS芯片压向玻璃盖玻片，以实现良好密封。确保PDMS芯片与盖玻片接触时，幼虫完全被微腔包围。
11. 打开三通阀，使注射器可通过管路从PDMS微腔中抽气，从而形成真空。
12. 一手牢固按住PDMS芯片与玻璃盖玻片，另一手拉动注射器活塞，抽出2–2.5 mL空气，直至注射器手柄出现明显阻力，以形成真空。真空可在PDMS芯片、油和盖玻片界面之间形成紧密密封，从而限制幼虫活动。
13. 关闭三通阀，使PDMS芯片与注射器及外界环境隔离。由此可在微腔内维持相对稳定的真空度，无需持续按压注射器活塞。
14. 在体视显微镜下检查幼虫，确认整个虫体位于微腔内且无活动，气管清晰可见，PDMS芯片其余部分均与盖玻片接触。注意：正确固定的示例见图2E和2F；图2G和2H展示了部分错误朝向。
15. 将幼虫芯片（PDMS芯片+玻璃盖玻片）置于显微镜载物台上。操作过程中需小心处理幼虫芯片、管路和注射器，避免PDMS芯片与盖玻片分离。对于直立式显微镜，使用双面胶带将芯片“顶部”固定于显微镜载物台（图1C）。
16. 使用高倍物镜（建议使用油镜，40–63X ）定位幼虫目标结构并进行成像。某些情况下，可先使用较低倍率确定成像区域，再切换至高倍率。
17. 成像完成后，将三通阀切换至与外界连通的位置，释放真空。
18. 将PDMS芯片从盖玻片上取下。幼虫应立即恢复活动能力。
19. 用镊子将幼虫从微腔中取出，并轻轻放置于葡萄汁琼脂平板上以恢复活力。

3. 对幼虫节段神经诱导神经 crush 损伤

1. 按照上述步骤 2.3 分离早期阶段的 3^rd 所需基因型的龄期幼虫。如步骤 2.3 所述 将幼虫浸入水中以去除食物。
2. 使用标准果蝇CO₂麻醉装置₂ 麻醉站，配备 CO₂ 将幼虫置于解剖立体显微镜下的垫板上以固定。 幼虫在置于CO后应变得无法移动₂ 轻拍1-2分钟。
3. 现在将一只麻醉后的幼虫置于体视显微镜下的葡萄汁琼脂平板上。将幼虫翻转至腹面朝上，以便透过体壁观察腹神经索和节段神经。图3确保幼虫完全不动。
4. 使用 Dumostar 5 号镊子，通过体壁外骨骼紧紧夹住节段神经 5–10 秒。操作正确时，外骨骼保持完整，体壁未被刺穿。注意：只要不损伤腹神经索、唾液腺和肠道，损伤可在前后体轴的不同位置进行。最有效的损伤位置位于第 3 节段末端附近^rd 腹部节段，如图所示 图 3D该部位损伤可累及最多神经，且在不致死动物的情况下最容易复制。
5. 损伤后，将动物翻转，使其腹侧朝下置于葡萄培养基上。动物应能活动头部并进食。若损伤成功，则幼虫后半部分将出现瘫痪。
6. 将受伤的动物置于葡萄汁琼脂平板上，在 25 °C 下根据实验目的保持所需时间。对于运动神经元，近端残端在 8–10 小时内开始出芽 损伤¹⁴，远端残端在6-8小时内开始退化¹⁵对于IV类da感觉神经元，近端残端在4-6小时内开始出芽，远端残端在3-4小时内开始退化 损伤后。注意：使用适当的Gal4驱动子和荧光报告基因，可在幼虫芯片中观察到神经芽生与退变过程（例如，参见 图6).

结果

幼虫芯片由单层PDMS块（即PDMS芯片）构成，其设计结构示意图如下所示 图1。（另请参见补充的 DXF 文件，用于设计您自己的模具）。幼虫微室、真空端口和周边通道（图1A）是PDMS芯片上深度为140 μm的压痕。将该芯片置于早期阶段的3^rd 龄幼虫，静置于含油的盖玻片上方图1B 和 1C）。盖玻片与PDMS芯片之间的油-玻璃界面在施加轻微真空后可形成密封，该密封将幼虫固定在腔室内，且由于早期阶段的3^rd 三龄幼虫略粗于微室，当密封微室时会对幼虫产生一定的物理限制，从而有效固定并限制其运动。在此固定状态下，某些腹侧结构（如腹神经索和体节）被推近至盖玻片，有利于成像，因为在固定状态下这些结构可位于40X和63X物镜的工作距离范围内。释放真空后，幼虫可轻松从微室中取出，便于进行后续实验。这种纯机械固定方法可在连续固定长达1小时后仍保持90%幼虫存活。¹².

真空由一支简单的20 ml注射器产生，因此整个装置易于从体视显微镜（用于在腔室中进行定位）转移至共聚焦显微镜或落射荧光显微镜（用于活体成像）。注射器通过聚乙烯管和23 G分配针头（已移除锁定接头）连接至真空接口，具体操作如步骤1.6-1.14所述。对于倒置显微镜，管路和注射器通过芯片顶部连接 (图1B，2A，和 2B）。对于正置显微镜，则通过芯片侧面的接口连接 (图1C，2C，和 2D）。倒置显微镜的配置使用起来相对更简便。拉动注射器以产生轻柔的真空（约10 psi），使油-玻璃-PDMS界面结合，从而在盖玻片与PDMS装置之间形成严密密封，将幼虫固定在腔室内并保持其静止。

将幼虫放入微室（方案中的步骤2.7-2.10）对于有效固定和存活至关重要（图2E-H）。如果幼虫体型过大而不适合微室（图2G），或其头部或气管被卡在微室边缘与盖玻片之间（图1H），则其在操作过程中存活的可能性将大大降低。

以下是利用幼虫芯片研究神经元中各种细胞反应的几个示例（图4-7，视频S1和视频S2）。

快速轴突运输成像：利用幼虫芯片对单个外周轴突内由驱动蛋白介导的突触小泡运输进行成像（图4和视频S1）。通过转盘共聚焦显微镜采集的视频，可清晰观察这些小泡的顺向运动（约1.0 μm/sec）和逆向运动（约0.8 μm/sec）。

激光显微手术中动物的体位摆放： 使用脉冲紫外染料激光切断了一根感觉神经元树突图5 和 视频 S2。 有关该方法在显微手术中应用的方案可参见其他文献^16,17高效的固定技术可实现对受损神经元在快速时间尺度上的变化进行监测，例如细胞内钙离子浓度的变化（通过基因编码的Ca²⁺ 指示剂 GCamp3.0¹⁸），以进行检测和测量（图5).

研究损伤后的再生与变性反应：如果在成像间隔期间允许动物休息，幼虫芯片可用于研究在较长时间尺度上发生的细胞事件。例如，在15小时的时间尺度上发生的轴突损伤后的“再生”和变性反应，均可在幼虫芯片中进行成像（图6）。在此示例中，通过本方案第3部分所述的节段性神经挤压方法（图3）对章鱼胺能运动神经元的轴突造成损伤。损伤后可在不同时间点对近端轴突残端（发生新生出芽）以及远端轴突（形成串珠样膨大，并通过华勒变性过程进一步断裂）进行成像和研究。

追踪光转换蛋白 随时间变化的荧光蛋白 体内： 光可转换荧光蛋白的开发使其荧光在紫外光照射下发生不可逆变化，从而能够特异性标记细胞内某一亚群蛋白质，并随时间追踪标记蛋白质的命运^19,20该技术最常在细胞培养中进行，然而利用幼虫芯片，可在特定细胞内追踪基因编码的光可转换蛋白 体内例如，我们展示了在Ⅳ类da感觉神经元中表达的Denda2-α-tubulin融合蛋白可在胞体中进行光转化（图7A 和 7B）。随后可随时间追踪光转化蛋白的运输情况：两天内，我们即可在感觉神经元的轴突末端检测到大量光转化后的蛋白，这些轴突末端距离细胞体的原始位置约1毫米。图7A 和 7C).

所有描述的示例（图4-7 和 视频S1 与 S2）均使用转盘共聚焦成像系统进行成像，该系统由Nipkow CSU10扫描仪和C9100-50 EMCCD相机组成，安装在配备63倍（1.5 NA）油镜物镜的Axio Observer显微镜上，并通过Volocity采集软件控制运行。

图1. 使用幼虫芯片的示意图。
（A） 幼虫芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片（浅蓝色部分）粘附于玻璃盖玻片构成。芯片内含有厚度为140 µm的微流体通道（白色部分）。中央微腔室设计为可紧密容纳一个早期阶段的3^rd 龄期 果蝇 幼虫（以浅绿色示意图表示）。用于设计模具的精确尺寸DXF文件作为补充数据提供。比例尺 = 1.5 mm。 （B-C） 将幼虫装入幼虫芯片的示意图侧视图。幼虫腹面朝下置于盖玻片上，其身体位于140 µm深的微腔室内。将一个20 ml注射器连接至真空进气口，用于产生轻柔的负压。在负压作用下，卤代烷油-PDMS-玻璃界面形成严密密封，从而将幼虫固定在微腔室内。通过释放注射器中的压力可轻松解除该密封，随后幼虫立即恢复运动能力。适用于直立式显微镜（B），通过聚乙烯-50管将芯片顶部与注射器真空装置相连。对于倒置显微镜（C），这些连接是从芯片的侧面进行的，而芯片的“顶部”则通过双面胶带固定在显微镜载物台上。

图 2. PDMS 芯片及幼虫正确固定位置的图像。
(A-D)。 显示用于倒置和正置显微镜的 PDMS 芯片的照片。已将 23 G 分液针头插入真空口，可通过管路连接至真空源（注射器）。比例尺 = 1.5 mm。(E-H)。 固定后的 Drosophila 幼虫的明场图像。E 和 F 显示正确固定的动物示例。F 中较小的个体更适合进行长时间尺度（>12 小时）的多次成像。G 显示一个体型过大的个体，H 显示一个位置不正确的较小个体。比例尺 = 1.5 mm。 点击此处查看高分辨率图像。

图3. 节段性神经的神经 crush 损伤 果蝇 幼虫
（A） 神经挤压实验示意图。在3毫米范围内挤压节段神经。^rd 用5号镊子夹碎二龄幼虫的腹侧表皮。 （B） 动物在神经压伤后20小时解剖，观察其幼虫神经系统。使用抗-HRP抗体对神经元膜进行免疫染色（红色），可清晰显示脑叶、腹神经索以及包含运动神经元和感觉神经元轴突的长节段神经。通过m12-Gal4驱动子驱动UAS-mCD8-GFP表达，标记了一部分特定的运动神经元（绿色）。这些神经元的细胞体和树突位于腹神经索中，其轴突则通过节段神经投射至体壁肌肉。该驱动子还在每个幼虫半体节的肌肉12中驱动GFP表达，这些肌肉在动物两侧呈现为前后走向的条带状结构。神经压伤损伤区域以蓝色虚线标出。比例尺 = 70 µm。 (C) 损伤后20小时的轴突损伤局部特写。左图：近端轴突已发生出芽并出现新生长。右图：远端轴突发生片段化，由于华勒变性及碎片清除，绿色荧光蛋白（GFP）信号几乎消失。比例尺 = 10 µm。 (D) 早期神经挤压损伤的图像^rd 龄幼虫。红色箭头指向腹神经索。挤压位置位于第3体节的下部，具体如方案文本（方案3）所述。D中的图像最初发表于 细胞生物学杂志 191, 211-223, doi: 10.1083 (2010). 单击此处查看大图。

图 4. 肽能突触囊泡轴突运输的延时成像。利用 eve-RRa-Gal4 驱动子²²，在特定运动神经元中表达绿色荧光蛋白标记的鼠心房利钠肽 ANF（UAS-ANF-GFP²¹）。对节段神经进行活体成像，可观察到 ANF-GFP 标记的肽能囊泡在轴突中的快速运输。另见 视频 S1。（A） 活体延时成像中运动神经元轴突的单帧图像。绿色、红色和蓝色箭头分别表示顺向运输、静止和逆向运输的囊泡示例。比例尺 = 5 µm。（A'） 使用 ImageJ 将视频中的各个时间帧合并。（B） 通过延时成像生成 ANF-GFP 运输的线扫图（kymograph），该图基于成像时间持续一分钟的多个单帧图像，使用 ImageJ 的“Multiple Kymograph”插件生成²³。（C） 分段速度的定量分析，该速度由线扫图中分段轨迹的斜率计算得出。绿色柱表示囊泡的顺向分段速度（n = 543），蓝色柱表示逆向分段速度（n = 548），数据来自 10 个线扫图。（D） 颗粒密度的定量分析。颗粒密度通过每 100 µm 轴突长度中顺向（绿色柱）、静止（红色柱）和逆向（蓝色柱）颗粒的数量进行测量，数据来自 10 个线扫图。本图数据此前亦发表于 Ghannad-Rezaie 等, PLoS One 7(1), e29869, doi:10.1371/journal.pone.0029869 (2012)。

图 5. 利用幼虫芯片进行激光显微手术和钙成像。
使用脉冲紫外染料激光器的高能激光脉冲切断了IV类感觉神经元的一条树突。该显微手术方法的详细实验方案可参见其他文献¹⁶。幼虫芯片中有效的固定使得可通过活体成像研究细胞内钙水平的快速变化。在此示例中，利用 ppk-Gal4 驱动子在IV类树突状（C4da）感觉神经元中表达了基因编码的钙指示剂 GCaMP3.0。(A) GCaMP3.0 荧光强度的时间序列图像根据颜色强度标尺进行伪彩着色，以显示随时间变化的强度差异。各帧图像取自在转盘共聚焦显微镜上以每秒5帧速率拍摄的时间序列视频（视频 S2）。(B) 激光显微手术后钙动态变化的定量分析。将单个神经元胞体中 GCaMP3.0 荧光强度的归一化倍数变化（ΔF/F₀）随时间作图（n = 7，灰色线条）。平均 ΔF/F₀ 以橙色表示。GCaMP3.0 荧光强度的峰值出现在损伤后 1–2 秒之间。原始 GCaMP3.0 荧光强度已减去背景信号。本图数据此前亦发表于 Ghannad-Rezaie et al., (2012) PLoS One 7(1):e29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869¹²。

图6. 利用幼虫芯片成像轴突出芽与退变过程。 在神经 crush 损伤后不同时间点，章胺能运动神经元轴突的近端残端（左）和远端残端（右）的代表性共聚焦图像。图像采集位置与图3C所示位置相似。这些神经元通过 Tdc2-Gal4 驱动子驱动 UAS-mCD8-RFP 转基因表达进行标记^24,25。这些神经元的胞体位于腹神经索²⁴。在单个节段神经中可观察到三条独立的轴突，彼此之间清晰可辨。此种情况非常适合研究单个细胞事件，例如退变轴突的断裂过程——这些神经元的轴突断裂在15小时内即可完成。图像采用旋转盘共聚焦显微镜，通过幼虫芯片在活体动物中以63倍放大倍数获取。左侧面板（近端残端）标尺 = 10 µm，右侧面板（远端残端）标尺 = 20 µm。点击此处查看高清图像。

图 7. 利用幼虫芯片在活体动物中长时间、长距离追踪光转化荧光蛋白。
本示例中，使用 ppk-Gal4 驱动子²⁶，在 IV 类树突状分支（C4da）感觉神经元中表达一种光可转化荧光蛋白 Dendra2¹⁹ 与 α-微管蛋白的融合蛋白，该融合蛋白由 UAS-Dendra2-α-tubulin 转基因表达。 (A) 光转化实验示意图。C4da 神经元的细胞体位于外周，其轴突经由节段神经延伸至神经索内形成突触末端。利用汞灯配合标准 DAPI 滤光片进行 6 秒紫外照射，对动物后半部分某些细胞体内的 Dendra2-α-tubulin 进行光转化（左图示意图）。经过一段时间后，可在腹侧神经索的突触末端检测到光转化后的 Dendra2-α-tubulin，表明微管蛋白已实现长距离（约 1–2 mm）运输。比例尺 = 1 mm。 (B) IV 类感觉神经元细胞体中 Dendra2-α-tubulin 在光转化前与光转化后的示例图像。比例尺 = 5 µm。 (C) 在细胞体光转化后 0 小时或 48 小时，IV 类感觉神经元突触末端的示例图像。随着时间推移，光转化后的 Dendra2-α-tubulin 特异性出现在突触末端，表明该蛋白从细胞体运输至轴突末端。所有时间点的光转化与成像均在幼虫芯片中完成。比例尺 = 15 µm。 点击此处查看高清图像。

视频 S1. C4da 神经元的激光显微手术与钙成像。 采用脉冲紫外激光切断一条初级树突分支。激光切断后，GCaMP 荧光强度迅速升高，信号起始于损伤部位，并向胞体方向传播。GCaMP3.0 的表达通过 C4da 特异性的 ppk-Gal4 驱动子¹⁸在 UAS-GCaMP3.0 系统中实现²⁶。视频经伪彩处理以显示 GCaMP3.0 的相对强度水平。时间序列成像采用转盘共聚焦显微镜以每秒 5 帧的速度进行。

视频 S2. 运动神经元中ANF-GFP的快速轴突运输。
利用eve-RRa-Gal4驱动子²²，在特定运动神经元中表达与GFP标记的鼠心房利钠肽ANF，即UAS-ANF-GFP²¹。使用转盘共聚焦显微镜，在幼虫芯片上以每帧300毫秒的时间分辨率对这些肽能囊泡在幼虫节段神经内的运输过程进行成像。

补充图1（DXF 文件）
用于硅模具制造的 DXF 文件。该文件适用于在 4 英寸硅片上制作负性光刻胶掩模（SU-8 的暗场掩模）。第二行包含 5 个用于制备本实验方案中幼虫芯片的模具。第二行中的每个芯片包含一个约 5.4 mm × 1.5 mm 的腔室，专为容纳早期 3^龄幼虫设计。第一行（第1行）包含一个较大的腔室（约 5.4 mm × 2 mm），而第三行（第3行）包含一个较小的腔室（约 4.4 mm × 1.5 mm），可分别用于较大或较小尺寸的幼虫。比例尺 = 2 mm。点击此处下载该图。

讨论

制备或获取幼虫芯片：

幼虫芯片由一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）模块（称为“PDMS芯片”）连接至玻璃盖玻片构成。步骤1中的方案描述了制作和使用幼虫芯片的流程，前提是已有SU-8模具。SU-8模具是通过光刻技术在硅晶圆上图案化一层140 μm厚的SU-8光刻胶而微加工制成的（详细方法见Ghannad-Rezaie et al.¹²）。由于SU-8模具的微加工需要使用专用设备，我们建议从微加工平台（例如密歇根大学的LNF平台¹⁴）订购，或向代工厂提供随附补充文件提供的芯片设计图以定制生产。 如果需要修改PDMS芯片的设计（例如用于不同大小的幼虫），可使用支持DXF文件的CAD软件（例如AutoCAD）进行调整。此外，也可根据Mondal et al.²⁷ 中的说明在实验室内部自行制作SU-8模具。许多读者可能会发现，在自行制作芯片之前，先获取一个PDMS芯片样品来试用该技术更为方便。样品将在提出请求后免费提供。

使用微流控“幼虫芯片”进行活体成像：

幼虫芯片中的固定方法无需使用麻醉剂，而是通过施加真空压力来限制动物的活动。尽管动物在芯片中固定数小时仍可存活¹²，但仍建议采用较短的固定时间（5–15 分钟）。这段时间足以对多种感兴趣的细胞事件进行成像，包括细胞内钙离子变化或快速的轴突运输过程。同时，也足以在活体动物中完成所需的操作，例如基于激光的显微手术、光漂白和光转化。

为了在单个动物体内对事件进行长期的纵向研究，可将动物放入芯片中并进行多次成像，每次成像之间安排休息期。成像间期使用葡萄汁琼脂平板作为休息环境最为理想，因其可提供简便的食物来源和适宜湿度。多次成像确实会在一定程度上影响幼虫的存活率，因为每次成像过程均存在对动物造成损伤的风险（参见下文“故障排除”部分第2点）。在两天时间内，动物通常可接受超过>5次的成像，且存活率高于50%。由于实验过程中未对动物实施麻醉，因此在芯片中真空释放后，动物可立即恢复健康状态并自由活动。因此，成像之间无需设置恢复时间，各成像时间点之间的间隔具有灵活性，可根据实验目标进行调整。

问题排查：

幼虫芯片最常见的技术问题及推荐解决方案如下：

(1) 动物活动过多。 活动性过强会干扰成像目标。在幼虫芯片中，最常见的原因有：a）动物体型过小，不适用于该芯片；b）固定步骤中施加的负压不足。本实验方案所述的幼虫芯片专为早期三龄^rd 龄幼虫。动物的最佳尺寸为3.5-4 mm（沿前后轴方向）。为确保真空压力足够，需拉动注射器2-2.5 ml，或拉至手柄处感受到阻力为止。判断真空是否有效的指标之一是：可在外围通道中观察到微小气泡缓慢向真空源方向移动。另一指标是：当从顶部提起芯片时，盖玻片应始终随芯片一起移动（此为幼虫定位完成且开启真空后转移腔室的推荐方法）。若管路存在裂纹或管内有油渍，可能导致真空失效。此问题可通过更换23 G分配针头和聚乙烯-50管路（参见步骤1.6-1.14）轻松解决。

（2）动物在芯片成像后死亡。 该操作旨在尽量减少对动物的应激，野生型基因型的动物即使在芯片上固定一小时后，其存活率仍超过>90%¹²。由于某些基因型可能对芯片带来的应激更为敏感，因此应首先确认野生型动物（例如，Canton S）能够耐受该固定技术。a) 导致死亡最常见的原因是幼虫位置不正确（见图2G-H）。如果表皮、头部或气管部分未完全位于腔室内，则在固定过程中可能受损；体型过大（超过>4 mm）的幼虫在芯片中存活的可能性较低。b) 较少见的致死原因是加载芯片时施加了过大的压力或真空度。当幼虫在芯片中正确放置后，所产生的真空压力通常可被良好耐受；但过高的压力，无论是来自真空本身，还是在初始放置动物阶段施加的压力，均可能导致问题。最佳方式是通过使用正确大小的野生型幼虫进行多次试验，经验性地掌握所需压力的程度。 c) 若过多的卤代烷油覆盖幼虫气管，可能影响其长期存活。油在芯片中具有多种重要作用：有助于形成真空、改善成像时的光学性能，并防止芯片内样本干燥。但应避免使用过量油。过多的油还可能导致油进入管路和注射器，从而破坏真空。建议的操作流程是仅在幼虫腹侧涂覆一层油，然后将其转移至洁净的盖玻片上以去除多余油分，再移至最终用于成像的盖玻片上。d) 成像过程可能导致光毒性。与所有活体成像应用一样，理想的做法是采用短曝光时间和低强度激光，这可通过使用高灵敏度相机或探测器实现。应尽量减少紫外光照射，包括汞灯光源产生的宽谱光。

其他问题与未来发展方向：

由于该方法不使用麻醉剂，动物的心脏会持续跳动。这导致一定程度的不可避免的移动，从而在某些位置对成像造成比其他位置更大的影响。 本文中的示例表明，腹神经索、节段神经和体壁可以在不受心跳干扰的情况下被清晰成像。在心跳影响成像的情况下，有时可在分析软件中对这种规律性运动进行校正（例如 ImageJ 的 Image Stabilizer 插件）。当目标物体的运动速度较快（例如快速轴突运输约为 ~1 μm/sec ）或非常缓慢（数分钟至数小时）时，该方法效果较好。然而，当感兴趣的目标以多种速度和方向运动时，校正由心跳引起的运动将变得更加困难。

另一个问题是动物之间或同一动物在芯片上多次成像过程中光学条件存在轻微差异。目标结构在动物体内的深度越大，这种差异就越显著。通常情况下，节段神经和腹神经索在动物体内过深，无法在常规显微镜下清晰成像。然而，幼虫芯片施加的轻微压力可使这些结构被推近至表皮和盖玻片附近。这些结构与盖玻片之间的具体距离在不同实验之间会存在微小变化。而对于靠近表皮的结构（如感觉神经元的细胞体），其变异程度较小。 因此，在进行强度测量时，尤其需要使用大量动物样本和独立重复实验，以消除光学条件变异带来的影响。

尽管此处展示的示例主要关注神经元内的过程，但该方法也可用于成像动物体内任何可置于物镜聚焦深度范围内的结构。这包括角质层、体壁肌肉及其神经肌肉接头（NMJs）。动物腹侧的气管以及消化道的某些部分也可能被成像。动物也可背侧朝向盖玻片，以进行靠近背侧表面结构的短期成像。对动物体内深层结构的成像能力受限于所用显微镜物镜的工作距离。例如，高倍率（如 40X）物镜无法触及诸如成虫盘之类的结构。

本方案中描述的幼虫芯片适用于早期3^rd龄幼虫阶段（大小范围为3.5–4 mm）的幼虫。然而，许多有趣的研究问题需要在不同的幼虫阶段进行成像。利用相同原理，可轻松设计出适用于2^nd龄幼虫的更小芯片，或适用于晚期3^rd龄幼虫的更大芯片。（补充图1包含一个可直接修改的DXF文件，用于制作腔室尺寸不同的硅胶模具）。这种可逆密封的基本原理甚至可应用于其他生物体，如C. elegans或斑马鱼，主要变化在于腔室尺寸。一个有价值的未来方向是设计一种能够同时固定多个动物的芯片，用于筛选实验。 然而，为此，芯片设计需与当前装置有显著不同，因为每个动物在芯片中的定位问题都需要独立解决。

用于研究幼虫外周神经损伤反应的神经挤压实验：

此处所述的幼虫节段神经挤压实验是一种用于对周围轴突造成损伤的简单方法 黑腹果蝇该方法的优点包括：a）使用实验室常见的标准工具即可简便操作 果蝇 实验室（体视显微镜 CO₂ b) 可快速对大量动物进行操作，使得损伤后对神经索进行生化分析成为可能¹⁴；c) 该损伤引发的分子与细胞反应具有高度可重复性^14,15,28 并可用于发现对脊椎动物神经元同样重要的过程^29,30.

损伤神经元的另一种方法是聚焦高能激光，例如脉冲紫外激光或飞秒激光，通过激光显微手术切断轴突^17,31-33。幼虫芯片是用于定位动物以进行此类显微手术的理想方法。然而，由于不同实验之间存在上述光学系统的微小差异，基于激光的方法在幼虫中较难重复，特别是在幼虫节段神经中。此外，基于激光的轴突损伤需要更多时间来逐一定位每只动物，因此难以在大规模（大量动物）实验中实施。

问题排查：

神经挤压实验中最常见的技术问题是因内脏器官受损导致的死亡。进行挤压操作时，应注意避免夹到腹神经索、唾液腺或肠道。同时应避免刺破体壁。通过将镊子以45°角接近体壁表面，可最大程度避免上述问题（见图3）。

镊子的质量对夹闭效果及术后存活率有显著影响。我们推荐使用 Dumostar 5 号镊子。为保持其锋利度，必须小心操作，避免用于其他用途，并在镊子变钝或弯曲后及时更换。

动物的体型也可能影响挤压的效果。体型较小的动物（长度小于3 mm）在受伤后存活的可能性要低得多。而对于较大的动物（游走期3^rd龄幼虫），更难准确定位神经，且容易损伤较大的唾液腺和肠道；此外，在化蛹前可用于研究损伤反应的时间也更短。神经挤压操作最适合在早期3^rd龄幼虫（沿前后轴长度约为3–4.5 mm）中进行。

动物所食用的培养基可能会影响其角质层的强度以及受压后的存活率。建议使用标准的酵母-葡萄糖配方培养基来培养动物。

有效掌握压碎操作的最佳方法是在大量动物个体上进行练习，初期应以压碎后24小时动物存活（而非化蛹）为主要目标。初学者通常存活率较低（例如 10%），但一旦掌握该技术，存活率可达到约90%。

其他问题与未来方向：

压伤实验为研究损伤部位近端轴突的出芽以及远端轴突和突触的退变提供了一种强有力的方法。尽管不同神经元类型的退变速率存在差异，但在同一种神经元类型中具有高度可重复性，这证明了该损伤实验的可重复性。

相比之下，近端轴突中观察到的“再生性”出芽反应更难以研究。节段神经中的所有轴突都会在损伤部位附近启动广泛的出芽（例如参见图6和图3）。然而，不同神经元之间的出芽程度存在差异，且难以量化。 当使用脉冲紫外染料激光对节段神经中的单个运动神经元造成更局限的损伤时，也可观察到类似程度和变异性的出芽现象。我们认为，出芽方向缺乏特异性是由于节段神经中缺乏引导信号所致。相比之下，靠近胞体处被激光损伤的感觉神经元轴突会沿原有轴突的方向进行新的轴突生长³⁴。动物该区域的轴突可能暴露于更特异的位置信息中，从而为再生轴突提供导向。节段神经内部的环境与轴突在胚胎发育过程中最初所经历的引导环境很可能相差甚远，因此预期其不具备指导再生轴突生长的信息。

使用节段性神经 crush 实验研究再生的另一个局限性在于，受损的感觉神经元和运动神经元轴突仍需延伸相当的距离（0.25–1 mm）才能到达其靶标，且时间窗口有限（<3天）后，动物开始化蛹。最近一项研究发现，通过基因操控促胸腺激素受体，可使该3^rd 龄幼虫期³⁵这种操作将显著延长研究神经元损伤后恢复与退变过程的时间窗口，从3天延长至9天。这段时间可能足以观察到一些新事件，例如受损轴突与其突触后靶标的重新连接，尤其是在损伤部位靠近突触末端时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 聚乙烯管	Fisher Scientific	14-170-11B	聚乙烯管，内径 = 0.023 英寸，外径 = 0.038 英寸
1 mm 聚氨酯管	Fisher Scientific	BB521-63	聚氨酯管，内径 = 0.063 英寸 ，外径 = 0.125 英寸
接头式接头（barb to barb connector）	Bio Rad	732-8300	0.8 mm 接头式接头
三通旋塞阀	Bio Rad	732-8104	用于注射器的螺旋阀
注射器（20 ml）	Fisher Scientific	14-817-33	可螺旋连接的 20 ml 注射器，用于 产生真空
分配针头，23 G（0.4 mm 内径，0.6 mm 外径）	McMaster-Carr	75165A684	用于出口连接的针头
分配针头，21 G（0.6 mm 内径， 0.8 mm 外径）	McMaster-Carr	75165A679	用于出口连接的针头
卤碳油	Sigma	H8898	卤碳油 700
Dumostar Number 5 镊子	Roboz	RS-498	用于神经压伤
PDMS 套件（基础剂和固化剂）	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装材料 0.5 kg 套件，透明
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-544-C	24 mm × 40 mm（厚度根据显微镜物镜推荐选择）
一次性塑料杯（9 盎司）
塑料咖啡搅拌棒
剃须刀片
葡萄汁琼脂平板			配方见 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925