一种用于在清醒行为动物中植入有序排列的微丝电极阵列以进行单细胞记录的操作流程

摘要

植入有序排列的微丝阵列用于单细胞电生理记录面临诸多技术挑战。 本文描述了实施该技术的方法及所需设备。 此外，还讨论了利用有序微丝阵列以高空间选择性记录不同神经亚区活动的优势。

摘要

在体电生理记录技术可在清醒、自由活动的动物中实现单细胞水平的神经信号研究，是一种强大的研究手段。该技术使研究者能够观察特定时间与脑区的放电模式，从而将记录到的动作电位与正在进行的行为相关联。此外，单细胞记录还可与其他多种技术结合，以全面阐释神经功能。本文中，我们描述了用于微丝电极植入的麻醉与术前准备过程。随后，详述了准确将微丝电极阵列植入目标脑区所必需的设备与手术步骤。最后，简要介绍了用于记录阵列中每个独立电极信号的设备。所述的固定式微丝电极阵列适用于长期植入，可在几乎任何行为学实验范式中实现神经数据的纵向记录。我们还讨论了如何追踪电极轨迹以三角定位微丝位置，以及如何将微丝电极植入与免疫组织化学技术相结合，以提高记录结果的解剖学特异性。

引言

电生理记录使科学家能够研究生物细胞的电学特性。在中枢神经系统中，电冲动作为信号传递机制，这些记录对于理解神经功能尤为重要^1-2。在行为动物的单细胞记录过程中，插入大脑的微电极能够记录神经元随时间产生动作电位的变化。

尽管许多技术可用于记录大脑活动，但单细胞电生理学是其中最精确的方法之一，因其可实现单个神经元水平的分辨率。当需要高度空间特异性时，可使用微丝电极靶向脑内特定的亚核团或细胞群3。单细胞记录还具有高时间分辨率的优势，其记录精度可达微秒级别。此外， 体内 清醒记录能够保留完整的神经环路相互作用，涵盖传入和传出投射的自然环境，以及全身性的化学和激素影响与生理参数。神经信号来源于感觉输入、运动行为、认知加工、神经化学/药理学因素，或这些因素的某种组合。因此，为了分离感觉、运动、认知和化学因素的影响，需要精心设计实验，设置有效的条件控制，以便评估上述各类影响因素。总体而言，在动物行为过程中进行记录，可使研究者观察到功能环路中多种信息来源的整合过程，进而建立更为全面的环路功能模型。

单个神经元记录也存在若干缺点，任何实验人员都应了解这些局限性。首先，记录操作可能难以实施。事实上，用于此类记录的前置放大器和植入式微电极所具有的空间与时间特异性特征，也使其容易受到外部电信号（即 电学 "噪声"）的干扰。因此，解决电生理系统中问题的能力依赖于对电生理学原理....

方案

在准备和实施以下操作时，必须采取最高程度的无菌条件（如《实验动物护理和使用指南》⁹ 中所述）。本方案符合《实验动物护理和使用指南》的要求，并已获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。预计后续操作需要 3–6 小时完成。

植入微丝电极阵列：

1. 使用50 mg/kg戊巴比妥钠（i.p.）对动物进行麻醉，并给予10 mg/kg甲基硝酸阿托品（IP；可替换为格隆溴铵）以维持呼吸功能，同时给予0.25 mg青霉素（300,000 U/ml，i.m.）预防感染。
   注意：由于该植入手术持续时间为3-6小时，选用戊巴比妥钠是因为其成本较低，且可减少研究人员接触麻醉剂的时间（例如长时间使用气体麻醉剂可能导致的暴露），同时仍能提供持久的麻醉效果。使用其他麻醉剂替代亦可接受。
2. 在继续操作前，使用尾部夹捏测试确认麻醉是否已生效。
3. 必要时，交替注射盐酸氯胺酮（60 mg/kg，腹腔注射）和戊巴比妥钠（5–10 mg/kg，腹腔注射），以在整个手术过程中维持麻醉状态。
4. 使用#22手术刀片剃除头皮毛发。
5. 用聚维酮碘对剃净的头皮进行消毒。
6. 在头皮四个注射部位皮下注射布比卡因（约1 mg/kg，皮下给药），以实现局部麻醉。等待5–10分钟，使局部麻醉药起效。
7. 在麻醉期间，于眼部涂抹眼用润滑剂以保持湿润。
8. 将动物....

结果

该实验室用于记录电生理信号的设备列表见表3。手术恢复后，通过将一个单位增益前置放大器插入植入式连接器来记录单个神经元信号。该前置放大器通过电缆连接至一个换向器，后者利用电滑环实现自由旋转，同时保持电生理记录不中断。换向器的使用使得受试动物在行为过程中可自由活动，这是该实验制备方法的主要优势之一。信号随后进入前置放大器（增益10倍），用于对每个电极上的信号进行差分放大，参考电极为不显示神经元放电信号的电极，以消除环境噪声。差分记录技术用于放大两个电压之间的瞬时差异。由于两根导线所记录的环境噪声大致相等，其相反的极性可有效实现从神经记录信号中减去环境噪声（图2）。最后，信号经过带通滤波（450 Hz 至 10 kHz；在 1 kHz 处滚降为 -1.5 dB/倍频程，在 11 kHz 处为 -6 dB/倍频程），再放大700倍，随后通过配备A/D采集卡的计算机进行数字化（采样频率为每通道50 kHz），并储存以供离线分析。

在软件中，波形通常采用阈值检测法进行采样。因此，超过设定电压阈值的信号会被数字化并存储。然而，该.......

讨论

细胞外记录是一种强大的实验技术，几乎可以应用于神经科学领域的任何实验准备中。植入后呈有序排列的电极丝，其针体穿过大脑进入目标区域的路径可以被追踪（图5A）。在实验结束后，于未绝缘的微丝尖端制造一个微小损伤，使不锈钢丝在该处析出少量铁沉积物，随后使用5%亚铁氰化钾与10%盐酸的溶液即可精确标记未绝缘微丝尖端的位置（即单个神经元信号的记录位置）（图5A和图5B；蓝色点）。因此，可通过一系列连续的脑切片重建整个电极阵列在脑内的空间位置。最后，上述技术可方便地与免疫组织化学方法结合，以提高记录位置的空间特异性，验证目标区域的定位准确性，甚至可用于研究单一目标核团内部不同亚区之间的差异³（图5B）。

为了实现所需的空间特异性，微丝电极阵列必须经过精心设计和植入。首先，阵列中行与列的间距必须根据目标脑区的具体情况专门设计。若阵列过长或过宽，可能导致定位精度下降，或产生大量电极位于两个相邻核团边界处的情况。同时，微丝间距过密则可能妨碍各个电.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>表1. 手术材料清单
纱布	Fisher（MooreBrand）	19-898-144
棉签	Fisher（Puritan）	S304659
戊巴比妥（Pentobarbital）	Sigma Aldrich	P3761
硫酸阿托品	Sigma Aldrich	A0382
拜耳灵（恩诺沙星）	巴特勒·谢因（拜耳）	1040007
盐酸氯胺酮	巴特勒·谢恩	货号# 023061
聚维酮碘（Povidone-Iodine）	Fisher（佩鲁）	19-066452
立体定位	Kopf	Model 900
电凝器	斯托尔廷	59017
体视显微镜	尼康	SMZ445
牙科钻机	水牛	37800
抑菌生理盐水	Bulter Schein	8973
珠宝商螺丝	斯托尔廷	51457
微丝阵列	微电极	定制（灵活）
接地线	Omnetics	定制插件
牙科丙烯酸树脂	费希尔（BAS）	50-854-402
可吸收缝合线	Fisher（Ethicon）	NC0258473
Puralube（眼用软膏/润滑剂）	费舍尔（Henry Schein）	008897
<强>表2. 手术器械列表
2x 微型镊子	George Tiemann 公司	#160-57	多用途（例如清除颅窗中的碎屑）
2x 镊子	乔治·蒂曼公司	#160-93	多用途（例如打结缝合线）
6 把止血钳	George Tiemann 公司	#105-1125	夹闭并切开切口
1把小型剪刀	乔治·蒂曼公司	#105-411	打结后剪断缝线
1x 组织镊	乔治·蒂曼公司	#105-222	缝合时固定组织
1x 持针器	乔治·蒂曼公司	#105-1259	持针器
1个手术刀柄（配#11刀片）	George Tiemann 公司	#105-80（配 #105-71 刀片）	制作颅骨切口
1x #22 手术刀片	乔治·蒂曼公司	#160-381	剃除头皮毛发
1x 外科刮匙	乔治·蒂曼公司	#160-718	刮除颅骨以清除颅骨上的组织
机械/珠宝匠螺丝	各种	N/A	0/80 × 1/8”
<强>表3. 记录电生理信号所需设备列表
微丝阵列 &和连接器	Micro Probe 公司（美国盖瑟斯堡）	N/A（根据芯片阵列特性确定货号）	颅内植入目标记录区域。根据所需的导线间距和长度定制阵列， 等等.
单位增益探头/前置放大器	M.B. Turnkey Designs（新泽西州希尔斯伯勒）	Proj 1200	神经信号的初始放大；可实现微弱神经信号的传导。
换向器（及可选液体旋转接头）	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	允许动物自由旋转，同时将电信号传递至前置放大器
预扩增仪	M.B. Turnkey Designs（新泽西州希尔斯伯勒）	项目 1198	相对于参考电极差异性放大神经信号。
滤波器与放大器	M.B. Turnkey Designs（新泽西州希尔斯伯勒）	项目 1199	带通滤波器进一步放大差异扩增的信号。
采集计算机	EnGen（美国亚利桑那州凤凰城）	N/A（定制构建）	运行用于行为和神经数据采集的软件和硬件。
A/D 卡	Data Translation（马萨诸塞州，马尔伯勒）	DT-3010	将神经信号数字化以供计算机采样。
数字输入/输出卡	Measurement Computing（马萨诸塞州诺顿）	PCI CTR-05	获取行为输入与输出