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方法文章

一种用于成年斑马鱼视网膜再生研究的新型光损伤模型

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DOI：

10.3791/51017

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2013年10月24日

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

已有多种光损伤方案被用于损伤感光细胞，从而诱导成年斑马鱼的视网膜再生反应。本方案描述了一种改进的方法，适用于有色系动物，并可损伤整个视网膜中绝大多数的视杆细胞和视锥细胞。

摘要

光诱导视网膜变性（LIRD）常用于啮齿类动物和斑马鱼中以损伤视杆和视锥光感受器。在成年斑马鱼中，光感受器变性会触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并产生瞬时扩增的前体细胞。这些前体细胞在迁移至受损区域的过程中持续增殖，最终分化为新的光感受器。目前存在两种广泛应用的LIRD模型，每种模型均导致不同程度的光感受器丢失，并引发相应的再生反应差异。随着越来越多的遗传学和药理学工具可用于研究特定基因在再生过程中的作用，建立一种稳定的LIRD模型变得尤为必要。本文描述了一种LIRD实验方案，可实现视杆和视锥光感受器广泛且一致的丢失，该方法结合了两种先前已建立的LIRD技术。此外，该方案还可拓展应用于色素型动物，从而避免在LIRD研究中需将目标转基因品系维持在白化背景上的需求。

引言

光诱导视网膜变性（LIRD）常用于啮齿类动物和斑马鱼中以损伤视杆细胞和视锥细胞。在成年斑马鱼中，光感受器变性会触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并产生瞬时扩增的祖细胞。这些祖细胞在迁移到受损区域的过程中持续增殖，最终分化为新的光感受器细胞。目前，已有两种广泛应用的LIRD模型，每种模型均导致不同程度的光感受器丢失，并引起相应的再生反应差异。随着越来越多的遗传学和药理学工具可用于研究特定基因在再生过程中的作用，迫切需要建立一种可靠的LIRD模型。本文描述了一种LIRD实验方案，该方案可导致视杆细胞和视锥细胞广泛且一致地丢失，其结合了两种先前已建立的LIRD技术。此外，该方案还可扩展应用于色素型动物，从而避免了在LIRD研究中必须将目标转基因品系维持在albino背景下的需要。

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方案

本方案中描述的所有实验程序均经韦恩州立大学医学院动物使用委员会批准。

1. 暗适应

  1. 将约10条成年白化或有色斑的斑马鱼从常规饲养系统转移到黑暗的封闭环境中。如果有条件，使用斑马鱼饲养模块中内置的暗盒装置，以保持水流正常通过鱼缸。（若无此类系统，可将鱼缸置于完全黑暗的封闭环境中，并确保通过氧气对鱼进行充气供氧）。
  2. 将鱼在黑暗环境中饲养10天。在喂食或向暗盒中添加新鱼时，应尽可能迅速操作，避免使鱼长时间暴露于光照下。

2. 紫外光照射

  1. 确保紫外光源的电源已关闭。从荧光体视显微镜上取下紫外灯丝。
    1. 使用一个倒置的直径为15 cm的玻璃培养皿（或高度相似的约2 cm的物体）作为紫外灯丝的支架。用胶带将培养皿固定在实验台上。
    2. 将紫外灯灯丝固定在倒置培养皿的顶部，调整位置使灯丝末端约有 2 mm 伸出培养皿边缘。
  2. 取一个 250 ml 玻璃烧杯。盖上 ½ 烧杯的底部、侧面和背面用铝箔包裹，确保 "有光泽的" 锡箔的内侧朝向烧杯内部。如果烧杯带有刻度，用锡箔覆盖有文字的一半烧杯壁，使透明的一半烧杯壁暴露。
  3. 从鱼类养殖系统中取100 ml水注入250 ml烧杯中。
  4. 将250 ml烧杯放入4 L烧杯中。向4 L烧杯中加水，直至水位与250 ml烧杯上的100 ml刻度线齐平。
  5. 将最多10只经暗处理的动物加入250 ml烧杯中。用一小片铝箔覆盖250 ml烧杯。
  6. 将整个烧杯装置紧邻紫外灯丝放置，灯丝应接触4 L烧杯的外壁，并对准250 ml烧杯的暴露部分。确保250 ml烧杯位于4 L烧杯底部中央。
  7. 在4升烧杯后方放置一个大型不透明屏幕，以便动物能够接受照射，但防止实验室人员看到紫外灯丝的尖端。警告：务必在打开紫外光源电源之前确保该屏障已放置到位。
  8. 打开紫外光源，设置定时器为30分钟。放置必要的警示标签，以确保实验室人员不会意外暴露于紫外辐射。
  9. 30分钟后，关闭紫外光源。取出装有鱼的250 ml烧杯。注意：如果需要进行多轮紫外照射，在重复照射程序前，需让光源冷却约20分钟。每次照射前，务必用100 ml新鲜系统水替换原有水体。4 L烧杯中的水无需更换。

3. 卤素灯光照暴露

  1. 将鱼从250 ml烧杯转移至1.8 L透明丙烯酸鱼缸中，并加水至溢流刻度线。
  2. 设置卤素灯光照处理区域。从当地五金店获取四个250 W卤素工作灯。将其中两个灯朝同一方向放置，中心间距为29 cm。另两个灯以相同方式排列。
    1. 将第二组灯置于与第一组灯相对的位置，两组灯之间相距约73 cm，形成一个29 × 73 cm的矩形光照处理区域。
  3. 从当地五金店获取一个小风扇，将其放置在两组灯之间的正中央，紧靠光照处理区域外侧。
  4. 在光照处理区域中心位置放置两个盛满水的1.8 L鱼缸，使其与两组灯等距。灯与鱼缸外壁之间的距离应约为29 cm。注意：即使仅在一个1.8 L鱼缸中处理10条鱼，也应采用此布局，两个鱼缸均需使用，以确保每个鱼缸的水温维持在合适范围内。
  5. 在每个鱼缸中放置一个增氧器。
  6. 用透明丙烯酸盖子盖住每个鱼缸，在靠近风扇的一端留出约2 cm的缝隙。调整风扇位置，使其向该缝隙吹风。在一个或两个鱼缸中放入温度计。
  7. 打开光源、风扇和增氧器的电源，持续光照处理最多4天。在光照处理期间不应喂食鱼类，以免影响水质并增加动物应激。
  8. 每日监测温度和水位，将水温维持在30–33 °C。如有必要，调节风扇速度和/或鱼缸与光源之间的距离。
    1. 根据需要补充系统用水，通常每日一次。
    2. 应始终使用健康的成年斑马鱼（通常为6–9月龄），以维持接近100%的存活率。若发现鱼死亡，应立即移除死鱼，并更换整个鱼缸的水。

4. 组织采集

  1. 卤素灯处理开始后 48 小时，将斑马鱼从处理区域中移出。
    1. 配制新鲜的乙醇甲醛固定液（1 份 37% 甲醛，9 份 100% 乙醇）。
    2. 使用过量麻醉剂 2-苯氧乙醇（0.4 mg/L）处死斑马鱼。
    3. 将处死的斑马鱼转移至纸巾上，用弯头镊子摘除眼球。
    4. 将摘除的眼球放入固定液中，并在 4 °C 下过夜保存。
  2. 对眼球进行冷冻保护处理。
    1. 在室温下用 5% 蔗糖 1x PBS 洗涤眼球 30 分钟，然后更换为新鲜的 5% 蔗糖 1x PBS，继续孵育 2 小时。接着，在 4 °C 下用 30% 蔗糖 1x PBS 过夜洗涤眼球。随后，在 4 °C 下用组织冷冻介质与 30% 蔗糖 1x PBS 按 1:1（等体积）混合液过夜洗涤眼球。
  3. 将眼球包埋于 100% 组织冷冻介质中，并在 -80 °C 下保存。包埋时应调整眼球方向，以便后续在背腹轴方向进行冷冻切片。
  4. 对组织进行冷冻切片并贴附于载玻片上。将载玻片在 55 °C 下温育 2 小时。切片载玻片可于 -80 °C 保存，或立即进行常规免疫组织化学染色。
  5. 对切片组织进行常规免疫组织化学染色，并使用荧光显微镜成像40,51。

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结果

此前描述的联合光照处理方案与每种单独的LIRD方法进行了比较。在黑暗处理的成年白化动物中（图3-5），每种单独的光照处理均导致视杆（图3）和视锥（图4）光感受器显著丢失。然而，这两种单独处理主要损伤视网膜背侧半部的光感受器，而腹侧视网膜则相对受到保护，免受光照处理的影响（图3和4）。此外，与卤素光照处理相比，紫外光照处理在视网膜背侧半部造成更多的视锥光感受器损伤（分别比较图4B与4C）。联合使用紫外光和卤素光照处理导致整个视网膜中视杆和视锥光感受器的丢失程度显著增加，基本消除了视网膜腹侧半部的神经保护作用（图3和4）。与单独的LIRD方法相比，采用联合光照处理方案时，在腹侧视网膜也观察到相应的细胞增殖增加（图5）。

由于视网膜色素...

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讨论

本文展示了短时间紫外线照射与持续强光照射相结合，可导致广泛的感光细胞丢失，并引发强烈的再生反应。与单独的LIRD方法相比，这种联合方法也是损伤视网膜两侧视杆细胞和视锥细胞最有效的方案。重要的是，该处理方法在有色动物以及albino动物中均有效。

尽管我们提供的证据表明，与单独的LIRD方法相比，联合方案可导致更广泛且更一致的损伤，但在选择LIRD范式之前，仍需讨论相关的科学考量。我们的数据表明，当收集整个视网膜组织用于分析时，应采用联合方法即 蛋白质组学、实时PCR）。我们发现，联合方法产生的病灶面积最大，其次是卤素照射，最后是紫外照射。我们建议，在研究可能对视杆细胞和视锥细胞再生产生差异性影响的基因或通路时，也应采用联合方法。如果由于实际原因无法实现，我们的数据表明，若分析仅限于背侧中央视网膜，则紫外照射是这些研究中的次优方法。

选择合适的LIRD方法时，还需考虑一些实际因素。首先需要关注的是必要设备的成本。所有实验方案均需要较长的暗适应时间（数据未显示）。虽然将自成一体的暗室集成到斑马鱼...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Xixia Luo 在鱼类饲养和技术支持方面的出色工作。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R21EY019401（RT）和 P30EY04068（RT），以及 RT 获得的启动资金，其中包括由“预防失明研究”组织向韦恩州立大学眼科系提供的无限制资助。JT 获得了韦恩州立大学研究生院提供的 Thomas C. Rumble 研究生奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
紫外光源LeicaEL600
玻璃培养皿（150 × 20 mm）Sigma-Aldrich/PyrexCLS3160152BO
250 ml 玻璃烧杯Sigma-Aldrich/PyrexCLS1000250
4 L 玻璃烧杯Sigma-Aldrich/PyrexCLS10004L
铝箔Fisher01-213-105
250 W 卤素灯Workforce265-669
1.8 L 透明丙烯酸水箱AquaneeringZT180T
1.8 L 透明丙烯酸水箱盖AquaneeringZT180LCL
风扇HoneywellHT-900
曝气器Tetra77853-900
温度计Cole-ParmerYO-08008-58
弯头镊子（5/45）World Precision Instruments504155

参考文献

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