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方法文章

Aplysia 神经节制备用于单个神经元的电生理学与分子分析

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⸱

DOI：

10.3791/51075

⸱

2014年1月13日

 ,  , 
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

本文内容

摘要

海兔 Aplysia californica 被广泛用作神经生物学模型，以研究行为的细胞和分子基础。本文介绍了一种用于探索 Aplysia 神经系统的方法，以便对已鉴定神经回路中的单个神经元进行电生理学和分子分析。

摘要

神经生物学的一个主要挑战是理解支配特定行为的神经回路的分子基础。一旦确定了特定的分子机制，就可以开发新的治疗策略，以治疗因神经系统退行性疾病或衰老导致的特定行为异常。Aplysia californica（一种海洋海兔）非常适合用于研究行为的细胞和分子基础，因为其特定行为所依赖的神经回路易于确定，且回路中的各个组分也易于操控。Aplysia 的这些优势已促成了学习与记忆神经生物学领域的多项基础性发现。本文描述了一种用于对单个神经元进行电生理学和分子分析的 Aplysia 神经系统的制备方法。简言之，从神经系统中分离出神经节后，用蛋白酶处理以去除神经节鞘膜，从而使神经元暴露出来，同时保持其在完整动物体内所具有的神经活性。该制备方法可用于对单个或多个神经元进行电生理记录。重要的是，在采用简单方法完成记录后，可直接从神经节中分离神经元，用于基因表达分析。这些实验方案已被用于同时对 L7 和 R15 神经元进行电生理记录，研究它们对乙酰胆碱的反应，并定量分析从 Aplysia 中分离的单个 L7、L11、R15 和 R2 神经元中 CREB1 基因的表达水平。

引言

人脑极为复杂，拥有近1000亿个神经元以及数万亿个突触连接。脑内还存在数量几乎相当的非神经元细胞，这些细胞与神经元相互作用并调控其功能。神经元被组织成不同的神经环路，调控特定的行为。尽管在脑功能和神经环路研究方面已取得诸多进展，但目前对控制特定行为的环路组分的具体身份仍知之甚少。明确神经环路中各个组分的身份，将极大促进我们对行为的细胞与分子基础的理解，并有助于开发针对神经精神疾病的新治疗策略。

海洋蜗牛 Aplysia californica 一直是确定特定行为背后神经回路的重要工具1-14。该 Aplysia 神经系统包含约20,000个神经元，这些神经元被组织成9个不同的神经节。该神经元 Aplysia 体积较大，可根据其大小、电学特性以及在神经节中的位置轻松识别。 Aplysia 具有丰富的可研究行为，其中一种被广泛研究的行为是鳃缩反射（GWR）。该反射的中枢组成部分位于腹部神经节。GWR神经回路的组成部分已被绘制，并确定了各部分的功能。重要的是，GWR神经回路可发生联想性和非联想性学习5,6,15-19数十年来对这一反射的研究还确定了若干在学习和记忆中起关键作用的信号通路20-24.

为研究记忆存储的细胞与分子基础，已采用多种不同的海兔（Aplysia）制备方法。这些方法包括完整动物2,3、半离体制备1,7,13,14,16以及神经回路主要组分的重建25-29。本文描述了一种简化制备方法，用于对海兔（Aplysia）神经节进行电生理学和分子分析，以研究已鉴定的神经元回路。本研究观察了以下四种已鉴定的神经元：R15（一种爆发性放电神经元）、L7 和 L11（两种不同的运动神经元）以及 R2（一种胆碱能神经元）。R2 是无脊椎动物神经系统中体积最大的神经元。该方法主要包括对神经节进行蛋白酶处理、药理学干预前后进行电生理记录，以及分离单个神经元以进行基因表达的定量分析。该方法使我们能够将分子分析与对多个神经元的同步记录相结合。该方法已成功用于通过成对细胞内记录研究 R15 和 L7 神经元对乙酰胆碱（Ach）的反应。在完成电生理记录后，进一步分离 R15、L7 以及其他已鉴定的神经元（如 L11 和 R2），进行定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，检测 CREB1 的表达水平；CREB1 是一种对记忆存储至关重要的转录因子。

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方案

1. 腹神经节的制备、电生理学测量及从腹神经节中分离单个已鉴定神经元 Aplysia californica

  1. 在实验室水族箱中，使用循环的人工海水（ASW），于 16 °C 及 12:12 光照:黑暗条件下饲养 Aplysia。
  2. 腹神经节的分离。
    1. 通过注射 380 mM MgCl2 溶液对动物进行麻醉，持续 5–10 分钟 （相当于动物体重的 30–35%）。
    2. 根据腹神经节在中枢神经系统中的位置进行识别24,28。
    3. 通过手术取出神经节，并立即储存在由 450 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM CaCl2、55 mM MgCl2、2.5 mM NaHCO3 和 10 mM HEPES 组成的人工海水中（pH 7.4）。
  3. 蛋白酶处理。
    1. 将腹神经节置于培养皿中，在上述人工海水（ASW）中稀释的 0.1% 蛋白酶（dispase）溶液中，于 34 °C±0.5  条件下孵育 30 分钟 。
      注意：所用蛋白酶的量需根据动物的年龄和体重进行标准化。通常，年龄较大、体型较大的动物需要更多的蛋白酶。
  4. 去除神经节鞘膜。
    1. 酶处理后，将神经节固定在细胞记录室的 Sylgard 硅胶基底上（直径 Ø = 1 cm；体积 = 0.3 ml），并在室温（18 °C±2）下以 150 μl/min 的流速灌注 ASW。
      注意：为提高已识别神经元的可见性，可将神经节置于聚碳酸酯玻璃圆柱体（图 1）（直径 Ø = 2 mm，经改造的记录室）顶部，以便使用体视显微镜从底部进行照明，放大倍数为 20X 和 40X 。
    2. 使用镊子和显微剪小心地去除神经节表面的鞘膜。
  5. 同时记录两个神经元的电生理活动。
    1. 识别目标神经元。
    2. 使用一支细胞内尖锐微电极（电阻为 10–15 MΩ，内充 3 M KCl 溶液）穿刺神经元。
    3. 使用细胞内记录系统记录神经元活动（带通 10 kHz）。
    4. 使用 Axograph 等电生理软件处理记录数据。
      注意：可轻松实现多个神经元的同时记录。神经元 L7、L11 或 R15 和 R2 可根据其位置轻易识别。同时记录两个 L7 和 R15 神经元需要两个放大器和两个显微操作器（图 2）。
  6. 药物施加。
    1. 通过轻柔移液将所选药物加入细胞记录室，或直接注入神经元内。
    2. 进行电生理测量。
      注意：根据实验目的，可在药物施加前、施加期间和施加后测量神经元的不同电生理参数，例如膜电位（MP）或动作电位（AP）的变化。
  7. 单个神经元的分离。
    1. 电生理实验结束后，停止 ASW 灌注，并用 100% 乙醇清洗神经节。 乙醇处理可使神经元硬化，便于使用精细镊子从神经节中分离单个神经元，同时不损伤其他神经元。
    2. 在体视显微镜下分离单个神经元，并转移至含有 500 μl 冰冷 RNA 提取试剂的小型 Eppendorf 管中。分离的单个神经元可在 RNA 提取试剂中于 -80 °C 保存，以供后续分析。

2. 单个神经元RNA提取及通过定量实时PCR（qPCR）进行基因表达分析

  1. 为最大限度减少 RNA 降解的注意事项：
    核糖核酸酶（RNases）会降解RNA，是一类非常稳定且具有活性的酶。在操作RNA时，请采取以下步骤。
    1. 用RNase失活剂清洁工作区域和仪器。
    2. 处理RNA时应始终佩戴手套，并经常更换手套。
    3. 使用无RNase的塑料制品处理RNA。
  2. 从单个神经元中分离总RNA：
    1. 采用标准的Trizol法提取RNA可用于分离单个神经元中的RNA。简要步骤如下：向Trizol中加入20%（v/v）的氯仿，短暂涡旋充分混匀。
    2. 将试管置于旋转器上，旋转10分钟 在 4 °C 下，以 12,000 x g 离心 Trizol-氯仿混合液 15 分钟 4 °C下
    3. 收集水相并转移至新管。
    4. 加入乙酸钠溶液（pH 5.5）至终浓度0.3 M，加入共沉淀剂GlycoBlue至终浓度100 ng/ml，再加入2.5倍体积的100%乙醇以沉淀RNA。
    5. 充分混匀样品，于 -80 °C 过夜孵育。
    6. 在 12,000 × g 条件下离心 20 分钟 在 4 °C 下，管底会出现一个微小的蓝色沉淀。
    7. 移去上清液，加入850 μl预冷的75%乙醇，在12,000 x g离心10分钟，洗涤沉淀 在 4 °C 下。
    8. 小心移除上清，将RNA沉淀在空气中干燥，最多7-10分钟。
      注意：确保RNA不要长时间晾干，以免影响其完整性。 结束-干燥 RNA沉淀使得溶解 非常 困难。
    9. 干燥后，将RNA沉淀重悬于10 μl无RNase的水中，并测定RNA浓度。
      注意：使用分光光度计测定RNA浓度。如不立即使用，请将RNA储存于-80 °C。
  3. 单个神经元的aRNA合成：
    1. 使用市售的线性RNA扩增系统对RNA进行扩增（根据实验目的扩增一轮或两轮）。
      注意：单个神经元的总RNA量约为10-60 ng。第一轮扩增的预期产量为约100-300 ng，第二轮扩增的预期产量为约0.8-1.5 μg RNA。
  4. RNA的逆转录：
    1. 使用1.0 μg aRNA进行20 μl的反转录反应以生成cDNA。市面上有多种适用于此目的的试剂盒。

      注意：cDNA 的合成按照制造商的说明书，使用以下热循环仪设置进行。
      5 分钟 在 25 °C 下
      30 分钟 在 42 °C
      5 分钟 在 85 °C
      4 °C 保存
    2. 逆转录步骤完成后，将cDNA于-20 °C保存以长期储存。
  5. 引物设计与标准化：
    目前有多种优秀的免费软件程序可用于设计实时扩增引物。
    1. 选择可产生70-110 bp扩增子的18-24 mer寡核苷酸，并通过商业来源合成引物。
      注意：每个目的基因应设计两到三对引物。每对引物均需通过qPCR进行标准化。用于基因CREB1的正向与反向引物对如下：图4如下：

      引物组 1
      正向引物：5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      反向：5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      引物组 2
      正向：5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      反向引物：5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. 通过qPCR监测Ct值和扩增曲线的形状，以选择适用于下游分析的最佳引物。
      注意：在40个循环扩增中，Ct（循环阈值）值介于10至35之间，且在PCR指数扩增期呈现平滑扩增曲线，随后进入平稳期的引物，适用于基因表达分析。
  6. 定量实时 PCR（qPCR）：
    注意：使用与qPCR仪器兼容的适当试管或板。
    1. 将cDNA稀释至5倍浓度 用无核酸酶水。
    2. 向2 μl稀释后的cDNA中加入8 μl qPCR预混液，其中包含2 μl H2O，5 μl 的 2x SYBR Green 预混液，以及各 1.0 μl 的 10 μM 正向引物和反向引物。
    3. 加样cDNA和预混液后，盖紧管盖并密封反应板。轻轻敲击混匀内容物，然后在1,500 rpm条件下离心30秒。
    4. 继续设置qPCR仪。

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结果

本研究中所用动物的体重范围为100-200 g。根据所述方案，我们对从体重范围为2-5 g至200-300 g的动物中分离出的腹神经节神经元进行了电生理记录和分子分析。

蛋白酶处理的标准化对于在神经节中成功进行神经元的电生理测量至关重要。最初，使用了多种蛋白酶（Dispase）浓度和处理时间，并记录了R15神经元的爆发性动作电位26,31。这些测量结果与直接（不经过蛋白酶处理）从完整神经节记录的结果进行了比较。在后续实验中，采用了能够产生与未经蛋白酶处理而暴露的神经节所获得的爆发性电位相似的蛋白酶浓度（0.1%蛋白酶，见步骤1.3）。

根据所述方案，记录了乙酰胆碱（Ach）作用于R15（一种胆碱能神经元）和L7（一种对Ach无反应的运动神经元）后产生的动作电位（AP）。正如预期，同步的电生理记录显示，Ach可诱导R15发生去极化，而L7的放电活动则无变化。图2展示了将乙酰胆碱（Ach）直接施加到细胞室中的操作。使用微移液管将1 M Ach（体积0.3 μl）直接加入细胞室...

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讨论

神经元R15参与调节心血管、消化、呼吸和生殖系统30。动作电位（AP）呈现规律性的节律性爆发活动是R15神经元的特征。如结果部分所示，R15与L7的成对记录表明，神经节制备物中R15神经元的活性得以保留。R15和L7神经元对乙酰胆碱（Ach）表现出正常的反应。该神经节制备物可维持长达8–10小时 ，并可持续监测其电生理活动。因此，可长期研究短暂暴露于神经递质（局部施加于特定神经元或浴槽中）所产生的电生理效应。此外，还可研究同一神经元在同时或依次暴露于多种神经递质后，对其自身或其下游神经元或两者放电特性的影响。

通过qPCR检测基因表达水平的示例如图4所示。由于单个神经元的RNA含量较低，必须进行体外扩增，以获得足够量的RNA，用于定量多个基因的表达。目前已有商业试剂盒可用于体外转录过程。CREB1转录本的扩增通过获得标准化荧光信号所需的循环次数直接进行定量，即Ct法31。单个神经元扩增得到的RNA足以用于微阵列分析检测大量基因的表达变化32

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披露

作者不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们衷心感谢怀特霍尔基金会的资助支持以及斯克里普斯研究所的启动资金，这些支持使本工作的开展成为可能。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aplysia迈阿密大学海兔资源中心
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
蛋白酶GIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
氯仿MP Biomedicals2194002
100% 乙醇ACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
无核酸酶水AmbionAM9737
MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒AmbionAM1751
qScript cDNA 超级混合液Quanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR 主混合液Applied Biosystems4367659
镊子Fine Science Tools11252-20
剪刀Fine Science Tools15000-08
不锈钢微型固定针 Fine Science Tools26002-10 或
26002-20
Veriti 热循环仪Applied BiosystemsVeriti 热循环仪
5430R 离心机Eppendorf5430R 离心机
7900HT 快速实时 PCR 仪Applied Biosystems7900HT 快速实时 PCR 仪
放大器BRAMP-01RNPI Electronics
数模转换器Instrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
显微操作器Patch StarScientifica

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