利用有机电化学晶体管感知屏障组织的破坏

摘要

有机电化学晶体管与活细胞集成，用于监测胃肠道上皮屏障的离子流。本研究中，通过添加钙螯合剂EGTA（乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸）破坏紧密连接，从而引起离子流增加，并对此进行了测量。

摘要

胃肠道是屏障组织的一个例子，它既能提供物理屏障以阻止病原体和毒素的侵入，同时又允许必要的离子和分子通过。该屏障的破坏可由细胞外钙离子浓度降低引起。钙离子浓度的降低会导致参与屏障封闭的蛋白质发生构象变化，从而增加细胞旁通透性。为了模拟这种效应，使用了钙螯合剂乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）处理一层已知可代表胃肠道的细胞单层。目前已有多种检测屏障组织破坏的方法，例如免疫荧光和 通透性测定。然而，这些方法耗时较长、成本较高，且不适用于动态或高通量检测。也有用于测量跨上皮电阻（TER）的电子方法来评估屏障组织完整性，但这些方法通常成本高且操作复杂。由于屏障组织的完整性是药物研发和病原体/毒素诊断中的关键参数，因此迫切需要开发快速、廉价且灵敏的检测方法。已证明将有机电化学晶体管（OECT）与形成屏障组织的细胞整合，是一种能够动态监测屏障组织完整性的新型装置。该装置能够以无与伦比的时间分辨率和灵敏度，实时检测离子流的微小变化，作为反映屏障组织完整性的指标。这一新方法基于一种结构简单的装置，可适用于高通量筛选应用，并能以低成本进行制造。

引言

胃肠道上皮是屏障组织的一个例子，它控制着分子在机体不同区室之间的通过。上皮由细长的柱状细胞组成，这些细胞通过蛋白质复合物连接在一起，形成一道物理屏障¹，可抵御病原体和毒素，同时允许水分和维持生命所必需的营养物质通过。这种选择性源于上皮细胞的极性，从而形成两个不同的膜结构域：暴露于管腔侧的细胞顶膜面和锚定于下方组织的细胞基底面^2,3。紧密连接（TJ）是存在于上皮细胞顶端区域的蛋白质复合物，属于一个被称为顶端连接复合体的更大结构的一部分⁴。离子穿过屏障组织的途径可分为跨细胞途径（穿过细胞）或旁细胞途径（通过两个相邻细胞之间）。两种途径运输的总和称为跨上皮电阻。顶端连接复合体通过特异性的开闭功能，调控离子和分子在屏障间的通过^5,6。这些蛋白质复合物的功能障碍或破坏通常与疾病相关^7-11。此外，许多肠道病原体/毒素已知会特异性靶向该复合体，从而进入体内并引起腹泻，这很可能是由于屏障处离子/水流动发生大规模失调所致^12-14。屏障组织也可能因细胞外微环境的改变而受到影响。钙黏蛋白（Cadherin）是细胞间黏附的关键蛋白，参与顶端连接复合体的形成。钙离子对于钙黏蛋白正确的结构构象至关重要，细胞外钙浓度降低已被证明会导致细胞间连接破坏，进而打开细胞间的旁细胞通路¹⁵。在本研究中，使用了EGTA（乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸），一种特异性的钙螯合剂，以诱导屏障组织的破损，因其已被证实对旁细胞离子流动具有快速而显著的影响^16,17。该钙螯合剂作用于融合且已分化的Caco-2细胞系单层。该细胞系在细胞培养小室中培养时，能够发育出胃肠道的特征，被制药行业广泛用于药物吸收测试^18,19。

用于监测屏障组织完整性的方法多种多样。这些方法通常基于光学原理，依赖于对已知位于顶端连接处的特定蛋白质进行免疫荧光染色²⁰，或依赖于对一种通常无法透过屏障组织的荧光示踪分子进行定量分析^21,22。然而，无标记方法（i.e. 不使用荧光团/生色团）更为理想，因为使用标记物可能引入人为假象，并常常增加成本和检测时间。近年来，无标记的电学监测方法已成为一种动态监测屏障组织 的新手段²³。例如，近期在电学阻抗谱技术方面的进步推动了一种 commercially available 扫描装置的开发^24,25，该装置可测量跨上皮电阻（TER），即细胞层对离子传导能力的指标。

有机电子学为电子学与生物学的交叉融合创造了独特机遇^{26,27 28,29} 通过使用导电聚合物 能够传导电子和离子载体。一种利用OECT检测屏障组织破损的新技术^30-32 最近被引入。该设备通过与现有评估屏障组织完整性的技术进行对比验证，包括免疫荧光、使用荧光黄（Lucifer yellow）的通透性检测，以及使用Cellzscope的阻抗谱技术。在所有测试的毒性化合物情况下，与上述技术相比，OECT表现出相等或更高的灵敏度，并具有更优的时间分辨率。在该装置中，PEDOT:PSS是一种已被证明具有稳定性和生物相容性的导电聚合物^33,34，用作晶体管沟道中的活性材料。有机电化学晶体管（OECT）由位于导电聚合物沟道两侧的漏极和源极电极组成。随后将该结构与电解质接触，电解质构成器件的必要部分。栅极电极浸入电解质中（图1），当在栅极施加正电压时，电解质中的阳离子被迫进入沟道，从而使导电聚合物去掺杂，并导致源极-漏极电流发生变化。由于晶体管的放大作用，该器件对微小的离子流变化极为敏感。将生长在细胞培养小室上的细胞层置于栅电极与导电聚合物沟道之间。完整的细胞层可作为阳离子进入导电聚合物的屏障，因此，在存在完整单层细胞时，漏极电流减小（图2：从区域a过渡到区域b）。当存在有毒化合物时，屏障组织将逐渐丧失其完整性，导致阳离子进入聚合物薄膜，从而使漏极电流增加（图2：区域 c）。通过该技术，屏障组织的破损可通过漏电流的变化来检测，该变化对应于跨单层细胞离子流的改变。该装置能够实时测量离子流的微小变化，具有前所未有的时间分辨率和灵敏度。该技术在毒理学领域具有应用前景，可用于药物测试、疾病诊断或基础研究，因为屏障模型易于调整和适配。此外，该方法有助于减少动物实验，因为它可实现对 体外 用于替代的模型 体内 测试。

方案

1. PEDOT:PSS 溶液的制备

1. 向 50 ml PEDOT:PSS 中加入乙二醇（提高导电性），体积比为 1:4（乙二醇 : PEDOT:PSS），每毫升加入 0.5 μl 十二烷基苯磺酸（DBSA）作为表面活性剂，以及每毫升加入 10 mg 3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GOPS）作为交联剂，以促进导电聚合物与玻片之间的黏附。

2. OECT 器件制备（图3）

1. 通过剥离光刻法定义热蒸发金源极和漏极接触：
   1. 在普通洁净的玻璃片上以 3,000 rpm 转速旋涂光刻胶 30 秒。玻璃尺寸为 3 英寸 × 1 英寸。
   2. 通过光刻法定义图案。尺寸可调整，但此处列出的尺寸已被证明可实现最佳灵敏度。然后使用显影液进行显影。
   3. 分别蒸发 5 nm 铬和 100 nm 金。
   4. 在丙酮浴中剥离光刻胶 1 小时，仅在基底上保留源极和漏极金接触区域。
2. PEDOT:PSS 通道的所需长度为 1 mm。通过聚对二甲苯-C（Pa-C）剥离技术实现图案化：
   1. 在涂覆装置中装载 3.5 g Pa-C，在具有金接触的基底上均匀蒸发 2 µm 厚的聚对二甲苯-C。
   2. 通过光刻法对通道进行图案化：
      1. 以 3,000 rpm 转速旋涂光刻胶 30 秒。
      2. 使用掩模将通道和金接触区域暴露于紫外光下 20 秒，曝光后的光刻胶将在显影液中溶解。
      3. 使用显影液打开光刻胶上的通道区域。
   3. 通过等离子体刻蚀步骤（氧气（O₂，50 sccm）和四氟化碳（CHF₄，3 sccm）混合气体，功率 160 W）处理 15 分钟，刻蚀通道区域的 Pa-C，以暴露通道和金接触区域。
3. 通过以 500 rpm 转速旋涂 45 秒的方式沉积 PEDOT:PSS 混合溶液。在 110 °C 下烘烤 30 秒。
4. 剥离 Pa-C 层，暴露出下方基底上的 PEDOT:PSS 通道。该通道应与协议 1 中制备的金接触略有重叠。
5. 在大气条件下于 140 °C 烘烤样品 1 小时。

3. 装置组装

1. 按1:10的比例将固化剂与基础溶液混合（通常作为套件一起提供）来制备聚二甲基硅氧烷（PDMS），并在120 °C下烘烤1小时。
2. 使用打孔器设计孔洞，并在目标区域周围切割成方形。
3. 将PDMS孔结构粘附在通道上方，形成约6 mm²的通道区域，确保源极和漏极接触点未被覆盖。
4. 制作一个中间有孔的塑料支撑结构（可使用细胞培养小室的支架），然后将其粘附在PDMS上，静置过夜使其干燥。
5. 通过预先注入水来测试孔结构是否泄漏。
6. 使用锡将导线焊接到源极和漏极接触点上。

4. 细胞培养

1. 按如下步骤制备细胞培养基：
   1. 在DMEM中加入1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.5%青霉素-链霉素和0.1%庆大霉素。
   2. 使用无菌滤器装置对细胞培养基进行灭菌。
2. 将Caco-2细胞在含细胞培养基、37 °C、5% CO₂的湿化环境中培养，传代次数控制在49至68代之间。
3. 每周使用胰蛋白酶消化一次细胞，并以每插入膜1.5 × 10⁴个细胞的密度进行接种。
4. 在3周内每周更换两次细胞培养基。

5. 使用OECT进行测量

1. 将一根 Ag/AgCl 导线连接到源表，用作栅极电极。将导线尖端浸入细胞培养基中（作为电解质），如图 1a所示。
2. 将源极和漏极的导线连接至源表（双通道设置）。
3. 在栅极与源极（用作参比电极：接地）之间施加一个正向方波脉冲电压（V_GS），同时在漏极与源极之间施加一个负的恒定电压（V_DS），并测量相应的电流（I_DS）。
4. 使用运行数据采集程序的计算机。自定义采集程序中输入的 OECT 参数应如下：V_DS = -0.2 V，V_GS = 0.3 V，V_GS 开启时间 = 2 秒，关闭时间 = 28 秒。
5. 读取源极-漏极电流（I_DS）和栅极电流（I_GS）。持续测量数分钟，以确保获得稳定的基线信号。

6. 将细胞与OECT集成以进行测量

注意：实验前，可通过阻抗谱仪测量经皮电阻（TER）以验证细胞层的完整性。每3周龄的Caco-2细胞插入物的TER应高于400 Ω^.cm²。

1. 在OECT测量的关闭期间：将门电极从电解质中取出，插入细胞培养小室，并将门电极置于细胞培养小室内。
2. 对细胞进行数分钟的基线测量，以确保信号稳定。该基线将用于计算对应完整单层细胞（0）的归一化值。

7. 有毒化合物的制备与引入

1. 用去离子水配制1 M的EGTA溶液，先用Tris碱将溶液的pH值调节至7.4。
2. 加入适当体积的 EGTA 溶液以获得所需浓度（例如 在5 mM至100 mM之间，需考虑 体积。EGTA 应在关闭期间加入基础室中。
3. 持续测量90分钟，步骤同方案5。若在室温下进行测量，细胞稳定性在90分钟后将无法保持恒定。
4. 运行结束后，刮除细胞层，彻底破坏屏障层，并继续测量15分钟；此步骤可通过移除滤膜并将门电极浸入培养基中完成。该基线值将用于计算对应于被破坏单层细胞的归一化数值。

结果

在测量的第一步中，漏极电流可能会有轻微波动，但在大多数情况下应保持稳定（图2，部分a）。如果信号不稳定，应弃用该晶体管并更换新的。此稳定性检查还可确保器件的任何初始电导率损失不会影响后续测量。经过数分钟的测量后，将带有形成屏障组织细胞的插入物放置在通道上方。漏极电流应立即下降（图2，部分b）。如果漏极电流未下降，可能表明细胞未能正确形成屏障，或在操作过程中受到损伤，此时应弃用并更换滤膜。通过向屏障组织添加毒性化合物，漏极电流的调制应会根据所用化合物及其浓度而逐步或立即增加（图2，部分c）。

使用源表和定制的数据采集程序收集数据。通过该程序获得不同参数，并在数据分析程序中运行，以获取每个栅极脉冲对应的中点调制值。中点调制对应于峰电流中间时刻的电流值（图4）。在完整单层细胞检测期间获得的中点调制值被归一化为0，而在划痕处理后获得的中点调制值则被归一化为1。归一化结果用于比较不同器件之间的数据（图5）。通过这些数据可以观...

讨论

该技术提供了一种将有机电化学晶体管与活细胞整合以测量屏障组织完整性的新方法。该技术的主要优势在于其快速、灵敏，同时设备成本低，适用于屏障组织的动态监测。

由于该方法使用活细胞，关键的一点是必须确保使用单层细胞，以代表完整的屏障层。屏障的参数应在细胞系的表征过程中确定。因此，当将栅极电极浸入细胞层上方的电解质中时，至关重要的是避免损伤细胞层。

另一个重要问题是器件的制备；PDMS边缘与塑料支架之间不应发生泄漏，以避免液体体积变化。为了获得可重复的结果，还应注意导线的焊接，因为烧毁金电极会导致其与导电聚合物通道接触不良或无接触，从而产生微弱或无信号。

为了便于分析并获得更好的结果，应在实验的每一步之间留出几分钟的间隔，以便设备在各步骤间稳定。由于不同设备之间的信号存在差异，需要对结果进行归一化处理，才能比较每次实验的结果。然而，未来该设备的大规模生产将有望实现更高的设备间重复性。

该技术的主要局限性在于其格式，因为目前只...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 树脂	Cipec Specialties
十二烷基苯磺酸（DBSA）	Acros Organic
3-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）	Sigma Aldrich
24孔悬浮细胞培养插件 Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24孔细胞培养板 BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
高级DMEM，GIBCO品牌	Fisher Scientific	E3434T
FBS 热灭活	Fisher Scientific	E3387M
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）′，N′四乙酸	Sigma Aldrich	E4378
乙二醇，无水，99.8%	Sigma Aldrich
Caco-2 细胞	ATCC
PDMS	道康宁	SYLGARD 184 硅弹性体
Au（99.99%）	NEYCO	AU3X6
铬（99.95%）	NEYCO
聚对二氯苯	Specialty Coating Systems
银/氯化银导线	哈佛仪器公司
光刻胶	Cipec Specialties