利用有机电化学晶体管感知屏障组织的破坏

摘要

有机电化学晶体管与活细胞集成，用于监测胃肠道上皮屏障的离子流。本研究中，通过添加钙螯合剂EGTA（乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸）破坏紧密连接，从而引起离子流增加，并对此进行了测量。

摘要

胃肠道是屏障组织的一个例子，它既能提供物理屏障以阻止病原体和毒素的侵入，同时又允许必要的离子和分子通过。该屏障的破坏可由细胞外钙离子浓度降低引起。钙离子浓度的降低会导致参与屏障封闭的蛋白质发生构象变化，从而增加细胞旁通透性。为了模拟这种效应，使用了钙螯合剂乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）处理一层已知可代表胃肠道的细胞单层。目前已有多种检测屏障组织破坏的方法，例如免疫荧光和 通透性测定。然而，这些方法耗时较长、成本较高，且不适用于动态或高通量检测。也有用于测量跨上皮电阻（TER）的电子方法来评估屏障组织完整性，但这些方法通常成本高且操作复杂。由于屏障组织的完整性是药物研发和病原体/毒素诊断中的关键参数，因此迫切需要开发快速、廉价且灵敏的检测方法。已证明将有机电化学晶体管（OECT）与形成屏障组织的细胞整合，是一种能够动态监测屏障组织完整性的新型装置。该装置能够以无与伦比的时间分辨率和灵敏度，实时检测离子流的微小变化，作为反映屏障组织完整性的指标。这一新方法基于一种结构简单的装置，可适用于高通量筛选应用，并能以低成本进行制造。

引言

胃肠道上皮是屏障组织的一个例子，它控制着分子在机体不同区室之间的通过。上皮由细长的柱状细胞组成，这些细胞通过蛋白质复合物连接在一起，形成一道物理屏障¹，可抵御病原体和毒素，同时允许水分和维持生命所必需的营养物质通过。这种选择性源于上皮细胞的极性，从而形成两个不同的膜结构域：暴露于管腔侧的细胞顶膜面和锚定于下方组织的细胞基底面^2,3。紧密连接（TJ）是存在于上皮细胞顶端区域的蛋白质复合物，属于一个被称为顶端连接复合体的更大结构的一部分⁴。离子穿过屏障组织的途径可分为跨细胞途径（穿过细胞）或旁细胞途径（通过两个相邻细胞之间）。两种途径运输的总和称为跨上皮电阻。顶端连接复合体通过特异性的开闭功能，调控离子和分子在屏障间的通过^5,6。这些蛋白质复合物的功能障碍或破坏通常与疾病相关^7-11。此外，许多肠道病原体/毒素已知会特异性靶向该复合体，从而进入体内并引起腹泻，这很可能是由于屏障处离子/水流动发生大规模失调所致^12-14。屏障组织也可能因细胞外微环境的改变而受到影响。钙黏蛋白（Cadherin）是细胞间黏附的关键蛋白，参与顶端连接复合体的形成。钙离子对于钙黏蛋白正确的结构构象至关重要，细胞外钙浓度降低已被证明会导致细胞间连接破坏，进而打开细胞间的旁细胞通路¹⁵。在本研究中，使用了EGTA（乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸），一种特异性的钙螯合剂，以诱导屏障组织的破损，因其已被证实对旁细....

方案

1. PEDOT:PSS 溶液的制备

1. 向 50 ml PEDOT:PSS 中加入乙二醇（提高导电性），体积比为 1:4（乙二醇 : PEDOT:PSS），每毫升加入 0.5 μl 十二烷基苯磺酸（DBSA）作为表面活性剂，以及每毫升加入 10 mg 3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GOPS）作为交联剂，以促进导电聚合物与玻片之间的黏附。

2. OECT 器件制备（图3）

1. 通过剥离光刻法定义热蒸发金源极和漏极接触：
   1. 在普通洁净的玻璃片上以 3,000 rpm 转速旋涂光刻胶 30 秒。玻璃尺寸为 3 英寸 × 1 英寸。
   2. 通过光刻法定义图案。尺寸可调整，但此处列出的尺寸已被证明可实现最佳灵敏度。然后使用显影液进行显影。
   3. 分别蒸发 5 nm 铬和 100 nm 金。
   4. 在丙酮浴中剥离光刻胶 1 小时，仅在基底上保留源极和漏极金接触区域。
2. PEDOT:PSS 通道的所需长度为 1 mm。通过聚对二甲苯-C（Pa-C）剥离技术实现图案化：
   1. 在涂覆装置中装载 3.5 g Pa-C，在具有金接触的基底上均匀蒸发 2 µm 厚的聚对二甲苯-C。
   2. 通过光刻法对通道进行图案化：
      1. 以 3....

结果

在测量的第一步中，漏极电流可能会有轻微波动，但在大多数情况下应保持稳定（图2，部分a）。如果信号不稳定，应弃用该晶体管并更换新的。此稳定性检查还可确保器件的任何初始电导率损失不会影响后续测量。经过数分钟的测量后，将带有形成屏障组织细胞的插入物放置在通道上方。漏极电流应立即下降（图2，部分b）。如果漏极电流未下降，可能表明细胞未能正确形成屏障，或在操作过程中受到损伤，此时应弃用并更换滤膜。通过向屏障组织添加毒性化合物，漏极电流的调制应会根据所用化合物及其浓度而逐步或立即增加（图2，部分c）。

使用源表和定制的数据采集程序收集数据。通过该程序获得不同参数，并在数据分析程序中运行，以获取每个栅极脉冲对应的中点调制值。中点调制对应于峰电流中间时刻的电流值（图4）。在完整单层细胞检测期间获得的中点调制值被归一化为0，而在划痕处理后获得的中点调制值则被归一化为1。归一化结果用于比较不同器件之间的数据（图5）。通过这些数据可以观.......

讨论

该技术提供了一种将有机电化学晶体管与活细胞整合以测量屏障组织完整性的新方法。该技术的主要优势在于其快速、灵敏，同时设备成本低，适用于屏障组织的动态监测。

由于该方法使用活细胞，关键的一点是必须确保使用单层细胞，以代表完整的屏障层。屏障的参数应在细胞系的表征过程中确定。因此，当将栅极电极浸入细胞层上方的电解质中时，至关重要的是避免损伤细胞层。

另一个重要问题是器件的制备；PDMS边缘与塑料支架之间不应发生泄漏，以避免液体体积变化。为了获得可重复的结果，还应注意导线的焊接，因为烧毁金电极会导致其与导电聚合物通道接触不良或无接触，从而产生微弱或无信号。

为了便于分析并获得更好的结果，应在实验的每一步之间留出几分钟的间隔，以便设备在各步骤间稳定。由于不同设备之间的信号存在差异，需要对结果进行归一化处理，才能比较每次实验的结果。然而，未来该设备的大规模生产将有望实现更高的设备间重复性。

该技术的主要局限性在于其格式，因为目前只.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Clevios pH 1000	Heraus Clevios
AZ9260 树脂	Cipec Specialties
十二烷基苯磺酸（DBSA）	Acros Organic
3-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）	Sigma Aldrich
24孔悬浮细胞培养插件 Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique Dutscher	51705
24孔细胞培养板 BD Falcon	Dominique Dutscher	51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM	Dominique Dutscher	51246
高级DMEM，GIBCO品牌	Fisher Scientific	E3434T
FBS 热灭活	Fisher Scientific	E3387M
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	E3470C
GlutaMAX	Fisher Scientific	E3524T
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	E3513N
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）′，N′四乙酸	Sigma Aldrich	E4378
乙二醇，无水，99.8%	Sigma Aldrich
Caco-2 细胞	ATCC
PDMS	道康宁	SYLGARD 184 硅弹性体
Au（99.99%）	NEYCO	AU3X6
铬（99.95%）	NEYCO
聚对二氯苯	Specialty Coating Systems
银/氯化银导线	哈佛仪器公司
光刻胶	Cipec Specialties