我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。
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摘要
摘要
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的脑肿瘤，目前尚无治愈性治疗方法。
该病理的鼠类模型依赖于在切开硬脑膜后，将胶质瘤细胞悬液注射到脑实质中。然而，为了便于活体双光子显微镜观察，细胞必须进行浅层注射，但浅层注射无法重现疾病的生理病理条件。事实上，大多数肿瘤细胞会通过注射通道逸出，进入硬脑膜外空间，并在缺乏脑实质机械约束的条件下异常快速地增殖。
我们的改进不仅在于将胶质瘤类球体进行局部植入，而非将胶质瘤细胞悬液注射至大脑皮层浅层，还在于使用交联葡聚糖凝胶半珠堵塞注射部位，该凝胶半珠通过氰基丙烯酸酯黏附于周围脑实质，并与硬脑膜密封。这些措施共同确保了肿瘤细胞在脑实质内的生理性扩展与浸润。最后，通过将玻璃窗用黏合剂固定于颅骨上封闭开颅部位，从而可在数周内实现慢性成像，且避免瘢痕组织形成。
利用荧光转基因动物移植荧光标记的肿瘤细胞，我们已证明胶质瘤细胞与神经元之间相互作用的动态过程（例如 Thy1-CFP小鼠）的神经元和血管系统（通过静脉注射荧光染料标记）可在疾病进展过程中利用活体双光子显微镜进行观察。
能够在脑部环境损伤最小的情况下以显微分辨率对肿瘤进行成像，这代表了当前胶质母细胞瘤动物模型的改进，将有助于神经肿瘤学领域及药物测试的发展。
引言
多形性胶质母细胞瘤是成人中最具有侵袭性的脑肿瘤类型，其中位生存期为12个月，5年生存率仅为5%。临床治疗主要依赖手术、放疗和化疗，通常采用联合治疗方案。然而，这些治疗手段的效果仍仅为姑息性1-3。
迄今为止，大多数神经肿瘤学研究依赖的技术只能提供静态视图，并且需要在不同时间点处死大量携带肿瘤的动物（例如参见4,5）。近期发展的基于活体成像的随访方法使得能够在同一动物体内随时间推移研究胶质瘤的生长以及肿瘤细胞与其病理生理微环境之间的相互作用。这为获取以往无法实现的独特信息开辟了途径6. 可利用在特定细胞中表达荧光标签的转基因动物来研究肿瘤细胞之间的特异性相互作用 例如 本文中的神经元.
过去十年中，活体双光子显微镜技术7 已成为基础神经肿瘤学研究和临床前试验的金标准8,9 因其能够对小鼠大脑进行深层活体观测>硬脑膜下500 µm处，具有微米级空间分辨率10采用活体双光子显微镜结合植入慢性颅窗的原位动物模型11可以在同一只小鼠上随时间推移监测肿瘤的进展过程9,12.
然而，这些先前发表的动物模型的一个主要缺点是，它们未能....
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方案
所有实验操作均依照法国法律法规，并遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）关于实验动物的护理与使用规定进行。动物研究已获得罗讷河口省兽医服务局（许可证编号 D-13-055-21）授权，并经普罗旺斯-蓝色海岸伦理委员会批准°14（项目编号 87-04122012）
1. 类球体的制备
- 琼脂糖包被培养皿的制备
- 将1 g琼脂糖与100 ml未添加胎牛血清的细胞培养基混合。使用微波炉（850瓦，加热40秒，随后再加热3次，每次15秒；每次加热之间搅拌溶液）煮沸溶液，使琼脂糖完全溶解。将该1%琼脂糖溶液在120 °C条件下高压灭菌20分钟，以确保无菌。注意：在高压灭菌前务必确保琼脂糖完全溶解。不均匀可能会影响球状体的形成。
- 从高压灭菌器中取出后，向每个100 × 20 mm的培养皿中加入10 ml 1%琼脂糖溶液。在室温下静置20分钟，使琼脂糖溶液完全凝固。
- 在琼脂糖表面加入10 ml PBS以维持湿度。用封口膜包裹琼脂糖包被培养皿的盖子进行密封，防止蒸发。若PBS层能适当保持湿度，培养皿可在4 °C保存长达2个月。
- 球状体培养
- 在75 cm2培养....
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结果
手术操作完成后（图1），可通过荧光显微镜对动物进行数周的观察，直至处死。术后可能会出现炎症反应，但通常在一至两周内消失。可通过多种显微镜技术观察肿瘤生长情况，包括荧光大体成像和双光子显微镜成像（图2）。此处展示的示例图像分别在荧光大体成像系统和双光子显微镜上获得；该双光子显微镜耦合了飞秒脉冲红外可调谐激光器，并经过自主改装，可将动物置于20倍水浸物镜（1.0NA）下方进行成像。
通过结合斜射照明以实现明场反射成像和落射荧光发射的荧光宏观成像系统，随时间评估肿瘤的发育情况（图2A-2C）。对荧光信号进行阈值处理可轻松获取肿瘤区域，而浅表血管则在可见光图像的白色背景下呈现为暗色结构而被识别。另一方面，活体双光子显微镜可实现大视野的z轴层析成像及正交重建，具有亚细胞分辨率（参见 图2D 中的树突结构）。利用在特定细胞中表达荧光蛋白的转基因动物（例如Thy1-CFP小鼠，其神经元表达青色荧光蛋白，在 图2D 中以绿色伪彩显.......
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讨论
该方法可利用光学成像技术，在数天至数周内持续监测原位移植胶质瘤的生长情况。同一动物模型在病理发展过程中可接受几乎任何类型的脑部成像检测；而双光子显微镜的特定制备方法则提供了在活体动物脑内实现亚细胞分辨率的独特机会。本方案的优势在于，可促使肿瘤向脑实质内生长，而非在硬脑膜外生长——若胶质瘤细胞通过受损的硬脑膜逸出中枢神经系统，则可能发生后者情况。在缺乏脑内环境物理约束的情况下，肿瘤细胞确实会增殖更快，因为它们无需浸润脑实质16。既往发表的方法在移植后未尝试封闭硬脑膜，这一问题尤为突出，因为这些方法注射的是细胞悬液而非类球体9,13,14。事实上，细胞悬液难以实现局灶性施用，因为在将移液管从脑深部撤回至硬脑膜的过程中，单个细胞会系统性地沿注射轨迹播散。
本实验方案可应用于多种小鼠品系，包括转基因小鼠和免疫抑制小鼠。可移植并可视化多种胶质瘤细胞系，包括直接来源于人组织活检的细胞，前提是这些细胞在移植前已转染并稳定表达荧光报告基因。手术过程通常可在1小时内完成，可快速获得成组的实验动物。因此，该方法可用于研究血管重塑、药物治疗对血管生成和肿瘤生长.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者衷心感谢 KK Fenrich 博士、M-C. Amoureux 博士、P. Weber 和 A. Jaouen 提供的有益讨论；感谢 M. Hocine、C. Meunier、M. Metwaly、S. Bensemmane、J. Bonnardel、IBDML 动物实验中心工作人员以及 IBDML PicSIL 成像平台工作人员提供的技术支持。本研究得到了法国国家癌症研究院（INCA-DGOS-INSERM6038）向 GR 提供的资助，法国国家科研署（ANR JCJC PathoVisu3Dyn）和大脑研究联合会（FRC）向 FD 提供的资助，以及法国医学研究联合会和 Cancéropole PACA 向 CR 提供的博士后奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钻机 | Dremel (德国) | 398 | 任何高质量的外科骨科钻均可 |
| 钻头（#1/4 碳化钨圆头钻） | World Precision Instruments (美国) | 501860 (#1/4) | 哈佛仪器公司也有销售 |
| 组织剪刀 | World Precision Instruments (美国) | 14395 | |
| Dumont 镊子 M5S | World Precision Instruments (美国) | 501764 | |
| 牙科水泥 | GACD (美国) | 12-565 & 12-568 | |
| 氰基丙烯酸酯 | Eleco-EFD (法国) | Cyanolit 201 | |
| 无纤维玻璃毛细管 | Clark Electromedical Instruments (英国) | GC100-15 | |
| 微量注射器（25 µl） | Hamilton (美国) | 702 | |
| 显微操作器 | World Precision Instruments (美国) | Kite-R | |
| T型接头（三通旋塞阀 - 鲁尔锁） | World Precision Instruments (美国) | 14035-10 | |
| 立体定位仪（小鼠适配器） | World Precision Instruments (美国) | 502063 | |
| 玻璃盖玻片 | Warner Instruments (美国) | CS-5R (64-0700) | |
| 交联葡聚糖凝胶（Sephadex）G50 粗颗粒 100-300 µm | 可从多家供应商处获得，包括 Sigma (德国) | ||
| 眼药膏 | TVM (法国) | Ocry-gel | |
| 荧光体视显微镜 | Leica MZFLIII (德国) | 其他公司也有销售 | |
| 双光子显微镜 | Zeiss LSM 7MP (德国) | 其他公司也有销售（Nikon，…） | |
| 红外可调飞秒激光器（Maï-Taï） | Spectra Physics (美国) | 其他公司也有销售 |
参考文献
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al.
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