利用杆状病毒表达系统表达新型H7N9流感病毒的功能性重组血凝素和神经氨酸酶蛋白

摘要

本文介绍了一种在昆虫细胞中表达正确折叠且具有功能的新型中国H7N9病毒表面抗原的方法。该技术可适用于表达任何病毒或细胞表面蛋白的胞外结构域。

摘要

杆状病毒表达系统是表达重组蛋白的有力工具。本文中，我们利用该系统生产正确折叠且糖基化的甲型流感病毒表面糖蛋白——血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）。以实例而言，我们选择了近年来在中国新出现的H7N9病毒所表达的HA和NA蛋白。然而，本实验方案可轻松适用于其他任何甲型和乙型流感病毒株所表达的HA和NA蛋白。重组HA（rHA）和NA（rNA）蛋白是ELISPOT和ELISA等免疫学检测的重要试剂，也广泛用于疫苗标准化、抗体发现、分离与表征。此外，重组NA分子可用于小分子抑制剂的筛选，并有助于研究NA的酶学功能及其对抗病毒药物的敏感性。重组HA蛋白也正在动物模型中作为实验性疫苗进行测试，且一种基于重组HA的疫苗已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人类。本文所述的分子制备方法简便，可促进流感实验室的研究工作，因其能够快速、低成本地大量生产蛋白。尽管本文重点介绍流感病毒表面糖蛋白，但该方法也可用于其他病毒和细胞表面蛋白的表达。

引言

针对近期在中国出现的新型H7N9流感病毒株，我们首先获取了携带最早两株病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因组序列的质粒。利用这些质粒，我们能够快速构建杆状病毒表达载体，用于在昆虫细胞中表达重组HA和NA蛋白。该表达系统在我们实验室已得到充分验证，并在多项持续进行的研究项目中发挥关键作用^1-8。昆虫细胞能够正确折叠并进行复杂的翻译后修饰，其中包括对多种病毒糖蛋白至关重要的N-连接糖基化。因此，杆状病毒系统被广泛用于表达流感病毒表面抗原也就不足为奇。事实上，已有许多HA和NA的晶体结构是利用昆虫细胞表达的蛋白解析获得的^9-11。该系统的另一优势在于其稳定的高蛋白产量，每升细胞培养物可获得高达30 mg的HA蛋白（基于我们对50多种不同HA蛋白的实验经验），这得益于强效多角体蛋白启动子驱动的病毒感染表达机制。

去除HA和NA蛋白的跨膜区和胞内区，可表达分泌型的可溶性蛋白，从而极大地方便纯化过程。此外，这些胞外结构域带有六组氨酸标签，因此可利用Ni²⁺-树脂通过亲和层析进行纯化。HA和NA蛋白的跨膜区分别参与同源三聚体和同源四聚体的形成。为了维持这些寡聚化状态，我们在HA构建体的C端添加三聚化结构域，在NA构建体的N端添加四聚化结构域（图1）。我们已明确证实，此类三聚化结构域能稳定HA茎部结构域上具有功能性的保守构象表位¹。NA的正确四聚化也可能有助于其正确....

方案

1. 重组杆状病毒的制备

1. 克隆至杆状病毒转移质粒
   1. 将H7 HA和N9 NA胞外域（或其他任何HA或NA基因）克隆至改造后的pFastBac转移质粒中（见引言部分）。已有文献描述了包含C端三聚化结构域和六组氨酸标签的HA载体，以及包含N端四聚化结构域和六组氨酸标签的NA载体^1,10,11,22（图1），可向作者索取。
      说明：若HA胞外域未连接三聚化结构域进行表达，则其折叠将不正确，导致构象依赖性中和表位丢失 ，尤其是在茎区结构域中。同样，NA的酶活性依赖于正确的四聚化。
   2. 杆粒的制备
      按照生产商说明书，使用杆状病毒表达系统将含有HA和NA基因的杆状病毒转移质粒转化至DH10Bac细菌中。根据生产商说明书，使用中量质粒提取试剂盒（Midiprep kit）分离并纯化杆粒（图2）。
2. 重组杆状病毒的拯救及蛋白表达验证
   说明：以下步骤需在超净工作台内无菌操作。对HA和NA（或任何其他目标基因）分别独立进行本实验流程。昆虫细胞通常在28 °C、无CO₂条件下培养。除非另有说明，本方案中Sf9细胞使用完全TNM-FH昆虫细胞培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素^*和....

结果

A/Shanghai/1/13 和 A/Anhui/1/13 的 HA 分子表达良好，产量约为 20 mg/L 培养物。两种毒株的 NA 分子表达水平中等，A/Shanghai/1/13 的 NA 表达量为 0.2 mg/L 培养物，A/Anhui/1/13 为 0.7 mg/L 培养物。四种蛋白制备物的杂质均极少或无杂质（图 8A 和 B），其中 HA 的纯度高于 NA，这可通过表达水平差异进行解释。进一步使用广谱中和性、茎区反应性人源单克隆抗体 CR9114²³ 对 A/Shanghai/1/13 HA 进行 ELISA 分析。该单克隆抗体可结合茎区结构域中的一个构象敏感性表位，本研究中用作检测该结构域正确折叠的探针。抗体显示出良好的结合能力，表明 HA 确实正确折叠（图 8C）。此外，使用抗 H7 小鼠多克隆血清进行第二项 ELISA，以确认所获得蛋白具有 H7 来源的特性（图 8D）。

讨论

尽管利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达流感病毒的HA和NA蛋白通常较为直接，但仍需考虑几个重要问题。如引言中所述，HA和NA的胞外域分别与三聚化或四聚化结构域融合表达至关重要。这些结构域能够确保分子的正确折叠，通常还需跨膜结构域的辅助；而仅表达胞外域时，该跨膜结构域并不存在。例如，若HA胞外域未与三聚化结构域融合表达，则会导致茎部结构域中重要中和表位发生寡聚化和不稳定¹。此外，蛋白稳定性降低，并易受昆虫细胞及杆状病毒蛋白酶的降解。三聚化或四聚化结构域的具体选择影响较小，目前已测试多种结构域，从亮氨酸拉链结构域²²到T4噬菌体foldon结构域¹¹，均表现出满意的效果。需要注意的是，对于高致病性H5N1²⁴或H7N7²⁵分离株中存在的多碱性裂解位点（H7N9中不存在），必须在表达前予以去除，因为这些位点会被杆状病毒表达系统中持续存在的类弗林蛋白酶（furin-like proteases）切割^1,12。

降解产物的另一个可能原因是酵母或霉菌污染。这种污.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备名称	公司	货号	评论/描述
杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）	Invitrogen	10359-016	遵循制造商的说明
TNM-FH 昆虫培养基	Gemini生物制品	600-311
HyClone SFX-昆虫培养基	赛默飞世尔科技	SH30278.02
Cellfectin II 试剂	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual 滤器 Ultracel 30K	默克密理博	UFC902024
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
聚丙烯柱（5 ml）	Qiagen	34964
Max效率DH10Bac细菌	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure 质粒过滤中量提取试剂盒	Invitrogen	K210015
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399-100G	用于洗脱和洗涤缓冲液
Sf9 细胞	ATCC	CRL-1711
High Five 细胞	Invitrogen	B85502