利用杆状病毒表达系统表达新型H7N9流感病毒的功能性重组血凝素和神经氨酸酶蛋白

摘要

本文介绍了一种在昆虫细胞中表达正确折叠且具有功能的新型中国H7N9病毒表面抗原的方法。该技术可适用于表达任何病毒或细胞表面蛋白的胞外结构域。

摘要

杆状病毒表达系统是表达重组蛋白的有力工具。本文中，我们利用该系统生产正确折叠且糖基化的甲型流感病毒表面糖蛋白——血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）。以实例而言，我们选择了近年来在中国新出现的H7N9病毒所表达的HA和NA蛋白。然而，本实验方案可轻松适用于其他任何甲型和乙型流感病毒株所表达的HA和NA蛋白。重组HA（rHA）和NA（rNA）蛋白是ELISPOT和ELISA等免疫学检测的重要试剂，也广泛用于疫苗标准化、抗体发现、分离与表征。此外，重组NA分子可用于小分子抑制剂的筛选，并有助于研究NA的酶学功能及其对抗病毒药物的敏感性。重组HA蛋白也正在动物模型中作为实验性疫苗进行测试，且一种基于重组HA的疫苗已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人类。本文所述的分子制备方法简便，可促进流感实验室的研究工作，因其能够快速、低成本地大量生产蛋白。尽管本文重点介绍流感病毒表面糖蛋白，但该方法也可用于其他病毒和细胞表面蛋白的表达。

引言

针对近期在中国出现的新型H7N9流感病毒株，我们首先获取了携带最早两株病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因组序列的质粒。利用这些质粒，我们能够快速构建杆状病毒表达载体，用于在昆虫细胞中表达重组HA和NA蛋白。该表达系统在我们实验室已得到充分验证，并在多项持续进行的研究项目中发挥关键作用^1-8。昆虫细胞能够正确折叠并进行复杂的翻译后修饰，其中包括对多种病毒糖蛋白至关重要的N-连接糖基化。因此，杆状病毒系统被广泛用于表达流感病毒表面抗原也就不足为奇。事实上，已有许多HA和NA的晶体结构是利用昆虫细胞表达的蛋白解析获得的^9-11。该系统的另一优势在于其稳定的高蛋白产量，每升细胞培养物可获得高达30 mg的HA蛋白（基于我们对50多种不同HA蛋白的实验经验），这得益于强效多角体蛋白启动子驱动的病毒感染表达机制。

去除HA和NA蛋白的跨膜区和胞内区，可表达分泌型的可溶性蛋白，从而极大地方便纯化过程。此外，这些胞外结构域带有六组氨酸标签，因此可利用Ni²⁺-树脂通过亲和层析进行纯化。HA和NA蛋白的跨膜区分别参与同源三聚体和同源四聚体的形成。为了维持这些寡聚化状态，我们在HA构建体的C端添加三聚化结构域，在NA构建体的N端添加四聚化结构域（图1）。我们已明确证实，此类三聚化结构域能稳定HA茎部结构域上具有功能性的保守构象表位¹。NA的正确四聚化也可能有助于其正确折叠及功能发挥¹⁰。含有三聚化或四聚化结构域的序列及杆状病毒转移载体可向作者或本领域其他实验室申请获取^,9,10,12。

在昆虫细胞中表达分泌蛋白时，另一个重要问题是选择合适的细胞系。虽然来源于Spodoptera frugiperda的Sf9细胞能很好地支持杆状病毒的复制，通常用于病毒的拯救和扩增，但其分泌大量蛋白的能力有限。Trichoplusia ni来源的BTI-TN-5B1-4细胞（通常称为High Five细胞）具有更高的分泌能力，是本实验方案中首选的表达细胞系^13,14。此外，降低甚至去除表达培养体系中的胎牛血清（FBS）有助于提高分泌效率。因此，我们使用含较低浓度（3%）FBS的培养基来扩增病毒工作储备液，并在无血清培养基中进行蛋白表达。

重组HA和NA蛋白被广泛应用于多种免疫学技术中。其中最常见的应用是在ELISA实验中，用于检测人或动物接种疫苗后的血清转化情况^4,6,7,15。HA和NA也用于ELISPOT实验，既可作为刺激分子，也可作为检测抗体分泌细胞的检测试剂¹⁶。将其用作分子诱饵，可特异性分选浆母细胞或其他类型的B细胞，进而用于分离（治疗性）单克隆抗体（mAb）。重组HA和NA分子还进一步用于这些单克隆抗体的表征分析⁸。其他应用实例包括研究不同病毒分离株所表达HA的pH稳定性或受体特异性，或定量评估NA的酶活性及其对抑制剂的耐药性。此外，重组纯化的HA还可用于标准化灭活流感病毒疫苗中的HA含量。

重要的是，重组血凝素（rHA）（以及一定程度上的神经氨酸酶，NA）疫苗候选物目前正在动物模型和人体临床试验中进行测试，其中一种疫苗候选物已于2013年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准^2,17-19。这些新型疫苗的优势在于，由于这些蛋白具有重组特性，因此可以避免传统方法中耗时费力的高产重配病毒的制备过程。或许更为重要的是，这些疫苗的血凝素产量在不同毒株之间均具有高产量和良好的可重复性。此外，由于这些疫苗是在无卵系统中生产的，因此不含对鸡蛋过敏个体可能产生问题的蛋白质污染物。

本文中，我们选择表达两种新型中国H7N9流感病毒分离株A/Anhui/1/13和A/Shanghai/1/13^20,21的HA和NA蛋白。这些实例具有时效性，但所述实验方案可用于表达任何甲型或乙型流感病毒的HA或NA蛋白，并可进一步调整以表达其他分泌型病毒或细胞蛋白。三聚体或四聚体跨膜蛋白可分别克隆至用于HA和NA表达的表达盒中。然而，大多数可溶性分泌型细胞蛋白（例如干扰素）无需额外的稳定结构域，仅需添加C端六组氨酸标签即可表达。

方案

1. 重组杆状病毒的制备

1. 克隆至杆状病毒转移质粒
   1. 将H7 HA和N9 NA胞外域（或其他任何HA或NA基因）克隆至改造后的pFastBac转移质粒中（见引言部分）。已有文献描述了包含C端三聚化结构域和六组氨酸标签的HA载体，以及包含N端四聚化结构域和六组氨酸标签的NA载体^1,10,11,22（图1），可向作者索取。
      说明：若HA胞外域未连接三聚化结构域进行表达，则其折叠将不正确，导致构象依赖性中和表位丢失 ，尤其是在茎区结构域中。同样，NA的酶活性依赖于正确的四聚化。
   2. 杆粒的制备
      按照生产商说明书，使用杆状病毒表达系统将含有HA和NA基因的杆状病毒转移质粒转化至DH10Bac细菌中。根据生产商说明书，使用中量质粒提取试剂盒（Midiprep kit）分离并纯化杆粒（图2）。
2. 重组杆状病毒的拯救及蛋白表达验证
   说明：以下步骤需在超净工作台内无菌操作。对HA和NA（或任何其他目标基因）分别独立进行本实验流程。昆虫细胞通常在28 °C、无CO₂条件下培养。除非另有说明，本方案中Sf9细胞使用完全TNM-FH昆虫细胞培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素^*和0.1% Pluronic F68溶液），每周传代两次，传代比例为1:4。High Five细胞则使用SFX无血清培养基，每周传代两次，传代比例为1:15。
   ^* 抗生素的添加在整个实验流程中应视为可选步骤，可根据各实验室的具体操作习惯进行调整。
   1. 将Sf9昆虫细胞以2 × 10⁵ 个细胞/cm²的密度接种于6孔板中，在28 °C培养箱（无CO₂）中静置20分钟。
   2. 取2 μg（浓度0.5–2 μg/μL）重组杆粒与100 μL TNM-FH培养基（无血清，含1%青霉素-链霉素）混合。另取6 μL转染试剂与100 μL TNM-FH培养基（无血清，含青霉素-链霉素）混合。将上述两液体合并，轻轻混匀，室温静置20分钟（形成转染混合物）。设置一个空白转染组作为对照（图3）。 
   3. 吸除6孔板中已贴壁Sf9细胞的上清液（此时细胞已贴附于孔板），更换为2 mL无血清TNM-FH培养基（含1%青霉素-链霉素），加入全部体积的转染混合物（来自步骤 1.2.2），轻柔摇晃6孔板约5秒。置于28 °C、无CO₂的培养箱中孵育6小时（图3）。
   4. 更换为新鲜的完全TNM-FH培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.1% Pluronic F68）。在28 °C、无CO₂的培养箱中继续孵育6天。期间定期在显微镜下观察细胞状态。感染后的细胞通常体积增大、形态变圆、细胞核膨大，并开始脱落（图4）。 
   5. 细胞收获及蛋白表达确认
      1. 转染后第6天，通过离心（室温，2,000 × g，5分钟）收集细胞。上清液即为重组杆状病毒，可立即用于制备工作病毒储备液，或长期储存在4 °C。
      2. 为检测蛋白表达，收集细胞沉淀并重悬于500 μL PBS中。取50 μL细胞悬液与50 μL SDS-PAGE上样缓冲液（含还原剂）混合，进行SDS-PAGE电泳，并使用抗六组氨酸抗体进行Western blot分析以确认基因表达。以空白转染组细胞作为阴性对照（图3）。
   6. 工作病毒储备液的制备
      1. 在T175 cm²培养瓶中以5 × 10⁵个细胞/cm²的密度接种Sf9细胞，静置20分钟使其贴壁。将完全TNM-FH培养基更换为含3%胎牛血清（以及1%青霉素-链霉素、0.1% Pluronic F68）的TNM-FH培养基。
      2. 加入100 μL拯救所得的病毒上清液感染细胞。在28 °C、无CO₂的培养箱中孵育6天，期间定期观察细胞是否被感染（观察方法见步骤1.2.5）。
      3. 室温下2,000 × g离心5分钟，收集上清液，此即P2代病毒储备液。该储备液可在4 °C长期保存。使用100 μL P2代病毒液再次感染细胞，所获得的病毒液称为P3代或工作病毒储备液，可直接用于蛋白表达或储存在4 °C 。P3代病毒液通常含有10⁷–10⁹ pfu/mL（空斑形成单位/毫升）。

2. 蛋白质表达与纯化

说明：Sf9 细胞对杆状病毒的生长支持效果很好，但其分泌大量重组蛋白的能力有限。因此，我们使用另一种昆虫细胞系——High Five 细胞来表达分泌型重组蛋白。这些细胞虽然不能支持杆状病毒复制达到很高的滴度¹³，但具有很高的分泌能力。

1. High Five 细胞的培养
   在 T175 cm² 培养瓶中使用 SFX 昆虫细胞培养基培养 High Five 细胞，每两天按 1:3 比例传代一次。为进行 200 ml 表达培养，需准备 5 个完全融合的培养瓶。
2. High Five 细胞的收获与感染
   1. 用手轻拍 5 个 T175 cm² 培养瓶，使 High Five 细胞脱落。收集细胞悬液并转移至 50 ml 离心管中。
   2. 在室温下以 1,200 × g 离心 7 分钟。倾去上清液，并将沉淀用 15 ml P3 储存液重悬，合并所有沉淀。
   3. 在生物安全柜中静置 15 分钟（图 5）。
   4. 将 200 ml Hyclone SFX 培养基转移至一个洁净、无菌的 1,000 ml 摇瓶中（无挡板，使用前用铝箔密封并高压灭菌，且此前不得用于细菌培养）。
   5. 将 P3/细胞悬液转移至摇瓶中，用无菌铝箔密封后放入摇床。在 28 °C 下以 70 rpm 振荡培养 72–96 小时。
3. 从 High Five 细胞表达上清液中收获重组蛋白
   1. 感染后 72–96 小时，将培养上清液转移至 500 ml 离心桶中，在 4 °C 下以 5,500 × g 离心 20 分钟。同时，用双蒸水（ddH₂O）冲洗摇瓶 3 次。
   2. 将 3 ml Ni 树脂悬浊液加入含 45 ml PBS 的 50 ml 管中（每 200 ml 培养液需一组）。充分振荡后，在室温下以 3,000 × g 离心 10 分钟。弃去 PBS，保留沉淀。将昆虫细胞上清液与 Ni 树脂沉淀混合后转移至已冲洗过的摇瓶中。在 4 °C 下边振荡边孵育 2–4 小时（图 6）。 
   3. 将 10 ml 聚丙烯柱固定在支架上的夹具中，取下柱子两端的盖帽，并在柱下放置烧杯以收集穿流液（废弃）。从摇床中取出摇瓶，开始将上清液/悬浊液混合物转移至柱中；柱子将保留 Ni 树脂，仅上清液穿流而过。将全部体积过柱（图 7）。
   4. 用洗涤缓冲液（50 mM Na₂HCO₃、300 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 8）洗涤树脂 4 次，每次 15 ml。待所有洗涤缓冲液流尽后，用盖帽封闭柱子下端。
   5. 加入 2 ml 洗脱缓冲液（50 mM Na₂HCO₃、300 mM NaCl、300 mM 咪唑，pH 8），静置 5 分钟。打开柱子并收集洗脱液。重复此步骤 3 次（共使用 8 ml 洗脱缓冲液）。含有高浓度蛋白的洗脱液在振荡时通常会产生泡沫（图 7）。尽可能将洗脱液置于湿冰上保存。
4. 缓冲液置换与浓缩
   1. 将 15 ml 超滤离心装置（HA/NA 使用 30 kDa 截留分子量，具体可根据纯化蛋白大小调整）在 4 °C 下用 PBS（pH 7.4–7.6）以 3,000 × g 预离心 20 分钟。弃去穿流液，将洗脱液加载至离心柱中。加入 5 ml 无菌冰预冷的 PBS 至满，于 4 °C 下以 3,000 × g 离心 60 分钟。
   2. 再次弃去穿流液，加入 15 ml 冰预冷的 PBS，于 4 °C 下以 3,000 × g 离心 60 分钟。重复此步骤一次。
   3. 从离心机中取出离心柱，收集已完成缓冲液置换的浓缩液（通常为 200 μl）。此即高浓度重组蛋白。用 400 μl 无菌冰预冷的 PBS 冲洗离心柱，并将冲洗液加入浓缩液中。浓缩液应始终置于冰上保存。

3. 表征与质量控制

1. 测定蛋白质浓度
   取一份浓缩液，使用您选择的蛋白质定量方法进行测定。用 PBS 将蛋白质浓度调至 1 mg/mL，并将小份样品冻存于 -80 °C。反复冻融会破坏蛋白质结构，可能导致聚集。
2. SDS-PAGE 与考马斯亮蓝染色
   取 500 ng 蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳，并进行考马斯亮蓝染色。为实现快速便捷的染色，可使用考马斯亮蓝试剂结合微波染色方案。HA 蛋白通常出现在 64 kDa 处，而 NA 蛋白的迁移大小约为 56 kDa（图 8A 和  B）。使用本方案描述的方法不应观察到任何降解产物。若出现降解，通常提示表达过程中存在酵母或真菌污染。此时应重复实验，并确保所有操作保持无菌。
3. Western blot/ELISA
   为验证蛋白质身份，建议使用特异性抗体进行 Western blot 或 ELISA 检测。理想情况下，ELISA 检测应采用识别构象性表位的抗体（例如 抗 HA 茎区抗体¹）。使用此类抗体可确认蛋白质的正确折叠状态（图 8C）。
4. 测定 NA 活性
   病毒 NA 的正确折叠也可通过测定其酶活性来确认。我们建议使用市售的 NA*STAR 检测试剂盒（按照产品使用说明操作即可）。

结果

A/Shanghai/1/13 和 A/Anhui/1/13 的 HA 分子表达良好，产量约为 20 mg/L 培养物。两种毒株的 NA 分子表达水平中等，A/Shanghai/1/13 的 NA 表达量为 0.2 mg/L 培养物，A/Anhui/1/13 为 0.7 mg/L 培养物。四种蛋白制备物的杂质均极少或无杂质（图 8A 和 B），其中 HA 的纯度高于 NA，这可通过表达水平差异进行解释。进一步使用广谱中和性、茎区反应性人源单克隆抗体 CR9114²³ 对 A/Shanghai/1/13 HA 进行 ELISA 分析。该单克隆抗体可结合茎区结构域中的一个构象敏感性表位，本研究中用作检测该结构域正确折叠的探针。抗体显示出良好的结合能力，表明 HA 确实正确折叠（图 8C）。此外，使用抗 H7 小鼠多克隆血清进行第二项 ELISA，以确认所获得蛋白具有 H7 来源的特性（图 8D）。

讨论

尽管利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达流感病毒的HA和NA蛋白通常较为直接，但仍需考虑几个重要问题。如引言中所述，HA和NA的胞外域分别与三聚化或四聚化结构域融合表达至关重要。这些结构域能够确保分子的正确折叠，通常还需跨膜结构域的辅助；而仅表达胞外域时，该跨膜结构域并不存在。例如，若HA胞外域未与三聚化结构域融合表达，则会导致茎部结构域中重要中和表位发生寡聚化和不稳定¹。此外，蛋白稳定性降低，并易受昆虫细胞及杆状病毒蛋白酶的降解。三聚化或四聚化结构域的具体选择影响较小，目前已测试多种结构域，从亮氨酸拉链结构域²²到T4噬菌体foldon结构域¹¹，均表现出满意的效果。需要注意的是，对于高致病性H5N1²⁴或H7N7²⁵分离株中存在的多碱性裂解位点（H7N9中不存在），必须在表达前予以去除，因为这些位点会被杆状病毒表达系统中持续存在的类弗林蛋白酶（furin-like proteases）切割^1,12。

降解产物的另一个可能原因是酵母或霉菌污染。这种污...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备名称	公司	货号	评论/描述
杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）	Invitrogen	10359-016	遵循制造商的说明
TNM-FH 昆虫培养基	Gemini生物制品	600-311
HyClone SFX-昆虫培养基	赛默飞世尔科技	SH30278.02
Cellfectin II 试剂	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual 滤器 Ultracel 30K	默克密理博	UFC902024
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
聚丙烯柱（5 ml）	Qiagen	34964
Max效率DH10Bac细菌	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure 质粒过滤中量提取试剂盒	Invitrogen	K210015
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399-100G	用于洗脱和洗涤缓冲液
Sf9 细胞	ATCC	CRL-1711
High Five 细胞	Invitrogen	B85502