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通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

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DOI：

10.3791/51171

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2014年3月26日

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1Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Wistar Institute, 2Department of Pathology and Lab Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Microbiology and Immunology and Department of Genetics, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 4Division of Endocrine and Oncologic Surgery, Department of Surgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 5Rena Rowan Breast Center, Abramson Cancer Center, University of Pennsylvania, 6Center for Advanced Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

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摘要

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。

摘要

乳腺癌是一种异质性疾病，涉及肿瘤发展过程中与免疫系统之间复杂的细胞相互作用，最终导致肿瘤呈指数级生长并转移至远端组织，同时抗肿瘤免疫功能崩溃。目前已存在多种用于研究乳腺癌的动物模型，但尚无一种模型能够完全模拟人类乳腺癌的疾病进展过程。为了更深入地理解导致隐匿性转移形成和生存率下降的细胞间相互作用，我们构建了一种可诱导的转基因小鼠模型，该模型在免疫功能健全的小鼠中、于性成熟后自发产生表达黄色荧光蛋白（YFP）的导管癌，且肿瘤的发生由持续性、内分泌非依赖性的癌基因表达所驱动。通过向性成熟未交配雌性小鼠的乳腺导管内递送表达Cre重组酶的腺病毒，实现YFP的激活、p53的缺失以及致癌性K-ras基因的表达。在癌基因事件启动约6周后开始出现肿瘤。肿瘤明显出现后，其生长在最初约两周内较为缓慢，随后进入指数级快速增长阶段。在腺病毒注射后7至8周，可观察到血管结构将肿瘤组织与远端淋巴结相连，并最终出现YFP+肿瘤细胞侵入淋巴管并转移至远端腋下淋巴结的现象。肿瘤浸润的白细胞群体与人类乳腺癌中所见相似，包括αβ T细胞、γδ T细胞、巨噬细胞以及髓源性抑制细胞（MDSCs）。这一独特的模型不仅有助于研究隐匿性转移和肿瘤休眠相关的细胞与免疫学机制，还将为设计新型免疫治疗策略以治疗侵袭性乳腺癌提供有力工具。

引言

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤1,2，也是癌症相关死亡的第二大原因2。复杂的遗传学3,4、组织学5和临床表型6被用于表征乳腺癌的不同亚型，并常作为预测生存率的依据。对大量乳腺癌女性患者队列的分析表明，大多数（约80%）死亡患者在原发肿瘤切除后10年内出现复发7。对于大多数浸润性乳腺癌，淋巴血管侵犯已被证实与不良预后及更具侵袭性的临床病程密切相关8。

由于乳腺癌具有遗传和表型上的复杂性，目前尚无能够完全模拟疾病全过程的动物模型。人乳腺肿瘤细胞系常被用于异种移植或原位移植研究9 免疫缺陷小鼠中侵袭性和转移性乳腺癌模型。尽管这些模型具有重要参考价值，但其缺乏免疫压力，且由于属于跨物种移植，会扭曲整个肿瘤微环境的作用。由乳腺特异性启动子（如小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）和乳清酸性蛋白（WAP））驱动的可诱导基因突变，已为揭示乳腺癌的遗传特性提供了大量知识。然而，这些启动子的组织特异性表达因其对内分泌系统的响应性而受到影响。10-16，导致诱导型基因突变的表达具有可变性，无法模拟人类乳腺癌中癌基因通常的过表达模式。为了克服内分泌对MMTV驱动癌基因表达的调控作用，Moody 等 构建了在乳腺上皮中条件性、可由多西环素诱导过表达Neu的小鼠模型17该模型可用于在肿瘤形成后关闭Neu以研究肿瘤消退与复发，但为维持一致且长期的癌基因表达，需持续给予强力霉素。有关现有多种相关乳腺肿瘤模型的全面讨论，可参见Vargo-Gogola的综述文章。 等10

我们的目标是建立一种具有完整C57BL/6遗传背景的可示踪乳腺癌小鼠模型，该模型在持续诱导突变事件后，能够在免疫压力存在的情况下模拟新生肿瘤的形成过程。我们将表达Cre重组酶的腺病毒导入携带floxed等位基因的转基因小鼠的乳腺导管中 Tp53, 以及一种致癌形式的 K-ras 和YFP。Cre表达会消除 Tp53在多种乳腺癌中 frequently mutated 的基因18 并在乳腺导管上皮细胞中特异性诱导K-ras的致癌等位基因及YFP表达。尽管K-ras突变在乳腺癌中较为罕见，仅出现在6.5%的乳腺癌患者中19,20，上游激酶如Her2/neu和EGFR的过表达导致人类乳腺肿瘤中Ras信号通路的持续激活21-23许多乳腺肿瘤细胞系中也报道了Ras信号通路的激活24,25我们将描述肿瘤形成的起始过程，以及将表达Cre重组酶的腺病毒通过导管内注射至性成熟未交配雌性小鼠体内的技术。在此乳腺癌模型中，肿瘤在经历约8周的缓慢进展后，出现明显病灶并呈指数级增长，且在7至8周时已发生淋巴血管侵犯及腋窝淋巴结转移。由于这些小鼠具有完整的C57BL/6遗传背景，且表达YFP的肿瘤细胞可在远端淋巴结中被追踪，该模型为研究隐匿性转移的细胞与免疫学机制提供了相关工具，并有助于开发治疗转移性导管乳腺癌的新疗法。

方案

所有动物实验均经 Wistar 研究所动物护理和使用委员会批准。

1. 转基因小鼠的制备与保种

  1. Breed LSL-K-rastm4Tyj 26 和 Trp53tm1Brn 27 （源自国家癌症研究所人类癌症小鼠模型联盟，背景为混合背景）至完整的C57BL/6背景 28 通过与C57BL/6小鼠回交至少10代获得。为追踪肿瘤转移，繁殖B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J（LSL-EYFP，购自杰克逊实验室，C57BL/6完全背景）与双转基因LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP 小鼠
    注意：转基因 LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP 小鼠的致癌性K-ras基因转录沉默等位基因两侧带有loxP位点，且内源性p53基因座也带有loxP位点，因此在Cre介导的重组下，可实现致癌性K-ras突变体的过表达和p53的缺失。
    注意：LSL-EYFP 小鼠携带一个两侧由loxP位点包围的终止密码子，该终止密码子阻断增强型黄色荧光蛋白（YFP）基因的表达；当发生Cre介导的重组切除该终止盒后，YFP基因将在终止盒被切除的组织中表达。
    1. 繁育转基因小鼠以获得LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP 小鼠或 LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP 用于导管内注射的 LSL-EYFP 小鼠
      注意：小鼠按 p53 纯合子进行繁育loxP/loxP 且对 LSL-K-ras 为杂合状态G12D/+ 因为具有 K-ras 纯合缺失的小鼠会死亡 在子宫内使用至少六周龄的未交配雌性小鼠进行导管内注射。
      注意：用于基因分型纯合 floxed p53 等位基因的引物为 p53-T010-fwd（5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'）和 p53-T011-rev（5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'）。它们扩增出长度为391 bp的野生型等位基因和长度为461 bp的p53 floxed等位基因29,30.
      注意：检测 K-ras 突变型的引物为 oIMR8273（5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'）和 oIMR8274（5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'），可扩增出在 600 bp 处可见的突变条带。
      注意：对于YFP报告基因三重转基因小鼠，用于检测ROSA盒的引物（5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'）、野生型等位基因（5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'）以及共用等位基因（5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'）可分别扩增出320 bp（floxed等位基因）和600 bp（野生型等位基因）的条带。

2. 手术准备

  1. 使用75%乙醇清洁手术器械，并在每次注射前后进行高压灭菌处理。
  2. 在动物实验设施内经过消毒的房间中，于干净整洁的实验台上进行手术操作。使用广谱消毒液擦拭所有表面，包括手术显微镜的载物台和调节旋钮，随后再用75%乙醇擦拭。
  3. 称重后，通过腹腔注射无菌生理盐水中配制的氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（8–10 mg/kg）混合物对小鼠进行麻醉。
  4. 将小鼠轻柔地放回笼中，静置5分钟使其进入麻醉状态。在此期间，制备病毒沉淀物（见方案3）。
  5. 通过夹捏脚趾确认小鼠无疼痛反应。使用兽用眼膏轻轻覆盖麻醉小鼠的眼睛，以防止角膜过度干燥。
  6. 为防止低体温，在手术过程中直至小鼠开始恢复意识期间，将麻醉后的小鼠置于调至低温的加热垫上。
  7. 为控制术后疼痛，应在手术前以及术后24小时，以1 mg/kg剂量对小鼠皮下注射美洛昔康。

3. 病毒沉淀物的制备

警告：腺病毒载体虽然经过修饰且无法复制，但仍存在感染风险。操作腺病毒时应谨慎小心。所有人员均应根据所在机构关于处理BSL2级病原体的指南接受适当培训。经导管注射后，应按照BSL2级指南处置腺病毒。

  1. 将腺病毒浓缩液分装保存于 -80 °C，每份含 4 x 108 pfu，足以对 16 只动物每只注射 3 μl 的 2.5 x 107 pfu 腺病毒颗粒。
  2. 在开始注射前约 15–20 分钟，将腺病毒分装样品置于干冰上保存。
    注意：避免反复冻融，因每次冻融循环均会导致病毒滴度显著下降。
    注意：腺病毒沉淀物的制备方法系基于先前报道的方案 31 进行修改。
  3. 将 504 mg MEM 粉末用 50 ml 无菌分子级水重悬，加入 244 mg 碳酸氢钠，在无菌条件下过滤后，于 4 °C 保存。
    1. 通过将 1.5 g 氯化钙溶于 50 ml 分子级水中制备氯化钙溶液，在无菌条件下过滤后，于 4 °C 保存。
    2. 将含 4 x 108 pfu 腺病毒-Cre 的分装样品与足量的 3% 蔗糖无菌水混合，终体积为 10 μl。向病毒液中加入 34 µl MEM，轻轻混匀。然后加入 4 μl CaCl2 溶液，轻轻混匀后，室温孵育 15–20 分钟。
    3. 在制备沉淀前，将腺病毒样品置于干冰上保存。避免腺病毒解冻或在冰上或室温下长时间存放，除非正在进行沉淀制备。
      注意：若无法在从 -80 °C 取出后立即解冻腺病毒分装样品并开始制备沉淀，也可预先混合蔗糖、MEM 和 CaCl2。该蔗糖、MEM 与钙溶液混合物可保存于干冰上，待准备加入腺病毒时再使用。
      注意：病毒颗粒在约 1 小时内保持稳定。
    4. 每次注射前，轻轻弹击离心管以确保病毒颗粒充分混匀。用 10 μl 注射器吸取 3 μl（2.5 x 107 pfu）病毒颗粒，准备进行小鼠导管内注射。

4. 病毒颗粒的导管内注射

  1. 将小鼠轻轻仰卧放置于洁净解剖显微镜的照明载物台上。使用额外光源照射腹部，定位左侧第4th 或右侧 9th 通过围绕每个乳头的白色小毛斑（在C57BL/6雌性小鼠中可见）识别腹股沟乳腺。
  2. 用无菌的乙醇浸湿棉签轻轻擦拭乳头，以清除乳头周围的毛发并消毒注射部位。如果乳头难以暴露，可轻轻涂抹一层脱毛膏或使用剪刀修剪毛发，以暴露乳头。
  3. 去除角质栓，一层致密的死亡角质细胞覆盖着乳头。一旦暴露乳头，在解剖显微镜下应能清晰看到角质栓。
  4. 用精细的外科镊子夹住乳头，轻轻上提以取出角质栓。
  5. 固定乳头 之间 镊子。
  6. 用镊子轻轻夹住针头，以90°角度插入导管腔内。针尖斜面略超过乳头开口处即可（不超过2 mm），以避免穿透乳腺组织进入腹腔的浆膜层。
    1. 不要将针插入过深。 为确保注射深度适当，在将针头插入导管腔后，轻轻向上拉动针头，同时将乳头沿针头边缘随之上提。
      注意：注射过程的可视化较为困难，因此建议使用台盼蓝对此步骤进行练习。
  7. 当针头恰当地插入乳腺导管后，释放3 µl病毒沉淀物（2.5 x 107 轻轻推动握持注射器的手的拇指，注入腺病毒-Cre（pfu），注射时乳头应略微膨胀。

5. 小鼠的恢复

  1. 注射后将小鼠放回加热垫上，直至其开始从麻醉状态恢复 。
  2. 小鼠恢复后，将其放回清洁的笼子中，并监测其完全恢复及活动情况。
  3. 导管内注射24小时后，皮下给予美洛昔康，剂量为1 mg/kg。

6. 监测肿瘤进展

  1. 在第30天触诊注射的乳腺，检查是否存在增大和肿胀。
    1. 一旦观察到乳腺肿胀和增大，每5-7天监测一次肿瘤进展。
  2. 当可触及的肿瘤出现后（腺病毒注射后约50-60天），每3-4天测量一次肿瘤体积，以评估肿瘤生长动力学。
  3. 当肿瘤体积超过小鼠体重的10%时，实施安乐死。

结果

通过在注射台盼蓝（以验证正确的注射技术（图1A）或表达mCherry的腺病毒（以验证病毒制备的正确性及对导管上皮细胞的感染效果，图1B）后，按照先前所述方法32制备乳腺整体组织切片，可直观观察乳腺导管树的成功靶向情况。

血管结构示意图；显微镜；蓝色染料染色（A）和荧光标记（B）；TD、LD、MG。
图1. 通过台盼蓝或腺病毒-mCherry注射实现乳腺导管内靶向标记。 A) 在向第4对乳腺注射台盼蓝后3小时，制备整体封片，以可视化/确认整个导管树的靶向情况，方法如先前报道32。图像为4倍放大。 B) 通过注射表达mCherry的腺病毒（2.5 × 107 pfu）感染导管上皮。小鼠接受导管内注射，注射后第4天制备乳腺整体封片，以确认导管树的病毒感染情况。图像为4倍放大。MG代表乳腺，LD为输乳管或主导管，TD为终末导管。 点击此处查看高清图像。

在p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+转基因小鼠中诱导肿瘤后，肿瘤通常在第40天左右才开始显现，此时乳腺组织会出现增大和肿胀。一旦观察到该现象，即应开始触诊，并每5至7天监测一次肿瘤生长情况。在我们的实验中，乳腺组织硬化总是早于肿瘤的出现。此后肿瘤将缓慢进展约两周。大约从第56天开始，肿瘤将进入指数生长期（图2B）。此时，若需进行动力学研究，则必须每3天测量一次肿瘤体积，因为不同小鼠间肿瘤进展速度存在轻微个体差异，此属正常现象（图2A 和图3A）。至第80天时，腹部可明显观察到较大肿块（图2A、2B 和图3A），此后若肿瘤重量超过小鼠体重的10%，则应实施安乐死。对一只荷瘤小鼠来源的三个克隆进行cDNA分析，结果显示表达间皮素（mesothelin）、细胞角蛋白-8（cytokeratin-8）、Her2/neu以及雌激素受体-α（estrogen receptor-α）（图2C）。

小鼠肿瘤生长研究；肿瘤体积图；Western blot蛋白表达分析。
图 2. 通过导管内注射腺病毒-Cre 诱导 p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ 小鼠的肿瘤发育。 A) 注射表达 Cre 的腺病毒 80 天后两个肿瘤的示例。小鼠接受 2.5 × 107 PFU 表达 Cre 的腺病毒，肿瘤诱导 80 天后，可在动物腹部侧方观察到明显突出的可触及肿块。 B) 在 p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ 小鼠中诱导肿瘤的典型生长动力学及触诊时间表。 C) 从同一只 p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ 小鼠的同一均质化肿瘤中分离出的三个肿瘤细胞克隆的表征。提取 RNA 并合成 cDNA，使用特异性引物对 β-actin、间皮素、细胞角蛋白-8、Her2/neu、孕激素受体、雌激素受体-α 和雌激素受体-β 进行 RT-PCR 分析。 点击此处查看高分辨率图像。

与人类乳腺癌的细胞微环境相似，我们观察到αβ和γδ T细胞以及髓源性抑制细胞和巨噬细胞浸润至肿瘤组织中（图4）。在肿瘤生长尚未完全占据注射部位的整个乳腺组织时，引流至腋窝淋巴结的血管系统即开始充血扩张（图3A）。通过将LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP小鼠与LSL-EYFP小鼠杂交，可追踪肿瘤细胞的淋巴血管侵袭及转移过程。经Cre介导的基因切除后，可在肿瘤中检测到表达YFP（高表达和低表达）的肿瘤细胞，并可追踪其向引流侧腋窝淋巴结转移的情况（图3B）。在携带肿瘤的LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP小鼠中，通过成功从远端腋窝淋巴结分离并培养出肿瘤细胞系，证实了肿瘤向该部位的转移（数据未显示）。

小鼠肿瘤进展和流式细胞术图谱、组织分析、SSC 与 YFP 散点图。
图 3. 肿瘤的形成及向腋窝淋巴结的隐匿性转移。 A) 三个进展速度不同的晚期乳腺肿瘤示例。由箭头所示，形成实性肿块，并最终生长至整个腹部乳腺组织的大小。肿瘤局限于乳腺组织内，未观察到侵入或附着于腹膜腔表面的肌肉。在腹股沟淋巴结与腋窝淋巴结之间可见明显的浅表腹壁静脉充血，以白色箭头标示。在接种后 7–8 周，由于肿瘤细胞的淋巴血管侵袭，腋窝淋巴结开始肿大，以箭头指示。 B) 通过流式细胞术可在腋窝淋巴结中检测到 YFP 阳性肿瘤细胞的转移。使用 LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP LSL-EYFP 小鼠模型，通过导管内注射腺病毒-Cre 诱导肿瘤形成并激活 YFP 表达。为验证肿瘤细胞对腋窝淋巴结的淋巴血管侵袭，在腺病毒注射后第 80 天，取指定的淋巴结和器官，使用淋巴细胞标志物进行染色，并检测 YFP 表达情况。CL 代表对侧非肿瘤引流淋巴结。结果展示的是 CD45 阴性肿瘤细胞的设门分析，表明肿瘤细胞已侵入远端腋窝淋巴结。数值表示来自总细胞群中 YFP 阳性细胞的百分比。点击此处查看高清图像。

Flow cytometry charts; CD3, CD45, γδTCR, CD11b, GR1 markers; cell population analysis.
图4. 小鼠转基因乳腺肿瘤中的免疫浸润 小鼠乳腺肿瘤被匀浆后，使用 CD45、CD3、γδTCR、CD11b 和 GR1 进行染色。数字表示肿瘤内全部白细胞（63.5）中呈阳性细胞所占的百分比，以及总 CD3+ （46.7），总CD3阴性（40.1），总CD3+ γδ+ （γδ T细胞，13），CD3+ γδ阴性（24），总GR1高CD11b（MDSC，28.6）和总CD11b GR1低（巨噬细胞，18.5）。 单击此处查看大图。

由于小鼠的解剖结构以及导管内注射技术的特点，我们发现靶向第4和第9对乳腺（图5）可获得最一致的结果和可靠的注射效果。然而，具体靶向哪一对乳腺可根据实施手术的技术人员的偏好而定。

啮齿类动物解剖图及生物研究中标注的实验标记。
图 5. 乳腺导管编号。 图中以红色突出显示第4和第9乳腺导管，并在小鼠上用箭头标示。根据我们的经验，对这两个乳腺导管进行注射操作最为简便，但我们发现，所有其他靶向的乳腺组织均能以相似的动力学特征形成肿瘤。点击此处查看高清图像。

讨论

该操作的成功取决于导管内注射过程中的正确技术，未经训练的实验人员可能难以掌握。我们实验室有经验的研究人员在进行腺病毒注射时，通常有79%的成功率可获得乳腺肿瘤组织。注射操作不当可能导致肿瘤发育显著延迟、结果不稳定或完全不发育。如果针头插入过深或角度不当，可能会错过导管管腔。重要的是将针头插入乳头时略超过针尖斜面（不超过2 mm），以避免穿透乳腺组织进入腹腔的浆膜层。此外，针头插入过浅或注射病毒沉淀物超过3 ml，均可能导致病毒制剂溢出乳腺组织外，从而诱发非预期部位的肿瘤。解决这些问题的一种方法是先将针头插入乳头略深于3 mm，然后缓慢将注射器向外退出，直至针尖斜面距离乳头约2 mm处。这样可确保靶向乳腺组织而非小鼠腹腔周围肌肉组织（图1A）。同时，该操作还能使乳头边缘紧贴注射器，从而在将病毒注入导管时避免溢出，防止病毒沉淀物流失。

注射过程的可视化较为困难，因此建议对该步骤进行练习。我们观察到，经过练习后成功注射的比例有所提高，从而导致肿瘤发育的外显率更高。由于该技术使用的是未哺乳的 virgin 雌性小鼠，因此必须去除覆盖乳头的角蛋白栓，以暴露其下方的乳腺导管。我们建议通过向导管内注射台盼蓝或其他无菌可示踪染料，并制备完整的乳腺全 mount 标本，以确认导管树的准确靶向，从而练习此步骤。此外，已有其他文献报道了试剂的导管内注射方案33,34，可为建立合适的技术方法提供参考。还可使用表达 mCherry 的腺病毒来检测病毒制备或导管腔感染过程中可能出现的问题。在注射技术优化之前，可针对上述每种目的使用非转基因小鼠。

尽管任何乳腺均可用于诱导肿瘤，但我们发现靶向第4或第9乳腺时获得的肿瘤生长速率最为稳定，这可能是因为对这些乳腺进行准确注射更为容易，从而更有效地靶向输乳管。左侧第4乳腺th 或右侧 9th 腹股沟乳腺组织至引流腹股沟淋巴结的通路可用于研究肿瘤进展不同时间点的抗肿瘤免疫反应。为模拟并追踪肿瘤向远端部位的隐匿性转移，将转基因小鼠与LSL-EYFP小鼠杂交。随着肿瘤进展，约在肿瘤进入指数增长期前5周，连接肿瘤与腋下淋巴结的血管将出现轻度充血。图3A）。最终，经过7-8周后，淋巴血管侵犯将导致腋窝淋巴结内肿瘤生长（图3A 和 3B). 利用报告基因小鼠和Cre-loxP技术，YFP的整合为追踪肿瘤进展过程中向远端部位转移的肿瘤细胞提供了平台，有助于开展旨在阐明促进潜伏性转移的细胞和表观遗传机制的研究。在我们的实验中，乳腺肿瘤细胞系表达细胞角蛋白-8、间皮素、雌激素受体-α和Her2/neu，证实了导管上皮的成功靶向。然而，由于诱导突变的类型不同，以及注射操作存在技术难度和变异性，我们建议在实验室中建立稳定的模型后，对肿瘤进行组织学表征分析。

由于乳腺癌是一种致死率高且广泛存在的疾病1,2，因此使用能够准确模拟肿瘤与宿主之间复杂相互作用的动物模型至关重要。本文描述了一种完全回交的C57BL/6小鼠乳腺肿瘤模型。首先，通过诱导内源性细胞形成肿瘤，我们使肿瘤在完整的免疫微环境中自然演化。在进展期小鼠乳腺肿瘤中，其免疫微环境重现了人类乳腺癌中常见的αβ和γδ T细胞、髓源性抑制细胞以及巨噬细胞的细胞群分布（图4）。正如我们先前使用腺病毒-Cre诱导卵巢肿瘤研究所发表的结果，我们发现病毒注射对相应的肿瘤浸润细胞及肿瘤进展几乎没有影响28。其次，致癌基因的内分泌非依赖性表达确保了肿瘤细胞持续高水平地表达目标基因。第三，通过利用隐性突变，我们可以控制肿瘤发生的时间，从而实现对肿瘤演化过程的精确时序追踪。该模型的应用包括肿瘤细胞生物学研究、肿瘤微环境因子分析、抗肿瘤免疫应答研究，甚至可用于新疗法疗效的评估。借助Cre-loxP系统，该技术可作为研究乳腺肿瘤发生与发展过程中多种其他突变的通用平台。我们希望该模型的应用能够加深对乳腺癌生物学机制的理解，并最终推动针对转移性乳腺癌的新疗法开发。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了美国国家癌症研究所（NCI）资助项目RO1CA157664和RO1CA124515以及乳腺癌联盟奖的支持。我们谨向Wistar研究所流式细胞术核心设施的Jeffrey Faust、David Ambrose和Scott Weiss，Wistar 影像设施的James Hayden，以及Wistar研究所动物设施的全体工作人员致以诚挚感谢，感谢他们提供的宝贵技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Trp53tm1Brn 转基因小鼠
K-rastm4Tyj 转基因小鼠		源自美国国家癌症研究所人类癌症小鼠模型联盟小鼠经过十次回交至完整的 C57BL/6 背景
B6.129X1-

Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/ J

转基因小鼠		杰克逊实验室006148
引物 p53loxP/loxPIntegrated DNA Technologies5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3''
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
引物 LSL-K-rasG12D/+Integrated DNA Technologies5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
检测Rosa启动子的LSL-EYFP引物集成DNA技术公司5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3''
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3''
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
检测间皮素表达的引物Integrated DNA Technologies5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
用于检测孕酮受体表达的引物Integrated DNA Technologies5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
用于检测角蛋白8表达的引物Integrated DNA Technologies5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3''
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
检测 Erbb2 表达的引物Integrated DNA Technologies5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
检测雌激素受体A表达的引物Integrated DNA Technologies5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
检测雌激素受体B表达的引物Integrated DNA Technologies5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
用于检测 B-Actin 表达的引物Integrated DNA Technologies5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3''
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
腺病毒-Cre爱荷华大学基因转移载体中心Ad5CMVCre将病毒分装保存（4 x 108 pfu/份，在 -80 °C，以避免反复冻融循环。
腺病毒-mCherry爱荷华大学基因转移载体中心Ad5CMVmCherry将病毒分装保存（4 x 108 pfu/等分试样）于 -80 °C，以避免反复冻融循环。
汉密尔顿注射器Hamilton公司701RN10 μl 注射器，RN 系列。
每次使用前后均需进行高压灭菌，用 PBS 和 75% 乙醇清洁。
定制针头Hamilton公司7803-0533 G 0.5 英寸长 RN 针头，带 12° 斜面。每次使用前后均需高压灭菌。用 PBS 和 75% 乙醇清洁。
手术镊Dumont52100-58Dumostar No. 5 镊子。每次使用后用75%乙醇清洁，随后进行高压灭菌
MEM粉末Cellgro50 012 PB4°C下保存 °C 的粉末及重悬形式
碳酸氢钠FisherS233加入 MEM 并过滤除菌
氯化钙SigmaC4901最低96%，无水

参考文献

  1. Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer
Posted by JoVE Editors on 10/20/2014. Citeable Link.

A correction was made to Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Protocol section 3.1 was updated from:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

to:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 µl of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

Protocol section 3.3.2 was updated from:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

to:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 µl. Add 34 µl of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 µl of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

Protocol section 3.4 was updated from:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

to:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 µl (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 µl syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

Protocol section 4.7 was updated from:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

to:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 µl of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:

10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

to:

10µl syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

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通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型
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