从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

摘要

人类骨骼肌中的血管含有多种多能前体细胞群体，非常适合用于再生医学应用。该分离方法可同时从血管的三个结构层中分别纯化出三种多能前体细胞群体：来自内膜的肌源性内皮细胞、来自中膜的周细胞以及来自外膜的外膜细胞。

摘要

自发现间充质干细胞/基质细胞（MSCs）以来，其天然身份与定位 的 MSCs 由于在培养中进行回顾性分离，这些细胞的特性曾长期不明确。近期，我们及其他研究人员利用荧光激活细胞分选技术（FACS），前瞻性地鉴定并纯化出三种与人类骨骼肌血管系统相关的多能前体细胞亚群。这三种细胞群体分别为：肌源性内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和外膜细胞（ACs），它们分别定位于血管的三层结构：内膜、中膜和外膜。这些来源于人类血管的干细胞（hBVSC）群体不仅表达典型的间充质干细胞（MSC）标志物，还具有与典型MSC相似的中胚层发育潜能。以往，MECs、PCs和ACs是通过不同的分离方案分别获得，并在各自独立的研究中进行表征。本研究所采用的分离方案，通过对分离流程的改进以及对选择性细胞表面标志物的调整，能够从单一人肌肉活检样本中通过FACS同时纯化出全部三种hBVSC亚群。这一新方法不仅将简化多种血管源性干细胞亚群的分离过程，还将促进hBVSC在不同治疗目的下的未来临床应用。

引言

人类骨骼肌被认为是临床上极具吸引力的干细胞/前体细胞来源。骨骼肌不仅含有定型的肌源性前体细胞——骨骼肌母细胞，还含有原始的肌源性干细胞，包括卫星细胞和肌肉来源干细胞（MDSCs）¹。 在再生医学中，自体或异体来源的人类肌肉干细胞/前体细胞的应用已在临床前动物模型和临床试验中得到广泛研究。肌肉干细胞/前体细胞的再生应用范围广泛，从修复杜氏肌营养不良症（DMD）患者的肌萎缩肌肉，到治疗心肌梗死患者受损的心脏组织。

自发现间充质干细胞/基质细胞（MSCs）及其他多能前体细胞群体（包括骨髓来源的多能成体前体细胞（MAPCs）和脂肪来源的干细胞（ADSCs））以来，成体干细胞/前体细胞迄今已得到广泛研究^1-9. 然而，它们的天然身份和定位 原位 由于回顾性分离方法的局限，这些细胞一直未能被清晰识别。近期，我们及其他研究团队利用荧光激活细胞分选技术（FACS），前瞻性地鉴定并纯化了来源于人体骨骼肌及多个其他器官血管壁内的三种多能前体细胞群体：肌源性内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和外膜细胞（ACs）¹⁰. 这三种人源血管干细胞（hBVSCs）亚群可分别存在于血管的三层结构中：内膜层、中膜层和外膜层。具体而言，MECs 和 PCs 存在于微血管和毛细血管中，而 ACs 则定位于较大动脉和静脉的外膜层。每种前体细胞亚群均表达一组独特的细胞表面抗原：MECs（CD34）⁺/56⁺/144⁺/45^-），PCs（CD146⁺/34^-/45^-/56^-）以及AC（CD34⁺/31^-/45^-/56^-/146^-).

对这些hBVSC亚群的进一步表征显示，所有三种前体细胞群体均具有与典型MSCs相似的中胚层发育潜能，包括骨骼肌生成、成骨、软骨形成和脂肪生成。所有hBVSC亚群在新鲜分离状态及培养条件下均表达经典的MSC标志物，如CD44、CD73、CD90和CD105。这些证据 collectively 支持MSCs具有血管来源。此外，MECs、PCs和ACs的治疗能力已在近期的独立研究中得到证实。从成人骨骼肌活检组织中分选得到的MECs被证明比骨骼肌成肌细胞和血管内皮细胞（ECs）更高效地再生受损和营养不良的骨骼肌，并修复受损心肌。从不同人源器官中纯化的PCs也被证实可修复/再生受损和营养不良的骨骼肌，并贡献于卫星细胞池^13-16。最近，我们已证明来源于人骨骼肌的PCs可通过间接旁分泌效应和直接细胞间相互作用有效修复梗死心肌¹⁷。另一方面，ACs可通过组织块培养法直接从移植血管中分离，或通过FACS从人脂肪组织和骨骼肌中纯化获得。在小鼠后肢缺血模型中，已证实ACs具有显著的促血管生成作用¹⁹。 此外，ACs也被证明比传统MSCs更高效地修复梗死心肌，表明ACs在缺血组织修复中具有强大的治疗潜力²⁰。

目前的纯化方案可从单个人体骨骼肌活检样本的脉管系统中，同时前瞻性地纯化出肌内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和血管周围细胞（ACs）。这使得我们能够研究和/或选择最适合特定治疗目的的人体骨血管干细胞（hBVSC）亚群。此外，这一新技术进一步拓展了可从人体骨骼肌获取的干细胞/前体细胞种类，使其成为再生医学中多能前体细胞的理想来源。

方案

1. 肌肉活检样本处理

1. 在运输过程中，将人骨骼肌活检样本置于冰上，并保存于添加了5%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。
2. 收到肌肉活检样本后，在无菌条件下将其从运输容器中取出，并用添加了2%抗生素-抗真菌溶液（A/A）的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次。
3. 在添加了2% A/A的DMEM中，使用无菌剪刀和镊子去除附着的脂肪和结缔组织。
4. 在解剖显微镜下去除大血管，随后将肌肉样本切成小块（<1 cm² 大小）。
5. 将切好的肌肉组织块（<5 克）保存于20 ml保存液（PM；含10% FBS和1% P/S的DMEM）中，4 ℃条件下最多可保存5天。

2. 肌肉组织解离与细胞分离

1. 在细胞分离当天，从PM中取出肌肉组织，用含2% P/S的PBS洗涤两次。制备消化液时，将I型、II型和IV型胶原酶（100 mg/ml）新鲜加入PM中。
2. 用无菌剪刀和镊子在培养皿中将肌肉组织块精细剪切并机械匀浆，同时加入少量PM培养基，直至组织悬液能顺利通过10 ml血清移液管且无凝块形成。在此过程中去除残留的脂肪和结缔组织。每次细胞分离至少使用8–10克成年肌肉组织或2克胎儿肌肉组织。
3. 将4-5克剪碎的成年肌肉组织用10 ml血清移液管转移至20 ml消化液中（或将2克剪碎的胎儿肌肉组织转移至10 ml消化液中）。在37℃下消化50–60分钟。 ℃ 在70 - 80 rpm的摇床上进行振荡。根据组织量相应调整消化时间和/或振荡速度，以优化细胞得率和表面抗原的保存。每15-20分钟观察一次消化情况，直至浑浊度几乎消失。
4. 用10 ml血清移液管将消化后的组织剧烈吹打3-5次。加入等体积的PM终止反应，然后在400 × g下离心4分钟。
5. 小心移除上清液；用 10 ml PM 重悬沉淀，洗涤后经 100 μm 细胞筛过滤 μm细胞滤筛
6. 在400 × g下离心4分钟，小心去除上清液。将沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl）中。₄Cl, 10 mM KHCO₃₃，0.1 mM EDTA），经70 μm滤膜过滤 μm细胞筛以获得单细胞悬液，然后在室温下孵育10分钟。经70-如果观察到任何沉淀，请再次使用 m 细胞滤器。
7. 以 400 × g 离心 4 分钟，将细胞沉淀重悬于 0.5 ml PBS 中。计数细胞数量，至少收集 500 万个细胞用于细胞分选。用 PBS 将单细胞悬液稀释至每毫升少于 500 万个细胞，用于染色。取 50–100 μ将细胞悬液分装至11个管中，用于对照染色（未染色对照、阴性对照和单色阳性对照）。

3. 细胞标记与分选

1. 如有必要，将单细胞悬液在小鼠血清（用 PBS 1:10 稀释）中于 4 ℃ 孵育 10 分钟，以进行封闭。
2. 向单细胞悬液中加入 CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PE 和 CD146-FITC（均为 1:100），于 4 ℃ 孵育 20 分钟。阴性对照组中加入等浓度的 APC-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PE- 和 FITC-偶联的同型 IgG 抗体，并于 4 ℃ 孵育 20 分钟。单色阳性对照组中，分别向各管中加入等浓度的 CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PE 和 CD146-FITC 抗体，并于 4 ℃ 孵育 20 分钟。
3. 孵育结束后，以 400 × g 离心 4 分钟进行洗涤。将细胞沉淀重悬于 1–2 ml 含 5% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 培养基中，细胞悬液终浓度应低于每毫升 500 万个细胞。加入 7-AAD（1:100），于室温孵育 15 分钟以排除死细胞。阴性对照组和单色阳性对照组的细胞沉淀则重悬于 0.5 ml 含 5% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 培养基中。
4. 将所有细胞悬液转移至圆底聚苯乙烯流式细胞仪检测管中。准备细胞收集管（每管预先加入 500 μl 对应的培养基：MECs 使用 MPM 培养基；PCs 使用 EGM-2 培养基；ACs 使用 AC 培养基）。将细胞悬液置于冰上，运送至细胞分选仪。
5. 按未染色对照、阴性对照、单色阳性对照及主细胞悬液的顺序上机进行细胞分选，严格调节激光强度、通道补偿及细胞群门控，以最大化细胞纯度（有关流式细胞术的详细操作，请参考 JoVE 及其他期刊发表的相关文章）。
6. 将目标细胞群收集至对应的收集管中。如不立即接种，应将收集的细胞置于 4 ℃ 保存。

4. 分选后细胞培养

1. 将 freshly sorted MECs（P0）接种 <10,000 个细胞/cm²在预先包被I型胶原的培养板中接种MPM。对于MEC的后续传代，以每平方厘米3,500 - 4,000个细胞的密度接种² 在预先包被了I型胶原的培养板/培养瓶中接种MPM细胞。
2. 将 freshly sorted PCs（P0）接种 <20,000 个细胞/cm² 在新鲜涂有0.2%明胶的培养板中，用EGM-2培养基接种细胞。后续传代PCs时，以1:3比例将细胞接种至PC培养基（DMEM添加20% FBS和1% P/S）中的普通聚苯乙烯培养板，直至P2代。从P3代开始，以每平方厘米6,500–7,000个细胞的密度接种细胞。² 在PC培养基中接种于常规的聚苯乙烯培养板/瓶。
3. 将新近分选的ACs（P0）接种于 <20,000 个细胞/cm² 在AC培养基（DMEM添加20% FBS和1% P/S）中接种于常规聚苯乙烯培养板上。后续传代AC时，以6,500 - 7,000个细胞/cm²的密度接种细胞² 在AC培养基中接种于常规聚苯乙烯培养板/瓶。

结果

首先根据未染色对照、阴性对照和单色阳性对照获得的数据校正FACS参数。在排除死细胞后，对荧光标记的细胞悬液进行一系列阴性和阳性细胞表面标志物筛选。首先圈选CD45⁺细胞，然后从CD45^-组分中分离出CD56⁺和CD56^-细胞。CD56⁺组分进一步进行CD34-CD144筛选，仅将CD34⁺/CD144⁺（双阳性）细胞标记为MEC（CD34⁺/56⁺/144⁺/45^-），并随后收集（图1）。类似地，CD56^-组分进一步进行CD34-CD146筛选，仅将CD34^-/CD146⁺细胞标记为PC（CD146⁺/34^-/45^-/56^-），并随后收集（图1）。CD34⁺/...

讨论

鉴定和纯化人骨髓血管周围干细胞（hBVSC）亚群是理解间充质干细胞（MSC）发生过程的重要进展。越来越多的证据表明，MSCs起源于血管周围区域，并且组织特异性前体细胞与血管之间存在关联^22-25。 此外，分离出均一的hBVSC亚群的能力，有助于进一步理解MSC的异质性以及血管细胞生物学特性²⁶。

在过去几年中，MECs、PCs 和 ACs 已通过不同的实验方案在各自独立的研究中被分别鉴定和分离。然而，由于难以优化组织解离步骤以及缺乏能够同时识别 MECs、PCs 和 ACs 的特异性细胞谱系标志物组合，目前尚未有研究尝试从人类骨骼肌组织中同步纯化这三种 hBVSC 亚群。本文介绍了一种新的细胞分离方案，通过改进组织解离流程并采用一组新的特异性细胞表面标志物组合，可从单个人类肌肉活检样本中同时纯化 MECs、PCs 和 ACs（图 1）。为获得最佳结果，本方案中需特别关注的关键步骤包括：1. 组织样本的新鲜程度与保存条件；2. 通过密切监控消化过程并调整组织解离时间，以优化细胞得率和表面抗原的完整...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 型胶原酶	Sigma	C5894	无菌瓶装
2 型胶原酶	Sigma	C1764	无菌瓶装
4 型胶原酶	Sigma	C1889	无菌瓶装
抗人 CD34 APC	BD Pharmingen	555824	保持无菌
抗人 CD45 APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	保持无菌
抗人 CD56 PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	保持无菌
抗人 CD144 PE	Beckman Coulter	A07481	保持无菌
抗人 CD146 FITC	AbD Serotec	MCA2141F	保持无菌
FACS Aria II 流式细胞仪	Becton-Dickinson
EGM-2 完全培养基	Lonza	CC-3162	用于祖细胞培养（仅 P0 代）
DMEM 高糖（1X），液体，含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠	Invitrogen	11965	用于祖细胞培养
DMEM 高糖（1X），液体，含 L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠	Invitrogen	11995	用于肌上皮细胞和成纤维细胞培养
胎牛血清	Invitrogen	10437-028
热灭活马血清	Invitrogen	26050-088
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
抗生素-抗真菌剂（100X）	Invitrogen	15240-062
胰蛋白酶-EDTA 0.5%（10X）	Invitrogen	15400-054
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS）	Invitrogen	14190-250
鸡胚提取物	Accurate Chemical	CE650T-10	使用前过滤