优化和利用农杆菌介导的瞬态蛋白生产中烟草

摘要

基于真空浸润土壤杆菌携带发射向量（ 烟草花叶病毒为基础）是一种快速和经济的方法来生产疫苗抗原和治疗性蛋白质的瞬态蛋白生产中烟草属植物。我们简化了程序，并通过优化细菌培养的条件，在选择宿主物种，并同时引入的RNA沉默抑制改善目标的积累。

摘要

农杆菌介导的瞬时蛋白质的生产在植物中是有前途的方法，以一个短的时间周期内产生的疫苗抗原和治疗性蛋白质。然而，这项技术才刚刚开始被应用到大规模生产尽可能多的技术障碍，以扩大目前正在克服。在这里，我们展示了工业规模的瞬态蛋白生产简单，重复性好方法基于烟草植株农杆菌携带发射向量的真空渗透。 农杆菌培养的AB培养基的优化可直接稀释细菌培养在Milli-Q水的，简化的渗透过程。其中烟草 ， 北三个品种测试excelsiana（烟草本塞姆氏×N.刨花 ）被选定为最有希望的宿主，由于易于渗透，高级别报告蛋白的生产，和大约2-F在受控环境条件下老更高的生物量产生。诱导农杆菌窝藏pBID4-GFP（ 烟草花叶病毒为主），使用化学物质，如乙酰丁香酮和单糖对蛋白质的生产水平没有影响。在50至100毫巴，30或60秒浸润植物导致植物叶组织中约95％的浸润。浸润土壤杆菌实验室菌株GV3101中表现出最高的蛋白质的生产相比， 土壤杆菌实验室菌株LBA4404和C58C1和野生型农杆菌菌株AT6，AT10，at77和A4。共表达的病毒RNA沉默抑制，P23或P19，在北本生导致早期靶蛋白（流感病毒血凝素）的积累和产量增加（15-25％）。

引言

植物现在被确认为用于生产异源重组生物制药和工业蛋白^1-3安全，可靠，可扩展的和廉价的平台，有超过微生物和动物细胞表达系统^4个重要的优点。植物能够表达正确折叠的蛋白质与翻译后修饰，包括组装的多聚体抗体^5-7。几种植物来源的重组药用蛋白正在接受临床评估^8。在这些患者特异性重组基因型疫苗（抗体）对非霍奇金淋巴瘤^9，血凝素为基础的大流行和季节性流感候选疫苗^{10,11（Cummings} 等人 ，提交给疫苗），抗链球菌表面抗原Ⅰ的治疗/ II抗体，用于治疗龋齿¹²的，与人胰岛素的糖尿病¹³的治疗。此外，人类的RECOmbinant葡糖脑苷脂酶的患者Gaucher病的酶替代疗法已被批准在以色列和美国，而根据扩大使用计划提供了美国^14,15之外。

异源蛋白可以在稳定转化的（转基因或叶绿体转）或瞬时转化的植物来生产。瞬态蛋白生产提供了在转基因植物，包括短的时间内实现表达和积累¹⁶对生产许多优点，并且可以通过引入细菌二元载体或重组植物病毒载体导入植物组织⁴来实现。最先进的瞬时表达系统是基于使用的"发射矢量"相结合的植物病毒和二元质粒的组件，并通过农杆菌渗入^17,18交付。基于烟草花叶病毒 （TMV）发射载体农杆菌已成功应用在实验室规模生产疫苗抗原对病原体如人类乳头状瘤病毒^19， 鼠疫耶尔森氏菌 ^20，流感病毒^21,22， 炭疽杆菌 ^23，并在北天花病毒²⁴ 本塞姆氏叶。 农杆菌介导的瞬时表达也是一种很有前途的方法，同时生产多种蛋白质^2,25-27的。例如，植物瞬时表达系统已被用于产生肿瘤特异性的重组抗体^28,29，针对表皮生长因子受体³⁰糖基化的重组抗体，并具体针对炭疽保护性抗原^31,32的单克隆抗体。共浸润与靶基因和基因沉默的结果在增强靶蛋白表达^33,34抑制基因本氏烟植物。

农杆菌是用于均匀introdu的常用方法庆安细菌窝藏感兴趣的基因导入植物组织^35-37。 农杆菌真空渗透在完整植物瞬时基因表达的叶子是一种快速，可扩展的和有用的方法用于生产外源蛋白质，而不需要产生的转基因植物^38-41。在真空农杆菌，植物翻转倒过来，地上部分淹没在农杆菌悬浮液。然后抽真空，使气体从叶片细胞间隙通过气孔撤离。真空结果在农杆菌悬浮液进入叶子的输注快速重新加压下释放。以下农杆菌真空渗透，植物栽培进一步和目标的表达进行监测。目标表达的最高水平，通常观察到2-3天发表浸润（dpi）的一个二进制向量和4-7 dpi，采用一个发射向量，在这之后的表达水平通常decreaSES ^{17,18,42-45。} 农杆菌是最广泛使用的车辆递送感兴趣的基因导入植物的蛋白质产量。农杆菌工作非常出色的全本生但相对较差，在大多数其他植物，包括拟南芥^46。

在这项研究中，我们在5-6周龄北路开发的瞬态蛋白生产一种简单，高效，经济的方法A.使用本生农杆菌浸润。工业尺度的农杆菌渗入法的主要缺点是收获的细菌和含4'-羟基-3的细菌沉淀在培养基中再悬浮的离心'，5'-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮），单糖，以及2 - （N-吗啉代） -乙磺酸（MES）缓冲液诱导vir基因。我们已经能够通过优化农杆菌来克服这些问题的生长在AB培养基（基础培养基），然后直接稀释于Milli-Q水中并通过控制渗透时间和条件。我们还比较了目标蛋白质的生产中，野生型烟草宿主物种N。本生和N。木丝 ，以及在混合N。 excelsiana。

方案

1，植物生长

对于后续的农杆菌我们评估两个野生型烟草属物种在室内设施水培的岩棉（ 烟草本塞姆氏和N精益求精 ）和混合动力（N. excelsiana）。

1. 浸泡岩棉板在植物肥料的解决方案。
2. 母猪的野生型N.种子本生，N.精益求精和N。 excelsiana对营养物质（ 烟草本塞姆氏×N。精益求精的混合）浸泡岩棉表面。
3. 成长在受控条件下（24℃和40-65％相对湿度）从种子植物和长日照光周期（14小时光照和10小时黑暗，用130-150μE米照明^-2秒^-1） 4-5周为N。本生和N。 excelsiana，和5-6周为N。精益求精。

2，项目建设载体的Agroinfiltrat离子

1. 从流感病毒（HAC1）的A/California/04/2009株插入合成的报告基因（绿色荧光蛋白[GFP]），全长血凝素（HA），并重新设计的地衣多糖酶^{（LicKM）18}分开成推出矢量pBID4 ^18（TMV的矢量），获得pBID4-GFP，pBID4-HAC1和pBID4-LicKM，分别^{18,32,41,47。}
2. 引进10-50纳克pBID4携带GFP或HAC1到A的电感受态细胞癌农杆菌菌株GV3101和LicKM到A的电感受态细胞农杆菌菌株GV3101，C58C1，GLA4404，AT06，AT10，At77和A4与基因MicroPulser电穿孔。
3. 使用转化的农杆菌渗透实验除非另有说明。

3，真空农杆菌渗入烟草植物

1. A.成长农杆菌在LB培养基，YEB MED菌株隔夜（O / N）鎓或AB培养基中卡那霉素50毫克/升，在28℃振荡在200-250转。
2. 在Milli-Q水稀释至土壤杆菌在600nm处0.5或离心机农杆菌细胞在4000×生长在LB或YEB或AB型的光密度（A _600） g下在4℃下10分钟，重新悬浮在诱导培养基（1×MS盐，10mM的MES，200μM乙酰丁香酮，2％蔗糖[MMA]）为0.5 A _600，并在室温下搅拌1-3小时，除非另有说明。
3. 浸没烟草属植物气生组织在农杆菌悬浮液中并施加50-400毫巴的真空为30或60秒的渗透在真空室中的植物。最佳的浸润是经常在50-100毫巴60秒施加。
4. 一旦真空被破坏，从真空室取出的植物，在水冲洗，并在用于预浸润生长相同的生长条件下生长5-7天。
5. 要测试的功效的化学物质诱导的农杆菌 vir区基因，不同浓度的乙酰丁香酮的（0，100，200或400μM）加入到农杆菌悬浮于渗透缓冲液（1X MS，10mM的MES，2％葡萄糖）。对于单糖的诱导vir区基因，葡萄糖（0，1，2或4％）的不同百分比的效果加入到土壤杆菌悬浮在渗透缓冲液（1X MS，10毫MES，200μM乙酰丁香酮）。N.本塞姆氏植株渗透在步骤3.3和3.4），如上所述。
6. 农杆菌实验室菌株GV3101，C58C1和LBA4404和野生型菌株A4，AT06，AT10和At77窝藏pBID4-LicKM载体稀释在Milli-Q水至A ₆₀₀ 0.5。N.本塞姆氏植株浸润在步骤3.3和3.4上面提到的每个特定菌株。

4，联合农杆菌程序的病毒沉默抑制

1. MIX的Milli-Q水稀释农 ​​杆菌 GV3101文化携带绿色荧光蛋白基因和番茄丛矮病毒 （TBSV）的病毒沉默抑制因子P19在1:1，2:1，3:1和4:1的比例。 N.渗透如上所述， 本塞姆氏烟草植物。
2. N.渗透本塞姆氏烟草植物具有两个Milli-Q水稀释农 ​​杆菌 GV3101培养物的混合物:第一承载pBID4-HAC1质粒和第二承载沉默抑制子的1 - TBSV或柑桔衰退病毒的P23的P19，在pCassp质粒（ pCassp19）和下35S启动子（PGR-P23），分别在比4:1的PGR二元质粒。

5，蛋白质印迹分析

1. 随机收集树叶样品从北本生，N.精益求精或N。在4-7 dpi的excelsiana植物和液氮中粉碎成细粉。
2. 加入含0.5％的Triton三卷的1×PBS缓冲液X-100至每个样品孔。
3. 在4℃下轻轻摇动提取的样品进行15分钟
4. 旋转的提取物进行5分钟，并收集可溶性蛋白到一个干净的Eppendorf管中。
5. 稀释的提取物，以适当的稀释度（1:50 1:100）中的1×PBS提取缓冲液，并添加5×样品缓冲液（250mM的Tris-盐酸[pH为6.8]，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油体积/体积，和500mM DTT）到最终1×浓度。
6. 煮沸样品5分钟。
7. 分离的蛋白质用10％SDS-PAGE，转移到Immobilon-P转移膜，并用0.5％的I块阻塞。
8. 使用兔多克隆抗GFP抗血清在1:5000和使用的HAC1小鼠抗多组氨酸单克隆抗体在1:1,000阻断1小时溶液检测GFP。
9. 经过初级抗体标记，洗膜3次，每次用1×PBST-20 10分钟和孵育用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔抗体以1:5,000或HRP-共轭ð抗小鼠抗体在1:10,000 1小时后，对GFP和HAC1检测，分别。
10. 用西方的SuperSignal皮克化学发光底物处理印迹。
11. 使用GeneTools软件来分析蛋白质的谱带强度，并获得带校准量。

蛋白生产:（校准量×稀释样品）/样品的装载量）×4 =毫克/千克。
公式:蛋白质生产（P），校准量（C），样品（D）的稀释和样品装载量（S）。

6，酶谱分析

1. 收集pBID4-LicKM-N。渗透本塞姆氏烟草随机组织样本。
2. 使用上述用于Western印迹分析的相同方法提取蛋白，然后通过10％SDS-PAGE分析用0.1％的地衣多糖包括在凝胶。
3. 电泳后，洗净凝胶2次，每次10分钟，在洗涤缓冲液（100mM Tris-盐酸[pH为8.0]，0.1％的Triton X-100），然后孵育在洗涤缓冲液中，在65℃下反应1小时。
4. 温育后，弃去洗涤缓冲液和染色的凝胶用0.5％的刚果红5分钟，在室温下进行。
5. 漂洗在Milli-Q水凝胶3次，每次10分钟，并添加1M NaCl的形象化地衣多糖的活性。纯化的细菌地衣多糖蛋白作为阳性对照的酶活性。

7，绿色荧光蛋白成像

1. 使用一个手持的长波长UV灯进行视觉检测在整个瞬时转化植物的GFP荧光。
2. 照片瞬时通过黄8转化用数码相机拍摄的植物，ES 52过滤器（曝光时间，15秒）。
3. 从Western印迹获得的图像分析用的GeneGnome的GeneSnap软件和使用GeneTools软件量化的结果，与基于纯化的GFP标准的校准曲线。
4. 使用基于洁净工作台的校准曲线定量的HAC1蛋白从流感病毒的A/Indonesia/05/05应变版HAC蛋白质标准。
5. 从3-4计算平均值复制所有实验。

结果

植物生长的营养需求。采用水培植物生长介质（岩棉）和营养液，确保N的均匀性本生增长和消除复杂性（机械，管理和效率）使用土壤植物栽培相关。我们长大N.在本生浸泡在市售肥 ​​料，以确定植物的生长和生物量积累的最佳条件岩棉板。我们观察到95-100％的种子发芽。要注意的是，包括磷关键是要实现发芽，因为我们发现缺乏磷营养液未能支持萌发和N的增长本塞姆氏烟草的种子（ 图1A）。

农杆菌生长和植物健康和蛋白生产渗透介质的影响。我们已经测试了几种介质条件下，优化T的效率他农杆菌技术大规模生产。细菌（ 根癌农杆菌 GV3101菌株）窝藏pBID4-GFP的构建体进行培养O / N在不同培养基条件（YEB，LB或AB）的情况下以及在离心并重新悬浮在诱导培养基（MMA）（含1×的Murashige＆ Skoog培养基[MS]基础盐混合物，10毫MES pH 5.6的20 g / L的蔗糖和200μM的乙酰丁香酮）或稀释在Milli-Q水中的0.5 A ₆₀₀使用对植物渗透之前。我们观察到，与细菌稀释水厂真空渗入导致蛋白质生产比得上在以前的报告^42,48实现与任何渗透介质。相比之下，浸润在YEB或LB培养基中生长稀释农 ​​杆菌导致N的完全萎蔫本塞姆氏烟草叶在不到24小时后的渗透，同时在AB培养基中生长的未稀释土壤杆菌对渗透植物的健康没有影响（DAT一个未示出）。 如图1B，植物渗透与生长在YEB，LB型或AB型的媒体和Milli-Q水（1:5，A ₆₀₀ 0.6-0.8或1:10时，A ₆₀₀ 0.3-0.4的）显示稀释农 ​​杆菌培养无自觉症状和表现，平均GFP生产1645，1520和1839年，分别。 农杆菌离心和重新悬浮在诱导培养基（MMA）没有表现出症状，并没有显著差异蛋白生产相比， 农杆菌直接稀释在Milli-Q水（ 1671±102和1667±131毫克/公斤，分别）。因此，Milli-Q水被推荐用于稀释农 ​​杆菌培养物用于植物浸润和常规地用在我们的后续实验以达到0.5的A _600。

目标表达农杆菌悬浮细胞密度和时程的影响 ， 我们下一步研究，如果细菌细胞密度影响渗透和靶的表达水平的效率。为了这个目的，我们评估了土壤杆菌的四个不同的细胞悬浮液的密度携带pBID4-GFP，1.0 A _{600，0.5，0.1}和0.05。下面渗透，N。可见症状的发展和目标的表达时程通过收集样品在4,7和10 dpi的本塞姆氏植株进行了监测。在4 dpi时，我们观察到植物渗透与农杆菌不同的细胞悬液密度间（没有观察到GFP表达为0.05 A _600）中的GFP荧光明显的差异。在7 dpi时，GFP荧光是植物在渗透的₆₀₀ 1.0，0.5和0.1的细胞悬浮液的密度相近，但明显低于植物渗透在0.05的A _600。 如图1C，这些数据是通过Western blot分析证实，在4 DPI收集的样本，显示在一个₆₀₀非常低蛋白生产600>。在7 dpi时，植株中的GFP估计生产无显著差异在1.0，0.5和0.1（1,662，1,870和1,890，分别）A _600，而0.05的₆₀₀表现出较低的绿色荧光蛋白的生产（1,199毫克/千克）。相比之下，在10 dpi的绿色荧光蛋白生产没有差异，植物渗透与任何四个细胞悬液密度（1,218，1,181，1,197和1,304）之间变化。

浸润与农杆菌替代的菌株。为了提高农杆菌菌株可用于瞬态蛋白生产的多样性，我们测试的野生型菌株。这些菌株，从冠瘿自然宿主中分离，被好心Gelvin博士（美国普渡大学西拉法叶，印第安纳州）提供的。重新审视自己在短暂的蛋白质生产工具，我们渗透N.本塞姆氏烟草使用以下菌株卡尔英pBID4-LicKM ^18:A。发根农杆菌 （A4）和A。根癌土壤杆菌的野生型菌株内斯特A348，A208，和A281（名为AT6，AT10，及At77，分别），以及经改造的实验室菌株A的农杆菌 GV3101，C58C1和LBA4404。该叶片渗透，收集了7 DPI和LicKM表达水平进行估计Western blot检测。 ; 如图2A所示 ，LicKM生产的最高级别可以与菌株GV3101，A4和LBA4404（〜1750±163 1650±26和1450±117毫克/公斤，分别），有轻微的差异来实现表达水平最低（〜900±102毫克/千克）与C58C1;和中间体生产与AT6，AT10和At77（〜1,250±19，±1,100 42和1200±111毫克/公斤，分别）。使用酶谱测定中的地衣多糖酶的活性被证明。 图2B表明，地衣多糖使用任何在渗透植物组织中产生农杆菌菌株为酶催化活性。人们还应该注意的渗透与A4和At77株烟草本塞姆氏植株的病理症状（矮化，叶柄伸长率和卷曲，叶片卷曲），而与AT10拉伤症状轻微。没有症状，观察渗入了实验室菌株GV3101（ 图2C） 本塞姆氏烟草植物。

替代烟草属物种浸润。我们比较了在烟草属（ 本塞姆氏烟草和N刨花 ）和在混合物种，N. 2野生型物种的生物质的产生和蛋白质生产的速率excelsiana（本氏烟×N。精益求精的 ）。测试种类，N的本塞姆氏烟草 ，一种广泛使用的宿主，使用土壤杆菌为基础的或基于病毒的表达系统^2,34,4瞬态蛋白生产9，达4-5周发芽的内浸润的准备。必要的生长期间，以产生生物量的最佳水平也是4-5周为N。 excelsiana但较长（6-7周）为N。精益求精 。此外，植物节间相对较短为N。精益求精相对于其他烟草属物种。

此外，我们观察到N的那个真空渗本生和N。 excelsiana在50-250毫巴60秒是整个叶片农杆菌高效，而N。精益求精难以渗透，由于其较低的冠层和坚韧的叶子，即使当施加真空3次，每次1分钟，在非离子型表面活性剂如Sillwet-77或S240的存在。另外，N的发芽率excelsiana和N。精益求精的种子是〜40-50％;为了提高发芽率90-100％，种子，必须用10％BLEA处理CH播种前1小时。在相同的生长条件下，可以从N.产生最高的叶生物量excelsiana是约2倍高的与N.相比本塞姆氏烟草 （ 表1）。

蛋白生产进行了检查中北路本生，N.精益求精和N。 excelsiana渗透与农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4-GFP。 GFP积累于7 dpi的全部渗透叶子使用UV光随后通过Western印迹分析进行评估。 图3A示出，即使在全分布的GFP 本生和N excelsiana和N.分布不均刨花 （由于浸润N.精益求精的整个叶片面积的难度）。 图3B显示了GFP的生产通过UV光照射在从3 烟草属物种在7 dpi的收集渗透叶子估计的水平。 GFP的积累相关特征研水平是高北路本塞姆氏 （〜2.23克/公斤）比N。 excelsiana和N。怡东 （〜1.89和1.54克/公斤，分别）。蛋白生产中N的水平低精益求精是由于不均匀的渗透和在采集的叶片积累了GFP的分布。

我们观察到，上部叶片直接暴露在光线常常表现出短暂的绿色荧光蛋白的积累（2-4 dpi）的最早和最高水平高于林冠下叶。然而，在我们的研究中，绿色荧光蛋白的积累是最高的7 DPI，并均匀分布最树叶，除了在uninfiltrated新成长叶子没有显示绿色荧光蛋白的积累。

影响真空压力和持续时间短暂的蛋白质生产。真空渗透显著增加比较施加的压力手工注射针注射器⁴²的瞬时表达水平。的应用真空会导致气体从沉水植物叶片气孔通过疏散。当真空被破坏，压力急剧增大， 根癌农杆菌的悬浮液被打入叶片，以取代抽空气体^50。

要测试的真空压力N的叶片的效果本生 ，我们渗入植物与农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4-GFP的各种真空压力（50-400毫巴）为30或60秒以下。由此表明了更强的真空（低于50毫巴），施加30或60秒的结果中渗入叶片机械损伤，浸润（24-48小时）后不久，导致组织萎蔫和植物死亡。另一方面，应用较温和真空（400毫巴）得到的仅50％的叶面积和GFP产量（303±90毫克/千克）（ 图4A）水平的降低浸润。重要的是，我们观察到在50，10在GFP的生产无差异0到200毫巴（1,651±107，±1,688 40 1,594±26毫克/公斤，分别）（ 图4A）和温和无，时已用于30或60 50-200毫巴的真空压力对植物健康的有害影响秒。因此,50-100毫巴的真空压力被推荐用于浸润实验。

在目标表达的真空持续时间的作用是通过渗透N的一个平坦评估每隔一小时用的GV3101的0.5的A ₆₀₀窝藏pBID4 本塞姆氏烟草植物- GFP 8小时在相同的土壤杆菌培养图4B示出了绿色荧光蛋白的生产水平是相似的在所有时间点多达8小时，这表明在这个的时间周期农杆菌保持其推出的单链DNA的能力。

化学诱导对蛋白质的生产。某些植物酚类代谢和糖可以INDA的UCE的毒力基因农杆菌 ^1,52。作为结果，许多化学品和monosaccharaides已报道提高瞬态蛋白生产中的各种植物物种。乙酰丁香酮是最常见加到A的文化根癌农杆菌^40,53-57前诱导VIR操纵子。

我们已评估不同浓度的乙酰丁香酮（0，100，200和400微米）和葡萄糖（0-4％）的瞬态GFP蛋白生产中N的效果本生渗透与农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4 -绿色荧光蛋白。为了这个目的，我们重新悬浮于含有不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖为浸润前1-3小时农杆菌细胞中MMA的诱导培养基。根据这两个视觉观察（数据未显示）和蛋白质印迹分析（ 图4C），各测试浓度的结果这些化合物的诱导与控制，其中诱导培养基不含乙酰丁香酮或葡萄糖相比显著增加GFP荧光或蛋白质的生产。

共同浸润在短暂的生产和绿色荧光蛋白基因HAC1在N的沉默抑制子的作用本塞姆氏叶，它先前已经证明，共同表达一个沉默抑制子（ 番茄丛矮病毒 P19 [TBSV]）干扰转录后基因沉默（PTGS）的，从而提高了生产报告蛋白^34。

我们已评估的共浸润N的效果本生与发射载体携带绿色荧光蛋白报告基因（pBID4-GFP）和P19。 A ₆₀₀ 0.5之前的渗透，一个A的稀释液农杆菌 GV3101文化窝藏pBID4-GFP和P19分别在混合1:1，2:1，3:1和4:1。快车比的沉默抑制子的离子是由花椰菜花叶病毒 35S启动子控制。如图中箭头7 dpi的（ 图5A）Western印迹分析的结果，P19的存在不增加或减少的GFP产量N。本塞姆氏烟草 ，在两个农杆菌悬浮液的任何比率。

我们还比较了两种病毒基因沉默抑制子的作用 - p23and P19 - 预防PTGS的HAC1。 土壤杆菌培养物进行的发射矢量pBID4-HAC1（H1N1 A/California/04/2009）和两种病毒沉默抑制子的质粒中的一个分别稀释为0.5的A _600，分别以4:1，的比例混合，并共同渗入4 - 5周龄N。本塞姆氏 。 A的悬浮液农杆菌携带pBID4 -孤独的HAC1浸润作为对照。该渗入叶样品分别采自3至8 dpi的。该实验是REPE的HAC1表达ATED三次，平均水平通过Western印迹分析测定。

这表现在图5B中，共浸润N的本塞姆氏烟草与P23或P19导致:（642±157和764±108毫克/千克，分别）与不使用沉默抑制子（约15-25％，分别）在6 dpi的相比增加的HAC1的生产。这表明，P23和P19是有效的在我们的系统中。然而，应该指出的是HAC1的积累发生在一天前，当pBID4-HAC1是共同渗入了P19。因此，我们的结果表明，在HAC1的沉默抑制子P19和GFP积累的影响是不同的，这表明瞬时表达和/或一些蛋白质在N。稳定性的选择性增强本塞姆氏 。

我们还观察到，无论是在存在和不存在一个沉默抑制子的HAC1蛋白督促水平的减税开始在7 dpi的下降。这表明，在短暂的蛋白质生产中烟草本塞姆氏渗透与发射向量的下降的定时是靶特异性的。

每年农杆菌携带的发射矢量的细胞库被评价为靶基因的稳定性， 农杆菌生存能力和蛋白质积累的水平。 GV3101菌株转化的保存在-80℃下该pBID4-HAC1的细胞库的甘油已经被证明是非常稳定超过三年没有变化的瞬态蛋白生产中熔渗N的电平植物本生 图5C表明，HAC1蛋白生产Western印迹在多年的2010年，2011年，2012和2013年的估计是670，685，566和683毫克/公斤。平均HAC1生产N.本生植物为651±49.4毫克/公斤。

表1 N的比较本塞姆氏烟草和N excelsiana植物的生物量生产。

图1中北路瞬时基因表达的Western blot分析本塞姆氏（A）六周龄N。本塞姆氏 1）植物中含有4.8％的磷的肥料溶液中生长，2）植物生长在含0％的磷化肥的解决方案。二十五微克的鲜叶重量相当于每车道被加载。生产的GFP（二）比较植物真空渗透与pBID在三种不同的培养基上生长4-GFP-窝藏农杆菌 GV3101文化:YEB，AB和LB。 GV3101培养物生长的O / N中的YEB或LB培养基中低速离心，然后重新悬浮在诱导培养基（MMA）（泳道:MMA-1和MMA-2，分别），或在YEB生长O / N，LB或AB媒体和直接稀释至1:5或1:10用Milli-Q水（泳道:YEB / 5和YEB/10，AB / 5和AB/10; LB / 5和LB/10）（C）的比较。在4,7和10 DPI下真空浸渗不同A的浓度（1.0的_{600，0.5，0.1}和0.05），GFP的表达根癌农杆菌 GV3101菌株携带pBID4-GFP。

N的图2。瞬态地衣多糖生产和活性的比较下真空渗植物本生与迪菲租农杆菌株。 农杆菌株（GV3101，A4，At77，C58C1，AT6，AT10和LBA4404）的窝藏推出矢量pBID4-LicKM被单独潜入北叶文化本塞姆氏 。 农杆菌 （三）影响（野生型A4，AT10，At77和实验室菌株GV3101）渗入叶片，收集了7 dpi的。（A）地衣生产Western印迹定量（B）酶谱分析，通过酶的活性证明地衣生产。渗透于全在7 dpi的本生植物健康。鲜叶重量相当于二十五微克每车道被加载。

在N的叶子图3。瞬态GFP表达benthamia呐，N. excelsiana和N精益求精的7 DPI后，真空渗透与A。农杆菌窝藏推出矢量pBID4 -绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白的积累GFP表达的紫外光灯（A）外观检查（B）Western blot分析。

图4。真空压力（A）对瞬时表达GFP和植物健康。N.本塞姆氏植株渗透与pBID4 -下的400，200，100或50毫巴的真空压力GFP，在30或60秒的真空保持时间（B），稳定性和A的感染力在北根癌农杆菌本生渗透与农杆菌 GV3101窝藏pBID4-GFP生长在AB中，稀释至0.5的A _600。 Agroinfiltration被浸润N的一个单位进行每隔一小时本生植物在不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖上的GFP瞬时表达的相同的稀释农 ​​杆菌培养物（泳道0-8），（C）的影响。在农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4 - GFP生长O / N中的YEB介质中，离心，再悬浮于0.5的A ₆₀₀要么在MMA含2％葡萄糖与乙酰丁香酮在0，100，200或400μM，或在MMA含200 μM乙酰丁香酮以葡萄糖为0，1，2或4％。 农杆菌悬浮液保持3小时，在室温下渗透之前。

图5。在短暂的蛋白质生产中北路沉默抑制的影响本塞姆氏叶。 （一绿色荧光蛋白的以下共同渗透pBID4-GFP和P19在不同的比例）Western blot分析。在7 DPI（25鲜叶重当量微克为每通道负载）（B） 农杆菌的文化承载pBID4-HAC1采集的样品分别被混合在4:1与文化承载的P19或P23沉默抑制比质粒。 土壤杆菌培养物所得到的混合物进行真空渗入植物。 HAC1的渗透组织日常收集多达8个dpi的重组蛋白定量。 农杆菌细胞库（C）稳定性。每年植物渗透与同批次的农杆菌细胞库来评价蛋白的积累。五十微克的鲜叶重量相当于每车道被加载。 请点击这里查看日的大是图。

讨论

在这项研究中，我们已经开发了一个简单的农杆菌协议，用于日常的瞬态蛋白生产中使用农杆菌株携带发射向量选择的烟草属物种。此外，我们已经确定了最佳工艺条件，以实现我们的短暂的植物表达系统中的最高重组蛋白的生产水平。

稀释后的A的真空渗农杆菌菌株GV3101窝藏推出矢量pBID4到N。本生，N. excelsiana和N精益求精导致于7 dpi的更高水平的目标蛋白质的生产相对于其他植物物种，如豌豆渗入了GV3101窝藏苜蓿花叶病毒 -或黄瓜花叶下的35S启动子表达GFP报告基因的病毒为基础的载体^41，或莴苣 ， 龙LYCO梭梭和拟南芥渗透与A的C58C1应变农杆菌携带β-葡萄糖醛酸酶报告基因^57。N.本生和N。 excelsiana很容易真空渗透在50毫巴30-60秒，用90-95％的渗透效率。由于叶片的应用真空过程中土壤杆菌悬浮液的表面上的一些浮叶面积的其余5-10％的未渗透。自启动向量具有对细胞至细胞的运动能力^18，瞬态蛋白积累发生在整个叶片以及叶柄在7 dpi的。在10 DPI时，估计的GFP产量略低，因为pBID4表达载体是能够从单元格之间移动，但不能对全身¹⁸移动;因此，新长出来的叶子不包含向量，不利于生产的目标。此外，重组蛋白质的降解随着时间的推移米唉有助于降低蛋白水平在10 dpi的。我们的研究结果表明，A的那个渗透根癌农杆菌菌株GV3101介导的高水平的瞬态蛋白生产中N的本塞姆氏 。此外，靶蛋白可以被设计为N-末端，C-末端或内部融合到地衣多糖（LicKM），β-1 ,3-1，4 -葡聚糖，这是从热纤维梭菌的热稳定性酶和赋予热稳定性的许多目标蛋白融合^18。 N的渗透本生与甲根癌农杆菌野生型菌株（AT6，AT10和at77）窝藏感兴趣的基因引起轻度或重度症状:叶片卷曲，叶柄伸长率和卷曲。没有病理症状N.观察本生渗透与实验室菌株GV3101窝藏空pBID4载体，而另一些基因插入pBID4并转化为实验室菌株GV3101，C58C1或LBA4404引起轻度坏死反应和叶绿/叶的渗透区域泛黄的症状。造成的野生型农杆菌或茄科植物解除菌株坏死症状先前已经报道^56,57。坏死的反应，可能会导致从III型分泌系统，由IV型分泌系统转移到植物细胞中的细菌蛋白质，和/或敏感性鞭毛^58-60的毒力因子。我们已经发现，短暂的生产异源蛋白质也可以引起致病性和在渗透植物超敏反应离开。许多研究报道不同的植物种类与产能达到5-20倍更高水平的瞬态蛋白生产相比，稳定转化的植物^28,57植物双元载体的农杆菌。我们的数据显示， 全本塞姆氏烟草渗入了GV3101窝藏pBID4-GFP瞬时表达高水平的GFP，其类似于报告的GFP产量的本塞姆氏烟草渗入了土壤杆菌携带PICH-GFPSYS病毒载体（高达80％的总可溶性蛋白^）44。使用我们的发射载体农杆菌导致高生产的耐热蛋白LicKM的，50倍高于使用标准二进制质粒¹⁸观察。

为了测试A的感染力根癌农杆菌和发射矢量的稳定性，我们渗透N的一个平本塞姆氏每隔一小时使用GV3101的相同的Milli-Q水稀释的培养窝藏pBID4-GFP质粒高达8小时。我们的数据表明，GV3101菌株有效地感染性至少8小时，pBID4（发射向量）是非常稳定的8小时之久的渗​​透过程。

GV3101菌株窝藏保存在-80℃下推出的矢量pBID4-HAC1（细胞库）的甘油股票已被证明是非常稳定的三年没有变化的瞬态保护制服在生产中渗入植物。

最佳条件和天后播种42之间35和下生长的烟草本塞姆氏植株最适用于真空浸渗介导的瞬时基因表达^40。年轻的植物（3-4周龄）不能完全是因为树叶漂浮在细胞悬液表面和施加真空的机械效应组织损伤的渗透。在年龄超过45天， 全厂本塞姆氏抽苔阶段中，使用的最佳光照条件下，瞬时表达的水平是低的。

低分子量的酚化合物（乙酰丁香酮）和monosaccharaides（葡萄糖）是已知的诱导vir基因的根癌农杆菌 ^55,61。此外，N的渗透本塞姆氏烟草的二元载体pCAMBIA（GFP）的乙酰丁香酮的存在下，在50-600μM的浓度，显示出稍有增加的瞬态基因表达^40。我们研究了不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖在我们的系统中的作用，加入这些化合物GV3101文化窝藏pBID4-GFP在MMA 3小时，并在发现GFP的表达无明显差异。有趣的是，GV3101文化窝藏pBID4-GFP和稀释于Milli-Q水中的0.5的A ₆₀₀和渗透而不对vir基因的诱导表达的GFP的相同量的那些渗入了诱导的培养。该A.农杆菌vir区基因（次）可能由植物酚类化合物（乙酰丁香酮和芥子酸）和植物monosaccharaides（葡萄糖和果糖）本叶组织中被诱导。因此，我们推测，在外感vir区基因诱导物的存在或不存在的GFP表达水平相似的可能是在植物细胞中表达GFP的发射矢量的复制过程中存在胞质vir区基因诱导剂的作用的结果。

野生型N。本塞姆氏烟草已被用来作为一种模式的主机的瞬态蛋白生产^49。然而， 本氏烟的比较低的生物质产量阻碍其大规模生产重组蛋白的应用。最优的主机应结合高水平瞬时表达的，易于生长在温室中，并易受农杆菌浸润^2。选择其他主机，我们渗透烟草 （ 烟草本塞姆氏和N精益求精 ）的两个不同的野生型品种和混合N. excelsiana（本氏烟×N。精益求精 ）与A。农杆菌菌株GV3101窝藏pBID4-GFP质粒。在这三种物种，GFP的表达水平是在N.略高本塞姆氏。N.精益求精的植株难以真空农杆菌由于其坚韧的叶子，和N。 excelsiana生产约2倍在相同生长条件下更多的生物量。瞬态生产的GFP在7 dpi的是N。比较相似本生和N。 excelsiana。因此，N。 excelsiana可能是更合适的宿主生产重组蛋白质。

农杆菌介导的瞬时蛋白质的生产是通过PTGS ^26，其可通过共表达的基因沉默植物病毒起源⁶²的抑制剂可以克服的限制。瞬态蛋白生产先前已显示出提高了50倍于TBSV的P19蛋白质，其抑制PTGS中渗入组织³⁴的存在。在我们的研究中，我们评估了两种病毒沉默抑制子（P19和P23）分别共同渗透，推出矢量pBID4-HAC1的效果。共渗这些沉默抑制子的似乎对HAC1的瞬时表达的影响不大，在HAC1仅略有增加蛋白的积累（15-25％）在共同渗透P23或P19的存在。积极影响蛋白的生产，沉默抑制可能需要被具体地选择为有效的靶向植物种类和病毒载体^63。烟草花叶病毒解螺旋酶具有RNA沉默活性的^64,65的抑制器。我们的数据证实了这种观察作为共渗P23或P19用pBID4-HAC1的导致不增加GFP或在瞬时的HAC1蛋白的生产略有增加。

总之，我们修改和优化厂房及农杆菌生长条件，提高真空渗透效率。这种技术使我们能够在几个小时内生长和渗透几百千克植物材料。我们成功地为自动化高通量疫苗生产在工业规模工厂的瞬态表现手法下，现行良好制造规范（cGMP）的条件。 ABO血型的更多信息UT自动化和利用植物瞬时蛋白质生产系统生产重组蛋白，包括亚单位疫苗候选，cGMP的条件下，读者可以参考该网站www.fhcmb.org/ 。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nicotiana benthamiana	烟草种质资源保藏，北卡罗来纳州立大学作物科学系	PI 555478 TW16	Infiltration
Nicotiana excelsior	烟草种质资源保藏	555685 PI TW47	Infiltration
Nicotiana excelsiana	Wayne Fitzmaurice 博士，大型生物公司，加利福尼亚州瓦卡维尔	LSBC EBA 042304.02	渗透
真空撬块	阿巴斯，马萨诸塞州阿什兰	定制	植物渗透
Rockwool	Grodan Inc.，加拿大安大略省	AO 50/40	用于植物生长的水培介质
2-（N-Morpholino） 乙磺酸	Acros Organics，新泽西州赛默飞世尔科技	172595000	缓冲液
Murashige &Skoog 盐（MS 盐）	植物技术实验室	M524	组织培养基
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	D134406-5G	农杆菌诱导
Immobilon-P 转移膜	Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州	IPVH00010	蛋白质印迹
I-block	Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城	T2015	蛋白质印迹
兔多克隆抗 GFP 抗血清	Washington Biotechnology， Baltimore， MD		Western blotting
小鼠 anti–多组氨酸单克隆抗体	Qiagen GmbH， Hilden	34670	Western blotting
辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体	Jackson ImmunoResearch，宾夕法尼亚州 West Grove	111-035-003	Western blotting
辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体	Jackson ImmunoResearch，宾夕法尼亚州 West Grove	115-035-003	Western blotting
SuperSignal®West Pico 化学发光底物	Thermo Scientific Pierce， Rockford， IL	34078	Western blotting
地衣聚糖（1-3：1-4-β-D-葡聚糖）	Megazyme， Bray， Co. Wicklow， Ireland	P-LICHN	地衣酶活性
刚果红	Sigma-Aldrich， St. Louis， MO	C6277	凝胶染色
数码相机	奥林巴斯，宾夕法尼亚州中心谷	C-8080	化学发光成像
GeneGnome	同基因，弗雷德里克，马里兰州		发光成像
GFP 标准	自制		化学发光成像
植物肥料溶液	Griffin 温室苗圃用品，纽瓦克，DE	67-23-20	植物生长
地衣酶标准品	内部		蛋白质印迹
MicroPulser 电穿孔仪	BioRad，Hercules，CA	165-2100	农杆菌转化