用于从未处理全血中测量中性粒细胞趋化性的微流控平台

摘要

本方案详细描述了一种旨在通过一滴全血测量人中性粒细胞趋化性的实验方法，具有高度的可重复性。该方法无需分离中性粒细胞，且实验准备时间仅需几分钟。微流控芯片技术使得在样本量有限的婴儿或小型哺乳动物中，能够随时间重复测量中性粒细胞的趋化性。

摘要

中性粒细胞在抵御感染中发挥着至关重要的作用，其血液中的数量在临床中经常被检测。血液中中性粒细胞计数升高通常提示存在活动性感染，而计数降低则是感染风险增加的警示信号。为了发挥功能，中性粒细胞还必须能够有效地从其主要停留的血液中迁移至发生感染的组织中。因此，即使血液中中性粒细胞数量正常，任何影响其迁移能力的缺陷都可能增加感染风险。然而，在临床中检测中性粒细胞迁移能力是一项具有挑战性的任务，耗时较长，需要大量血液样本，并依赖专业操作知识。为克服这些局限性，我们设计了一种可靠的微流控中性粒细胞迁移检测方法，仅需一滴未经处理的血液，无需分离中性粒细胞，且可在普通显微镜下轻松定量。在该检测中，中性粒细胞直接从血滴出发，经由微小通道向趋化因子源迁移。为防止红细胞以颗粒流形式通过相同通道，我们采用了带有直角弯道的机械过滤结构，选择性阻断红细胞的前进。我们通过比较指尖采血和静脉血样本中中性粒细胞的迁移情况对该检测方法进行了验证。同时，还将这些全血（WB）样本与纯化中性粒细胞样本的迁移行为进行比较，发现三者之间的迁移速度和方向性具有一致性。该微流控平台将有助于在临床和科研环境中研究人类中性粒细胞的迁移行为，从而推动我们对中性粒细胞在健康与疾病状态下功能的理解。

引言

中性粒细胞迁移在决定多种炎症性疾病（包括动脉粥样硬化¹、细菌感染或败血症²以及烧伤损伤³）的发展和消退过程中起着关键作用。由于中性粒细胞在健康与疾病状态中具有重要作用，其计数是临床和科研实验室常规血液分析中的常见项目。然而，尽管这是最常用的检测之一，中性粒细胞计数在感染和败血症诊断中的价值却经常受到质疑⁴。例如，一项针对烧伤患者中性粒细胞的研究表明，中性粒细胞计数与其迁移功能之间并无相关性，说明仅凭中性粒细胞计数并不能准确反映免疫状态³。尽管中性粒细胞功能能力的测定更为困难，但在多种疾病状态下，其功能评估被认为具有更高的临床价值。

重要的是，许多中性粒细胞功能缺陷是暂时性的，并非由永久性遗传缺陷引起，这一区别在临床上长期被忽视，直到最近才受到关注。在烧伤损伤的背景下，可在患者治疗过程中监测中性粒细胞的迁移，作为炎症状态或感染的指标³。目前实验室中使用的传统迁移检测方法（如Boyden小室、Dunn小室、微移液管检测）由于需要大量血液以及繁琐耗时的中性粒细胞分离技术，无法应用于临床环境（Table 1）。这些检测方法也无法用于监测小动物（如小鼠）中性粒细胞趋化性的短暂变化，因为分离中性粒细胞所需的血量通常仅允许采集单个样本，甚至常常需要将多只动物的血液合并才能进行一次检测。例如，一项涉及多个条件、多种处理及多个时间....

方案

1. 微流控器件的制备

1. 在1,000级洁净室中，采用标准的光刻技术制备主模具晶圆。根据制造商的说明，对第一层3 µm厚的环氧基负性光刻胶进行图形化，以定义迁移通道。对第二层50 µm厚的光刻胶进行图形化，以定义细胞加载腔和趋化因子腔。
2. 使用已图形化的晶圆浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件。将PDMS（20 g）与引发剂（2 g）在大型塑料称量盘中用塑料叉剧烈混合5分钟 。
3. 小心地将PDMS倒入模具中。
4. 将带有已浇注PDMS的模具置于真空干燥器中脱气1小时。
5. 将PDMS微流控器件置于65 °C的烘箱中加热固化至少3小时 。
6. 使用尖端直径为1.5 mm的打孔器冲出中央的白细胞（WBLCs）。
7. 使用尖端直径为5.0 mm的打孔器将整个环形器件冲出。
8. 使用粘性胶带去除环形器件上的颗粒物。
9. 用去离子水冲洗12孔板，然后用氮气吹干。将该板置于60 °C烘箱中加热5分钟。
10. 对12孔板进行两次氧气等离子体处理；第一次单独处理35秒 ，第二次与环形器件一起再处理35秒。
11. 使用镊子小心地将器件放置在板的各孔中。
12. 将带有键合器件的板置于设定为80 °C的加热板上，加热10分钟。

2. 微流控实验准备

....

结果

通过测量中性粒细胞向 fMLP 梯度迁移的积聚情况，验证了全血（WB）中性粒细胞趋化实验的有效性（补充视频 S1）。结果证实，红细胞被过滤梳结构截留，而中性粒细胞（蓝色）能够主动从全血中迁移出去（图 3A 和 补充视频 S1）。利用 FITC 标记的葡聚糖确认了全血微流控装置形成的稳定线性趋化因子梯度（绿色）（图 3A 插图），并随时间测量了荧光强度。这些装置中产生的梯度对于小分子可稳定维持达 24 小时，对于较大分子量物质则可维持长达一周。通过成像观察到荧光信号局限于 FCC 区域，而在 WBLC 或装置周围无信号，从而验证了洗涤程序的效率。随后，利用该装置评估了不同血液来源的中性粒细胞迁移能力差异。

使用新型全血趋化平台获得的结果显示，来自指尖采血的全血、静脉全血或从静脉血中分离出的中性粒细胞均表现出一致的迁移速度（20 ± 2 mm/min，蓝色线条），并且来自所有血液来源的总迁移细胞数量相似（38 ± 10 个细胞/小时，阴影柱状图）（

讨论

在这项研究中，我们开发了一种微流控平台，可用于从一滴血液（2 µl）中检测中性粒细胞的趋化迁移。芯片内通过机械过滤方式将红细胞与正在迁移的中性粒细胞分离，从而避免了使用密度梯度等繁琐的细胞分离方法。¹⁰阳性选择¹¹，或称阴性筛选¹²，这些方法容易因激活中性粒细胞而引入假象。红细胞的机械过滤使我们的技术区别于其他用于研究中性粒细胞迁移的微流控芯片。例如，我们实验室此前的工作¹³ 和 Beebe 等. ⁸ 利用芯片上的选择素从全血样本中分离中性粒细胞，用于后续趋化实验。在选择素表面完成分离后，中性粒细胞在缓冲液中进行迁移。在此条件下，消除了血清对中性粒细胞趋化作用的任何影响。此外，已知选择素可通过结合特异性受体激活细胞，从而可能改变 体外 趋化性测量。我们设备中的红细胞过滤梳通过机械方式分离，不会改变中性粒细胞的状态，从而确保设备测量结果的准确性。该设备可稳健地测量细胞速度、细胞累积数量以及细胞运动方向性。

本研究显示，来自健康志愿.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
器件制备
SU-8	Microchem	Y131273
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
标准载玻片	Fisher Scientific	125495	1 × 3 英寸
玻璃底培养板	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core，尖端直径 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core，尖端直径 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
微流控实验准备与分析
凝胶加样枪头	Fisher Scientific	02-707-139
注射器	Fisher Scientfic	309602
钝头针，30 G ½ 英寸	Brico Medical Supply	BN3005
真空采血管，肝素抗凝	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A5843-5G	在 HBSS 中终浓度为 0.2%
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance 安全采血针，2.2 mm 深度，22 G		SLN240
Hoechst 染色剂	Life Technologies	H3570
阳性对照
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep 人中性粒细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies Inc.	19257
等离子清洗仪	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M 恒温烘箱	Thermo Scientific	13-258-30C
不锈钢精密镊子	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware 耐化学腐蚀真空干燥器	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate 数字加热板	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE 倒置显微镜	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd 物镜	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 配 2 米光导，适用于 Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA 窄带 32 mm 激发滤光片 - 25 mm 发射滤光片	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 冷却 CCD 相机，1,600 × 1,200 像素	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C