测量人类口腔脂肪酸阈值、脂肪感知、对高脂食物的喜好程度及乳头密度

摘要

脂肪酸的口腔化学感受及其与饮食和高脂食物偏好的关联，可能有助于揭示与肥胖发生相关的机制，并阐明为何许多个体难以改变饮食习惯。

摘要

来自多家实验室的新兴证据表明，人类能够通过味觉细胞上的脂肪酸受体在口腔中识别脂肪酸。先前的研究显示，个体对脂肪酸（特别是油酸，C18:1）的口腔敏感性与体重指数（BMI）、膳食脂肪摄入量以及识别食物中脂肪的能力相关。我们已建立一种可靠且可重复的方法，用于评估个体对脂肪酸的口腔化学感知能力，该方法采用牛奶与C18:1乳剂，并结合递增式强制三刺激三角法进行测试。同时，我们还开发了一种食品基质，用于评估个体感知脂肪的能力，以及一种简便的方法来评估对高脂食物的喜好程度。作为补充测量手段，采用舌部摄影评估舌乳头密度，较高的密度通常与增强的味觉敏感性相关。

引言

过量摄入膳食脂肪可能是导致体重增加^1-3的原因之一，而肥胖已成为当今全球性的流行病。研究表明，较高的脂肪摄入水平，尤其是作为随意饮食（ad libitum）的一部分，可能与较高的体重指数（BMI）相关^2,3，但影响膳食脂肪摄入和偏好的因素仍远未明确。因此，探索脂肪摄入背后的机制成为一个显而易见的研究目标，其中特别值得关注的是口腔中负责脂肪感知的机制，通常称为“脂肪酸味”²。

从进化角度来看，味觉系统可能作为消化系统的守门人，引导机体摄取高能量营养物质，并排斥潜在的有毒化合物⁴。味觉由特化的味觉感受细胞所介导，这些细胞分布于舌部三种类型的舌乳头中：菌状乳头、叶状乳头和轮廓乳头，每种乳头可包含多达数百个味蕾⁵。除了被广泛认可的五种基本味觉（甜、咸、酸、苦和鲜）之外，近年来有研究提出口腔中可能存在感知脂肪的机制，更有可能是感知其分解产物——脂肪酸⁶。

既往研究一致表明，尽管脂肪酸在传统意义上并非一种“味觉”（因其缺乏与之明确关联的单一可识别感知特性，即 甜味）¹²，但仍可在口腔中检测到其在不同浓度范围内的存在^7-11。我们实验室的研究已揭示脂肪酸化学感受功能受损的潜在影响，特别是在体重和膳食脂肪摄入方面。脂肪酸检测能力较低（即敏感性低下）的个体似乎具有更高的体重指数（BMI）并摄入更多能量⁹；同时，口腔内脂肪酸敏感性与膳食脂肪摄入之间也存在关联：即脂肪酸敏感性较低的个体摄入更多的动物脂肪，包括肉类、高脂乳制品以及高脂涂抹食品 ，而这些成分已被认为是导致体重增加的因素之一¹³。此外，对脂肪酸更为敏感的个体似乎更能有效区分不同脂肪含量的样品⁹。尽管其他研究团队未能发现类似的关联^10,14,15，这一不断发展的研究领域仍具有重要吸引力。

脂肪酸化学感受的个体差异似乎在一定程度上受到包括饮食在内的环境因素调节。长期的脂肪摄入与口腔脂肪酸化学感受功能受损相关，进而导致对膳食脂肪的偏好增强以及摄入量增加¹⁶。除了味觉适应外，胃肠道（GI）似乎也对脂肪摄入的变化具有响应性¹⁷，而胃肠道脂肪酸敏感性的降低可能与无法产生适当的饱腹信号有关，从而无法有效抑制过量的能量摄入¹⁸。

除了环境因素外，脂肪酸化学感受还可能受个体间遗传或生理差异的影响，包括个体舌头上菌状乳头密度（以及可能存在的味觉受体）的浓度¹⁹。菌状舌乳头密度较高者，对多种经口腔感知的化合物具有更强的口腔敏感性，例如 6-n-丙基硫脲嘧啶（PROP）²⁰、糖²¹和盐²²，此外也有研究指出其与奶油感感知相关²³。PROP 超味者（推测其菌状乳头数量较多）能够区分高脂与低脂沙拉酱²⁴，并且比无味者更准确地辨别乳制品中的脂肪含量和奶油感^23,25。然而，目前菌状乳头密度与口腔脂肪酸“味觉”感知之间的关系尚不明确。

人类口腔脂肪酸化学感受研究的基础是应用多种感官技术。识别个体在口腔脂肪酸检测中的差异性是一个主要研究重点，这在很大程度上依赖于脂肪酸检测阈值的测定，即能够检测到溶液中脂肪酸的最低浓度⁹。尽管不同文献和研究团队所采用的具体测试方法和刺激载体各不相同，典型的实验流程通常包括向受试者提供一系列乳化脂肪酸溶液和对照溶液（不含脂肪酸），并要求其识别出其中“不同”的样品。本文介绍了一种已建立的、可靠且可重复的阈值测定方法¹⁰，该方法使用乳化牛奶溶液，并结合升序强制三选一测试程序。

口腔对脂肪酸的敏感性在多大程度上影响饮食行为，特别是高脂食物的摄入，以及个体感知食物中脂肪的能力，同样受到关注。本文还报告了另外两种已建立的技术，以进一步加深我们对脂肪酸化学感受的理解。可通过向个体提供市售食品样品（包括常规脂肪含量和低脂版本），要求其评估对每种样品的喜好程度，从而确定其对高脂食物的偏好¹⁶。在脂肪感知方面，本实验室开发了一种脂肪排序任务，旨在评估个体在蛋奶沙司这一典型食物基质中检测脂肪的能力¹⁶。为了评估个体之间的遗传或生理差异，一种常用的方法是舌部摄影技术，即对菌状乳头进行染色、拍照并定量分析²⁶。尽管该技术在脂肪酸研究中的应用尚处于初期阶段，但其应用范围正逐步扩大，特别是在瘦型与超重/肥胖人群中的研究，可能有助于揭示过量脂肪摄入的内在成因。

方案

以下技术已获得迪肯大学人类研究伦理委员会批准使用。

1. 人口统计学与人体测量学

1. 记录参与者的 demographics 信息，包括出生日期和性别。
2. 在基线时（若为纵向研究设计，则在其他研究时间点也进行）测量身高和体重。确保参与者已脱掉鞋子、厚重的夹克或其他衣物，并从口袋中取出任何较重的物品。
   1. 使用身高计测量参与者的身高，记录到最接近的 cm。
   2. 使用专用秤测量参与者的体重，记录到最接近的 g。
   3. 使用以下公式计算 BMI：体重 (kg)/身高² (m²)。根据标准 BMI 定义值对参与者进行分类：正常体重为 18.5–25 kg/m²，超重为 25–30 kg/m²，肥胖为 >30 kg/m²²⁷。

2. 口腔脂肪酸阈值评估样品的制备

1. 使用脱脂超高温灭菌乳（UHT乳）作为脂肪酸味觉阈值评估的基质。产品可按需批量购买和储存，未开封条件下可保存长达6个月或至产品保质期为止。配制两种载体溶液：添加脂肪酸的实验载体和对照载体。配制溶液的体积取决于受试者人数。以下方案提供了适用于2名受试者的典型用量。
2. 通过将5% w:v食品级阿拉伯胶（gum arabic）加入水中，制备基础牛奶溶液，用于对照组和脂肪酸溶媒组。例如，将每2升牛奶加入100克胶体，置于3 L玻璃烧杯中。如需要，使用前对胶体进行水合处理（具体步骤取决于胶体生产商）。
3. 向树胶中加入0.01% w:v EDTA以防止氧化（例如，每2升牛奶含200毫克。
4. 每位参与者分配约1 L脱脂牛奶（例如，2 名参与者使用 2 L 牛奶）倒入烧杯中。
5. 使用带有乳化筛网的实验室级混合器，在12,000 rpm条件下将溶液均质化2分钟。将溶液静置备用。
6. 使用食品级C18:1制备脂肪酸溶液。如有必要，可通过气相色谱法评估氧化程度。
7. 制备一系列13种不同浓度的脂肪酸载体（超高温灭菌脱脂牛奶），其中油酸（C18:1）浓度依次递增（0.02、0.06、1、1.4、2、2.8、3.8、5、6.4、8、9.8、12 和 20 mM/L）。为此，将每个浓度分别标记于250 ml玻璃烧杯上。
8. 向每个烧杯中加入5%的液体石蜡（例如，每100 ml牛奶溶液加5 ml石蜡。
9. 根据C18:1浓度，向每个烧杯中加入适量的C18:1（参见 表1).

C18:1 浓度 (mM)	μl/100 ml
0.02	0.56
0.06	1.9
1	31.5
1.4	44.1
2	63.1
2.8	88.4
3.8	119.9
5	157.8
6.4	202
8	250
9.8	309
12	380
20	631.2

表1. 每100 ml溶液中C18:1的示例浓度。 使用逐渐增加的C18:1浓度（µl/L）配制用于口服脂肪酸阈值检测的13种乳剂系列。

10. 使用后，用 N₂ 填充 C18:1 容器以尽量减少氧化，并在 4 °C 以下保存。
11. 向每种脂肪酸烧杯中加入基础乳液，使总体积达到 100 ml。静置备用。
12. 使用剩余的基础溶液，制备对照载体。在 2 L 玻璃烧杯中，加入剩余体积的 5% 液体石蜡（例如，在最终体积为 750 ml 时加入 35 ml 液体石蜡），再加入剩余的基础溶液，并以每 100 ml 液体均质 30 秒。
13. 对照载体均质时间为每 100 ml 液体 30 秒。此步骤应在脂肪酸溶液之前进行，以防止 C18:1 污染。
14. 对每种脂肪酸载体进行均质，从最低浓度开始，每 100 ml 均质 30 秒。
15. 在测试前后均应对均质机进行消毒。
16. 由于均质过程可能导致溶液温度升高，需用温度计检测对照组和 C18:1 样品的温度。所有样品应在室温（20 °C）下使用。
17. 乳液样品必须在测试当天新鲜配制。测试前应品尝每种溶液，以评估其新鲜度和适用性。
    注意：根据所需体积，溶液制备至少需要 60 分钟。

3. 口腔脂肪酸阈值检测

1. 确保受试者在测试前至少1小时内未进食或饮用任何液体（包括咖啡、口香糖、漱口水等）。
2. 通过在红光照明下进行测试，并让受试者佩戴鼻夹，以减少非味觉线索的干扰。
3. 采用升序强制选择三角法测定口腔脂肪酸阈值。用三位数编号标记30 ml塑料分装杯。为每位受试者随机提供一组三份20 ml溶液，其中两份为对照溶剂，一份为含最低浓度C18:1（0.02 mM）的脂肪酸溶剂。
4. 为测定参与者的口腔脂肪酸阈值，指导参与者从左至右依次品尝每种溶液，并将溶液吐入水槽。要求参与者不得吞咽样品。
5. 要求受试者指出3个样品中哪一个为“不同”或“异常”的样品；若其无法确定，则必须进行猜测（强制选择）。
6. 每次品尝样品后，让参与者用去离子水漱口。
7. 若正确识别，则向参与者提供第二组3种溶液（2种对照溶液和1种脂肪酸溶液，随机顺序），脂肪酸浓度与之前相同；若识别错误，则向参与者提供第二组3种溶液，但其中油酸（C18:1）浓度为下一个较高浓度（0.06 mM）。
8. 继续该步骤，直至受试者在同一浓度下连续3次正确识别出“不同”样本。将受试者能够正确识别“不同”样本的浓度记录为其C18:1检测阈值。参见 图1 用于此过程的图示说明。
9. 根据检测阈值，将参与者表征为对C18:1过敏感或低敏感。依据既往文献，过敏感个体可在较低浓度下检测到C18:1 <3.8 mM，而低敏感性个体则需要更高浓度 >3.8 mM
   注意：根据错误答案的数量，测试程序可能需要10至30分钟完成。

图 1. 用于测定脂肪酸检测阈值的递增式强制三杯法实验流程。 受试者被提供三种溶液（两种对照溶液和一种特定浓度的 C18:1 溶液），并要求识别出“不同的样品”。若回答正确，则继续提供另一组相同 C18:1 浓度的样品；若回答错误，则提供 C18:1 浓度更高的另一组样品。该过程持续进行，直至在某一特定浓度下连续正确识别出三个“不同”样品。此浓度即被确定为该个体的“脂肪酸检测阈值”。

4. 脂肪排序任务

该任务要求参与者品尝四种不同脂肪含量（0、2、6 和 10%）的即食蛋奶糊样品，并按照感知到的脂肪浓度由低到高进行排序。

1. 根据包装说明，使用无脂即溶香草蛋奶酱粉制备1份蛋奶酱。将2汤匙蛋奶酱粉、1汤匙糖和2杯无脂牛奶混合于一个可微波加热的碗中。如果推荐产品不可获得，可用类似的无脂即溶产品替代（例如，需煮制的蛋奶酱）。
2. 使用1400 W微波炉，以高功率每30秒为一个加热区间，总共加热约5分钟，或直至变稠。具体时间可能因蛋奶酱品牌和微波炉功率而异。让蛋奶酱冷却。
3. 用脂肪百分比标记四个500 ml的厨房用碗（或类似容器）。
4. 将蛋奶酱分成4份独立的100 g样品。
5. 向每个碗中分别加入0、2%、6%和10%的植物油，以达到目标脂肪含量（例如，在100 g样品中分别加入0 ml、2 ml、6 ml和10 ml植物油），然后混合。充分搅拌每个样品，确保所有成分完全融合。
6. 用随机生成的三位数标记四个30 ml塑料分装杯。每个杯子中装入20 g不同类型的蛋奶酱（每杯一种蛋奶酱）。
7. 测试前将样品冷藏，并以低温（4 °C）提供。
8. 在红光环境下进行测试，以尽量减少视觉提示。
9. 要求受试者品尝、吞咽，并根据感知到的脂肪含量从低到高对4种蛋奶酱进行排序，根据其回答给予满分5分的评分。
10. 本任务的评分标准见表2。
    注意：蛋奶酱样品的制备时间约为30分钟。脂肪排序任务完成时间不应超过10分钟。

排序顺序	分数
0, 2, 6, 10	5
2, 0, 6, 10	4
0, 2, 10, 6	3
0, 6, 2, 10	2
1, 6, 10, 2	1
6, 0, 2, 10	1
2, 10, 6, 0	1
2, 6, 0, 10	0
6, 2, 10, 0	0
0, 10, 2, 6	0

表2. 脂肪含量排序任务评分。 受试者将获得4份添加了0%、2%、6%或10%脂肪的蛋奶酱样品。要求受试者按脂肪含量从低到高对样品进行排序，评分范围为0至5分（5分为最高分）。

5. 脂肪类食物喜好

1. 准备市售食品的常规脂肪含量和低脂版本的小份样品（5–20 g）。食品包括：奶油奶酪（搭配饼干食用）、巧克力慕斯、奶酪、干饼干、花生酱蘸料（搭配胡萝卜片食用）、蛋黄酱、沙拉酱（搭配黄瓜片食用）和酸奶的常规与低脂版本。
2. 为每个样品标注随机的三位数字编号以供识别。
3. 以随机顺序呈送样品，以避免顺序效应。
4. 指导参与者逐一品尝每个样品。食品需吞咽摄入，但参与者可自行决定每个样品的食用量，可多可少。
5. 让参与者评价其对每个样品的喜好程度。使用一条100 mm的享乐性广义量值标度（gLMS；见图2）测量喜好程度，标度范围从“想象中最强烈的不喜欢”到“想象中最强烈的喜欢”。通过在代表参与者对该食物喜好或厌恶程度的位置上画一条垂直线来记录评分。

图 2. 愉悦性广义线性评分量表（hedonic gLMS）。 该愉悦性 gLMS^30,31 用于评估市售常规脂肪含量和低脂食品的喜好程度。参与者品尝每个样品，并在最能代表其对该样品喜好或不喜好程度的位置上画一条垂直线。

6. 本任务未最小化非味觉输入，因此应在正常光照条件下进行，且不要求参与者佩戴鼻夹。

6. 舌象摄影

1. 架设相机和三脚架用于拍摄。普通的室内照明即可满足要求。
2. 将相机设置为微距模式（或类似模式），以便进行近距离拍摄。
3. 使用打孔器在一块1.5 cm × 1.5 cm（或类似尺寸）的滤纸上打出一个直径为6 mm的圆孔，并用参与者的编号标记该滤纸。
4. 在50 ml烧杯中，按1:20的比例将蓝色食用色素与去离子水混合。每位参与者仅需少量溶液。
5. 将30 ml食品级乙醇倒入50 ml烧杯中，用于镊子的消毒。
6. 使用美纹纸胶带在测试台侧面标记一个20 cm × 30 cm的矩形区域（测试台应为普通书桌高度），如图3a所示。

图3. A) 舌象摄影设置。舌象摄影前所需的桌面布置示意图。B) 舌象摄影。舌象摄影方法的演示

7. 让受试者将肘部放在矩形标记的角上，下巴置于手掌中，并舒适地伸出舌头，用嘴唇稳定舌头位置（图3b）。受试者在整个测试过程中必须保持此姿势。
8. 使用一块矩形（1.5 cm × 3 cm）的滤纸，短暂吸干舌头底部。
9. 将棉签浸入食用色素/水溶液中，然后将少量染料转移至舌头背面前部中线右侧、靠近舌尖处（见图4）。再次用滤纸吸干舌头表面。
10. 用纸巾擦干经乙醇消毒的镊子，使用镊子将预先标记的1.5 cm²滤纸放置于受试者舌面上，使6 mm的孔对准蓝色食用色素区域（见图4）。
11. 使用闪光灯拍摄受试者舌头的三张数码照片。为保护隐私，确保照片中仅显示受试者的口部和舌头。
12. 用再次经食品级乙醇消毒的镊子从受试者舌面取下1.5 cm²滤纸。将照片上传至图像编辑软件，使用放大功能计数所有可见的菌状乳头。
13. 菌状乳头与其他乳头的区别在于其为较大的蘑菇状隆起结构，不易被染色溶液着色，因此颜色明显较浅。
    注意：舌部摄影操作应不超过10分钟完成。

图 4. 菌状乳头密度的定量分析。用于评估菌状乳头的6-mm区域位置。通过图像编辑软件，数字标记出每一个菌状乳头。

结果

上述方法至关重要，因为一些新兴证据表明，口腔和胃肠道中脂肪酸化学感受功能的受损可能与体重指数（BMI）升高及肥胖症的发生发展相关。¹⁷已有多个研究采用所述方案来探究口腔脂肪酸的检测，我们近期的发表论文表明，该方法具有良好的可靠性和可重复性¹⁰采用该方法的研究已能够通过确定参与者能够察觉牛奶样品间差异的临界点，可靠地测定个体的口腔脂肪酸检测阈值⁹经过三次使用该方案的测试后，Stewart 等⁹ 发现C18:1的平均检测阈值为2.2 ± 0.1，检测阈值范围为1–6.4 mM（见 图5）。最近，我们确定了C18:1的检测阈值范围为0.26–12 mM（平均值：2.64 ± 0.7 mM）¹⁰这些结果支持脂肪酸可在口腔中被检测到的观点，并表明个体对C18:1的敏感性存在显著差异。基于这些结果，我们能够将个体分类为对C18:1的高敏感者或低敏感者。高敏感个体能够正确识别C18:1 <3.8 mM，而低敏感性受试者则需要更高浓度 >3.8 mM。我们实验室的研究发现，对C18:1的口腔敏感性与膳食脂肪摄入量及BMI相关（图6，其中对C18:1不敏感的个体摄入更多的饱和脂肪和动物脂肪，且具有更高的BMI¹³有趣的是，在Stewart和Keast进行的一项研究中¹⁶，结果发现，对于体重正常和超重的参与者而言，摄入低脂饮食均会增加对C18:1的敏感性（图7）。然而，该研究还发现，当受试者摄入高脂饮食时，瘦型个体对C18:1的味觉敏感性降低，而超重个体的味觉敏感性则未发生改变（图8这表明，习惯性摄入高脂饮食（超重个体更有可能如此）可能导致脂肪酸化学感受功能减弱²⁸然而，由于瘦型与超重参与者在基线敏感性方面并无差异，这些结果可能表明，瘦型个体在脂肪摄入的膳食变化方面可能仅是更为敏感。这也提示，可能是特定干预措施（高脂与低脂）的存在影响了结果，而非日常饮食习惯，因为日常饮食可能与干预饮食不同，也可能相同。尽管如此，本研究提示，瘦型与超重个体在脂肪酸味觉敏感性方面存在某些根本性差异，这有待进一步研究。

图5. C18:1味觉检测阈值。 研究显示，不同受试者对C18:1的敏感性存在显著差异，其可检测到C18:1的浓度范围为1 mM至6.4 mM。

图6. C18:1味觉检测阈值及其与BMI的关联。 已发现C18:1的检测能力与身体成分之间存在关联，即检测阈值较高（味觉敏感性较低的个体）的人群其BMI值显著更高（P = 0.002，r² = 0.467）。

图7. 低脂饮食后C18:1的检测阈值变化。 在持续4周摄入低脂饮食后，瘦型个体与肥胖个体的C18:1检测阈值均有所升高。

图8. 高脂饮食后C18:1的检测阈值变化。 经过4周高脂饮食摄入后，偏瘦个体对C18:1的敏感性降低（P = 0.006），而超重个体则未见明显变化（P = 0.609）。

与饮食对脂肪酸检测阈值的影响类似，有研究表明食物喜好可能具有可塑性，并会因暴露而发生改变。例如，高脂饮食似乎会增加个体对高脂食品的偏好，而摄入低脂饮食则会产生相反的效果¹⁶。然而，这些变化在现有文献中并不一致。研究表明，偏好的改变受到个体坚持高脂或低脂饮食时间长短的调节。具体而言，Mattes²⁹发现，在减少脂肪摄入的饮食持续12周后，参与者的食物偏好出现了显著变化；而Stewart和Keast¹⁶在类似饮食持续4周后仅观察到零星且微弱的变化。摄入高脂饮食改变了参与者对酸奶的偏好，表现为对低脂酸奶的偏好增加，与预期结果相反（基线（BL）：19.44 ± 5.73，第4周（WK4）：21.94 ± 5.21，P = 0.046）。此外，在低脂饮食持续4周后，所有参与者对低脂黄油的偏好均有所上升（BL：6.23 ± 4.26，WK4：7.32 ± 3.04，P = 0.046）。仅在瘦型参与者中观察到对低脂酸奶的偏好增加（BL：2.51 ± 3.26，WK4：3.68 ± 4.94，P = 0.07），而所有参与者对低脂慕斯的偏好均下降（P = 0.01）。

通过让参与者品尝并排序一系列脂肪含量不同的蛋奶冻，来评估其检测食物中脂肪的能力。根据参与者对样品排序的准确性来确定其对脂肪的感知能力。已知脂肪感知能力会随饮食而变化，例如，采用低脂饮食后，参与者在正确识别和排序每份蛋奶冻样品脂肪含量方面的表现有所提升¹¹。此外，似乎对C18:1的敏感性与脂肪含量的识别和排序之间存在关联⁴。事实上，对C18:1高度敏感的个体在脂肪排序任务中的表现显著优于敏感性较低的个体（4.3 ± 0.6 vs 2.3 ± 0.1，P = 0.02）（评分满分为5分）⁹。这表明对脂肪酸更敏感的个体在区分四种不同脂肪浓度的蛋奶冻方面也更具优势。尽管在摄入低脂饮食四周后，任务表现呈现出改善趋势，但该变化未达到统计学显著性（基线：1.3 ± 0.3，第4周：2 ± 0.3，P = 0.077）¹⁶。

乳头密度 即 舌头上乳头（从而味蕾）的数量因人而异，可反映味觉功能。较高的菌状乳头密度与对蔗糖等化合物的味觉敏感性增强相关。²¹ 和苦味物质PROP²⁰通过舌部摄影测定的舌乳头密度在不同受试者之间存在显著差异。例如，Zhang 等²¹ 发现参与者之间存在显著的个体差异，浓度范围为 7.07 ± 0.35/cm² 至 233.43 ± 0.00/cm² （数据来自单个参与者），而其他研究²⁶ 发现菌状乳头的平均浓度为156.00 ± 5.86个/cm²²此外，研究发现，不同个体间的乳头状结构在形态上可能存在显著差异，表现为高度、宽度和形状的变化。²¹ 尽管目前关于这些差异可能带来的影响证据有限。鉴于先前研究已发现乳头数量与味觉敏感性相关，类似的关系也可能存在于口腔脂肪酸敏感性中，即对脂肪酸口腔敏感性较高的人可能具有更高密度的味蕾，因而拥有更多的口腔脂肪酸受体。虽然这一关联尚未得到证实，但它提出了一个新颖的研究方向，可能有助于揭示导致脂肪过度摄入的潜在机制。

讨论

近年来，用于测定口腔脂肪酸阈值、脂肪类食物喜好度及舌乳头密度的技术已在多项已发表的研究中得到验证和应用。我们建议在研究中的每个相关时间点，均以双份样本进行口腔脂肪酸阈值评估、脂肪排序任务以及脂肪类食物喜好度测试。关于检测阈值的最佳评估方法，目前仍存在一些讨论³²。特别是，不同实验室所使用的溶液成分各不相同，评估方法本身也存在差异。本方案中采用的脂肪酸C18:1，我们认为相较于其他曾被使用的脂肪酸（如亚油酸（C18:2）和月桂酸（C12:0））⁹，具有代表性且易于操作。C18:1在食物供应中普遍存在，与C12:0不同，其在室温下呈液态，且比C18:2更耐氧化⁹。此外，C18:1在多次测试中已被证明可提供可靠的数据，并且与C18:2和C12:0具有高度相关性¹⁰。同时，C18:1在相关文献中已有广泛研究，因此更有利于开展结果比较。

本文所述方案与其他实验室所用方法之间的一个主要差异在于呈递脂肪酸刺激物所使用的载体，以及确定检测阈值的系统性方法。文献中常用的两种主要脂肪酸载体为脱脂牛奶^10,17 和水乳液⁶. 尽管两种方法均已证明可用于脂肪酸阈值的测定，但受试者在牛奶中可能更容易识别脂肪的味道，因为在水中品尝脂肪酸的情况较为罕见，这可能导致使用水作为基质的研究其外部效度降低。脱脂牛奶可作为脂肪酸化学感受的载体，且不会影响实验效度。尽管目前文献中尚未对这两种方法进行直接比较，但已知脂肪酸在水中的溶解度较差³³由于脂肪酸在基于牛奶的溶液中具有溶解性，这种乳剂可能比水基溶液保存时间更长且更为均匀，尽管这一点尚未得到证实。在应用该方法时，需要注意牛奶中可能天然存在游离脂肪酸。³⁴ 因此，产品应在有效期内充分使用，以防止游离脂肪酸含量升高（随时间推移而增加）进而可能干扰味觉阈值测试结果。溶液的成功制备依赖于多个因素。首先，添加各组分的顺序至关重要。载体的制备步骤应严格遵循前述说明，以确保载体成分正确并形成稳定的乳剂。其次，必须严格控制温度。每个样品必须在室温（RT）下提供给受试者，以确保受试者不会因非“味觉”因素而识别出“异常样品”。最后，所有样品必须在建议的时间内进行充分均质化。尽管脂肪酸与脱脂牛奶形成的乳剂比使用水更为有效，但仍存在样品内乳剂分层的可能性。

在确定口腔脂肪酸阈值时，所采用的具体检测方法也必须加以考虑。文献中通常描述了两种基于感官的检测方法：一种是升序强制选择三角检验法，另一种是阶梯法³⁵。升序强制选择三角检验法是一种已确立的味觉阈值测定方法，因其多种优势而被认为具有实用价值，其中包括：与阶梯法不同，升序法从最低浓度的C18:1（0.02 mM）开始，逐步提高浓度，直至受试者能够察觉溶液中脂肪酸的存在⁹。相反，阶梯法则是从一个预设的中间浓度开始，根据受试者的反应上下调整脂肪酸浓度¹¹。然而，若阈值测定的起始点高于实际阈值，可能导致感官反应脱敏，从而影响味觉能力。此外，与阶梯法（11.1%）相比，升序法受随机猜测影响的概率更低（3.7%）¹¹。因此，我们建议采用升序强制选择三角检验法，并以脱脂牛奶作为味觉测试的载体，这似乎是准确测定口腔阈值的有效方法。

食品接受度或喜好度测试是感官研究中较为直接的评估方法之一，因此通常出现的问题较少。然而，所使用的喜好度量表类型是一个重要的关注点。在此情况下，享乐性广义LMS（gLMS）最为有效，因其具有良好的区分能力，且易于参与者使用³⁶。享乐性gLMS的两端分别标注为“可想象的最强烈不喜欢”和“可想象的最强烈喜欢”，参与者需根据所有享乐体验（而不仅限于食物）来评估喜好程度^30,31。这种方法有助于控制标准9点量表所产生的天花板效应，因为所有体验均被纳入考虑并进行比较。此外，由于量表范围更广，享乐性gLMS更能体现个体间的差异性³⁶。食品接受度测试本身可能受限于所呈现的食品种类，本研究中每种食品类型仅提供两种选择。未来的研究可纳入更多品牌或类型的食品，每种食品具有不同的脂肪含量，或使用特制产品，使脂肪含量成为唯一可控变量。需要注意的是，所有数据的解释都应谨慎进行。尽管喜好、偏好与摄入量之间可能存在关联，且这一假设具有吸引力，但研究结果是在实验室环境中获得的，其在现实情境中的适用性可能存在一定局限。

通过舌部摄影评估乳头密度是一个更为复杂的过程，必须遵循特定的步骤才能获得适当且可用的结果。尤其重要的是要准确识别乳头的类型。人类舌头上可见三种味觉乳头：菌状乳头、叶状乳头和轮廓乳头⁴。其中，菌状乳头因其呈蘑菇状结构而易于辨认²⁶，通常也是在敏感性评估过程中记录的对象。菌状乳头的密度通常在每6 mm²面积内5至60个之间³⁷（取决于个体敏感性），但也有研究指出，某些个体在同一区域内的乳头数量可能超过230个²¹。所使用的相机类型对于获得准确结果至关重要，可能是造成这种差异的原因之一。在此领域使用数码摄影之前，视频显微镜检查一直是识别和记录乳头密度的金标准。然而，已有研究表明，使用合适的数码相机也可达到同等的识别水平²⁶。此外，数码摄影仅需几分钟即可完成，而视频显微镜检查可能需要长达一小时²⁶。不仅如此，数码摄影还可能显著降低成本并提高便携性，这对于在不同受试人群中的应用尤为有利²⁶。最后，尽管我们的目标是测量菌状乳头密度以探究其与口腔脂肪酸感知能力的关联，但我们同时建议并行开展五种基本味觉的味觉阈值测试。鉴于先前已有乳头密度与味觉功能之间关联的研究报道，这一额外测试可作为补充的“验证手段”，有助于增强数据的可靠性，尤其是在这一尚属新兴的研究领域中。

口腔化学感受研究领域，特别是关于脂肪酸的研究，正处于新兴发展阶段，因此所有研究都必须以高标准进行，最好采用一致的实验方案，以便进行直接比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
预水合FT粉末阿拉伯胶TIC	Alchemy Agencies Ltd. NZ	CFR# 21 CFR 184.1330	食品级agrigum
EDTA（乙二胺四乙酸）	Merck	1.08418 0250	二钠盐二水合物
L4RT均质机	Silverson Longmedow, MA	L4RT
液体石蜡	Fauldings		无目录编号，因液体石蜡为常规消耗品
尼康AF-S VR微距尼克尔105毫米f/2.8G IF-ED相机镜头	尼康	2160
SLIK Sprint Pro II三脚架	Slik Corporation	611-849
带LCD保护器的尼康D90数码相机	尼康	BM-10
氮气
Tanita Body Scan体成分监测秤	Tanita, Cloverdale, WA, 澳大利亚	BC-551
Seca身高测量仪	Medshop Australia, Fairfield, VIC, 澳大利亚	MED435