利用可连接荧光探针评估实验性脑卒中中的细胞死亡吞噬清除作用

摘要

我们介绍一种用于选择性的新型荧光技术 原位 标记卒中后清除细胞碎片的活化吞噬细胞。该方法对于评估脑组织对缺血的反应至关重要，因为在缺血脑组织中存在的吞噬细胞中，仅有一小部分实际参与了细胞死亡物质的清除。

摘要

我们介绍一种新的组织化学方法，用于可视化局灶性脑缺血中的吞噬清除过程。该方法可用于研究任何细胞谱系的废物管理型吞噬细胞在中风过程中对死亡细胞的清除。尽管缺血脑组织中存在大量不同来源且具有吞噬能力的细胞，但其中仅有一部分会主动吞噬并消化细胞残骸。选择性地可视化、定量和分析此类活跃的吞噬性废物管理过程，有助于评估脑组织对缺血的反应。有效的细胞死亡清除对于脑组织从缺血损伤中恢复至关重要，因为它为后续的再生过程创造了条件。若未能及时清除细胞残骸，则会导致未降解的DNA和蛋白质引发毒性反应。本方法利用荧光探针，通过病毒拓扑异构酶特异性连接所有吞噬细胞在吞噬和消化因缺血而不可逆损伤的细胞时所产生的特征性DNA断裂。该技术是研究脑组织对缺血性损伤反应的新工具。

引言

缺血性脑卒中会引起受累脑组织发生显著变化。它会引发大规模的细胞死亡，从而迅速激活小胶质细胞来源的常驻吞噬细胞。同时，它还会导致多种血液来源的专业吞噬细胞浸润缺血脑组织，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞^1,2。

目前仍存在争议的是，这种对缺血性损伤的反应究竟起积极作用还是消极作用。尽管中风后的吞噬作用有益于清除死亡细胞并抑制炎症反应，但它同时会产生有毒的活性氧物质，影响神经元的存活并加剧组织损伤^1-5。

尽管多种类型的吞噬细胞会浸润缺血性脑组织，但并非所有这些细胞都通过吞噬细胞碎片并清除障碍来参与废物管理，从而为再生过程创造条件^1-3。因此，有必要对那些在脑卒中过程中执行吞噬清除功能的废物管理细胞进行特异性鉴定。在对这类活跃的废物管理细胞进行成像时，还需回答一个关键问题：它们降解所吞噬细胞碎片的效率如何。在吞噬作用中有效且彻底地降解死亡细胞的DNA至关重要，因为这可以防止自身免疫反应以及致病性核物质的释放⁶。

本文介绍了一种新型探针，该探针利用特定的DNA断裂作为活性吞噬细胞的标志物。这些特征性断裂仅在功能性的废物管理细胞内降解被吞噬的细胞核过程中产生。因此，该探针能够特异性地标记那些吞噬并 actively 消化细胞残骸的吞噬细胞。同时，该探针还允许观察吞噬后DNA降解的强度与完成程度。这些探针有助于评估吞噬清除过程的强度与效率。
新型探针依赖于非蛋白质标记物，因此在脑卒中研究中具有特别优势，因为在大面积缺血性损伤的情况下，细胞形态可能被破坏，或蛋白质标记物可能被耗尽，尤其是在缺血核心区。

该技术的原理如下所示 图1图中显示了由痘苗病毒拓扑异构酶（VACC TOPO）连接的发夹形寡核苷酸探针。 至溶酶体DNase II在DNA消化过程中产生的5'OH DNA末端⁷.

方案

该方法适用于甲醛固定、石蜡包埋的组织切片。本技术在此以大鼠实验性脑卒中为例进行演示。

1. 准备酪酰胺信号放大（TSA）系统的组分

尽管基于TSA的增强反应是在标记的最后阶段使用，但准备该反应可能需要超过1 小时。因此，在开始标记前预先配制TSA试剂较为方便。

1. 制备荧光素酪胺储备液。使用TSA标记试剂盒中提供的单支装荧光素酪胺试剂，向酪胺试剂小瓶中加入300 µl DMSO。荧光素酪胺储备液在4 °C保存时至少可稳定存放3个月。
2. 配制TNT洗涤缓冲液，成分如下：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5；0.15 M NaCl；0.05% Tween-20。如需要，可用0.3% Triton X-100替代0.05% Tween-20。也可使用PBS作为洗涤缓冲液。
3. 配制TNB封闭缓冲液，成分如下：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5；0.15 M NaCl；0.5% 封闭试剂（试剂盒提供）。为完全溶解封闭试剂，需在搅拌条件下分次少量缓慢加入缓冲液中。持续搅拌并逐步加热溶液至55 °C，此过程可能需要30–60分钟，溶液将呈现乳白色。使用前冷却至室温。分装后可于-20 °C长期保存。

2. 切片的制备

使用从福尔马林固定的组织切取的5 μm厚切片的载玻片。

1. 用二甲苯处理切片15分钟。
2. 按如下步骤复水切片：在96% EtOH中浸泡2次 每次5分钟；在80% EtOH中浸泡5分钟；用水洗涤2次 每次5分钟。
3. 将蛋白酶K贮存液用PBS稀释至50 µg/ml，配制蛋白酶K工作液。
4. 加入蛋白酶K工作液至切片上，23 °C孵育15分钟。根据切片大小和组织类型，可能需要调整溶液用量和消化时间。对于较小的切片（直径小于5 mm），使用50 µl蛋白酶K溶液即可；对于中等大小的切片（直径约10 mm），加入100 µl蛋白酶K溶液；对于非常大的切片，可按比例增加溶液用量。在所有情况下，应注意避免切片过度消化，以免导致信号完全丢失并破坏组织形态，当孵育时间超过25分钟时，常会发生此类情况。
5. 用蒸馏水冲洗切片2次 每次5分钟。当切片置于水中时，配制含有活性探针的标记混合液。

3. 基于VACC TOPO的染色

1. 通过混合以下成分来制备活性探针溶液：
   水 - 11.75 µl
   1 M Tris-HCl，pH 7.4 1.25 µl
   100 pmol 12碱基突出自杀寡核苷酸 1 µl
   100 pmol 接头寡核苷酸 1 µl
   50 pmol VACC TOPO - 10 µl
2. 用移液器轻轻混匀。室温（23 °C）孵育15分钟，以激活探针。
3. 从清洗罐中取出切片，吸去残留水分。然后加入第3.1步配制的活性探针溶液（每片约10 × 10 mm加25 µl）。
4. 盖上盖玻片，于23 °C孵育15分钟。将载玻片浸入水中，轻轻取下盖玻片。用水洗涤3次。 每次5分钟。

4. TSA 信号增强

1. 用先前配制的 TNB 封闭缓冲液覆盖组织切片，将切片置于湿盒中，在室温（23 °C）下孵育 30 分钟。
2. 用 TNB 封闭缓冲液将链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（SA-HRP）按 1:100 稀释。吸除 TNB 封闭缓冲液，加入 SA-HRP 溶液。在室温下孵育切片 30 分钟。使用足够的试剂体积以完全覆盖组织切片，通常每张切片使用 100 µl。
3. 在室温下，用 TNT 洗涤缓冲液（或 PBS）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次 。
4. 用试剂盒中的 1× 扩增稀释液将荧光素酪胺储备液按 1:50 稀释。将荧光素酪胺工作液滴加至每张切片上。使用足够量的工作液以完全覆盖组织切片，通常每张切片使用 100 µl。每次标记前应立即配制荧光素酪胺工作液。该溶液不可重复使用，标记完成后应丢弃任何剩余部分。
5. 在室温下孵育切片 3 至 10 分钟。在显微镜下监测荧光信号增强情况，直至首次观察到结构轮廓为止。随后迅速进入洗涤步骤。
6. 在室温下，用 TNT 洗涤缓冲液（或 PBS）振荡洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次 。
7. 加入含 DAPI 的抗荧光淬灭剂并加盖盖玻片。在荧光显微镜下观察。为同时观察 DAPI 和 FITC 荧光信号，请使用带通滤光片组：
   FITC 激发 D490/40，发射 520/10；DAPI 激发 D360/40，发射 460/20，或类似参数。

结果

标记活性废物管理吞噬细胞技术的原理如图1所示。示意图表明，检测过程分为三个步骤。第一步为探针激活（图1A）；第二步是将激活后的探针连接至组织切片中的特异性DNA断裂位点（图1C）；第三步包括荧光信号的扩增（图1D）。更详细的解释如下：

1. 探针活化。在连接反应之前，VACC TOPO 需要共价连接至寡核苷酸探针的 3' 端。在探针活化过程中，VACC TOPO 会结合到发夹-接头双链上并切割上链。随后，12 个碱基长度的片段永久分离，使 VACC TOPO 连接在发夹结构的 3' 端。这种在其 3' 端连接有酶的寡核苷酸可用于标记 DNase II 型断裂（图 1B）。需要 12 个碱基的突出端和一个接头寡核苷酸，因为该酶无法切割更短的链⁸，因此无法连接到探针上并活化其 3' 端。

2. 探针连接<...

讨论

在本视频中，我们以组织切片的形式演示如何标记在局灶性脑缺血中清除细胞死亡的活性吞噬细胞。该技术是首个仅特异性标记已吞噬并正在积极消化细胞残骸的废物清除细胞的方法。相较于其他现有的吞噬细胞标记方法，该技术具备这一独特能力，因而具有显著优势。

该方法利用一种基于DNA的通用且特异性的吞噬活性标记物——在废物处理细胞的吞噬溶酶体中，吞噬的细胞核被消化时产生的双链、平末端、5'羟基DNA断裂。这种仅对活性吞噬细胞进行的特异性标记，可准确评估缺血性脑组织中吞噬反应的强度与效率。

该技术具有较强的稳健性，只要严格按照所述步骤操作，即可获得良好的染色效果。其中蛋白酶K消化步骤对于获得强且可重复的染色尤为关键。此步骤中过度消化会导致切片中DNA的丢失，可能减弱甚至完全消除信号。另一个关键点是必须使用高活性的痘苗病毒拓扑异构酶制剂。该技术的一个局限性在于，尚未针对新鲜冷冻切片进行优化。

该方法在细胞凋亡研究中具有广泛的适用性，且可扩展应用于缺血性脑组织以外的其他组织和条件。当用于可视化由多...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲苯	JT Baker	9490-22
乙醇
蛋白酶K	罗氏	3115879001
PBS缓冲液	Invitrogen	AM9624
痘苗病毒拓扑异构酶I	Vivid Technologies		5 pmol/μl 原液
12碱基突出自杀型寡核苷酸	IDT DNA		5’-AAG GGA CCT GC<强>B GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA-3’；B – 生物素-dT；100 pmol/μddH₂O 中的 l 储备液2O
接头寡核苷酸	IDT DNA		5’-TAG AAT CGT ATC-3’；100 pmol/μddH₂O 中的 l 储备液2O
1 M Tris-HCl，pH 7.4	Lonza	51237
TSA，荧光素系统	PerkinElmer	NEL701A001KT
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
含DAPI的Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
盖玻片			22 × 22 mm 或 22 × 40 mm 的玻璃或塑料盖玻片。反应过程中建议使用塑料盖玻片，因其更易于从切片上移除。
大鼠脑切片			缺血性脑卒中模型大鼠脑组织，取自造模后48小时，造模方法见Didenko描述 等11. 5-6 μ从多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织块中切下 m 厚的切片。使用带电荷且预先清洁的载玻片。
倒置显微镜	Olympus
数码摄像机及软件	Micromax
软件	美达莫尔夫