分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

摘要

许多编码线粒体蛋白的mRNA与线粒体外膜相关联。本文描述了一种旨在分离酵母线粒体及其相关mRNA和核糖体的亚细胞分级分离方法。该方案可应用于在不同条件下培养的细胞。 关键词：线粒体，mRNA，核糖体，亚细胞分级分离，酵母 为了揭示线粒体附近 mRNA 定位及局部翻译的机制。

摘要

大多数线粒体蛋白由细胞核基因组编码，需要被导入细胞器内。这种导入过程可能在蛋白质于线粒体附近合成时即发生。这一可能性得到了近期研究的支持，这些研究表明，许多编码线粒体蛋白的mRNA定位于线粒体周围区域。结合早期关于核糖体与线粒体外膜相关联的发现，这些结果提示存在一种局部化的翻译过程。这种局部翻译可能提高蛋白导入效率，提供独特的调控位点，并减少异位表达的情况。已有多种方法被用于鉴定介导局部翻译的因子和元件。其中标准方法是差速离心法进行亚细胞组分分离。该方案的优点在于可在一次操作中同时分离mRNA、核糖体和蛋白质，随后可通过各种分子生物学和生物化学方法对其进行表征。此外，还可对分离得到的材料进行转录组学和蛋白质组学分析，从而获得全基因组水平的深入见解。利用酵母作为此类研究的模式生物具有快速、成本低和操作简便的优势。此外，先进的遗传工具以及可获得的基因敲除菌株有助于对候选因子进行验证。

引言

真核细胞被划分为具有特定功能的不同区室。为了实现其功能，每个区室都包含一组独特的蛋白质，这些蛋白质对其活性至关重要。这些蛋白质到达其所在区室的可能机制之一是局部翻译^1,2。在此过程中，蛋白质由位于该区室内的核糖体和mRNA在其目的地直接合成。局部翻译的潜在优势包括提高蛋白质靶向效率、减少对分子伴侣的需求，以及实现位点特异性的调控机制。此外，在细胞应激导致整体翻译受到抑制的情况下，局部存在的mRNA和核糖体可作为隔离的翻译机器储备库。

近年来，线粒体已成为研究局部翻译的核心模型。  大多数线粒体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中翻译，随后被导入细胞器内。大量证据表明，其中许多蛋白通过局部翻译过程产生。早期电子显微镜和生化分级分离研究发现核糖体与线粒体相关联^3-5这些研究随后得到了证实 体内 通过针对特定mRNAs的研究发现，这些mRNAs仅以共翻译方式被导入^6,7. 全基因组范围的mRNA与线粒体关联研究表明，大量mRNA定位于线粒体周围区域^8-10。其中一些 mRNA 进一步通过以下方式进行了表征 在体 荧光方法，例如 FISH 或 mTAG^9,11.  这一关联的直接解释是，这些mRNA可作为局部翻译的模板。

这些mRNA如何与线粒体结合的机制尚不清楚。非编码区（尤其是3’ UTR）已被证明参与mRNA与线粒体的结合。¹²这些结构域可能作为RNA结合蛋白的结合位点，介导其转运。酵母中的研究表明，PUM蛋白家族的一个成员（Puf3）可促进mRNA与线粒体的结合^8,13Puf3的一个合理作用是抑制mRNA的翻译，这基于该家族其他成员的功能，即在mRNA处于某种状态时 途中¹⁴因此，mRNA 可能以非翻译状态被运输，由与非编码区相互作用的 RNA 结合蛋白介导。或者，大量研究表明，运输过程发生在蛋白质合成的同时。特别是，已有研究显示翻译抑制剂会影响 mRNA 的结合^8,13此外，翻译后的特征（如AUG、线粒体靶向序列（MTS）或开放阅读框（ORF）区域）被证明有助于定位^8,11,15Hsp70家族蛋白伴侣以及线粒体外膜上的蛋白受体也被证实可支持mRNA的结合，进一步表明编码蛋白的特征对于mRNA的定位具有重要作用¹⁶这与一种模型一致，即核糖体上正在合成的蛋白质可作为识别元件，将mRNA-核糖体-蛋白质复合物靶向输送至线粒体。¹⁷.

通过多种方法研究了线粒体附近的局部翻译，包括电子显微镜技术（用于可视化核糖体）³,  荧光原位杂交⁹,  绿色RNA（用于检测特定mRNA）¹¹以及生化分级分离（用于检测RNA和核糖体）^10,18。尽管前者方法可检测定位 体内 并且可能实现对运输动态的可视化，而后者允许在单次实验中检测多种不同的mRNA。此外，对于生化分级分离，无需改变编码或非编码区域，因此可评估这些区域的特定功能。生化分级分离已成功应用多年，用于分离多种不同的细胞区室。其基本原理和局限性已得到充分确立，且现有方案可轻松针对不同目的进行修改。所需的仪器设备在许多实验室中均为标准配置，因此该方法通常是研究细胞内定位的首选。本文描述了一种优化后的方案，用于在核糖体与线粒体结合时分离mRNA。因此，该方案特别适用于研究线粒体附近局部翻译相关因子。

方案

1. 线粒体纯化

称量细胞沉淀。从100 ml细胞中大约可获得0.6 g。

1. 将酵母细胞培养至 OD 100-150 ml₆₀₀ = 1-1.5（30 时） 在非发酵性生长培养基（如基于半乳糖的生长培养基）中于°C培养，以富集线粒体。
2. 在室温下以 3,000 x g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。
3. 用双蒸水洗涤沉淀，再次离心。弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于每0.5 g细胞加入1 ml DTT缓冲液中。使用还原剂处理细胞至关重要，以断裂细胞壁内的二硫键，从而提高水解效率。
5. 将细胞在30℃孵育10分钟 在温和振荡条件下，于°C下孵育。同时，按每1 g细胞称取6 mg的zymolyase，溶于Zymolyase缓冲液中。
6. 在室温下以 3,000 x g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。
7. 将沉淀重悬于每0.15 g细胞加入1 ml Zymolyase缓冲液中。切勿涡旋。
8. 测量 OD₆₀₀ 10 μl 细胞样品与 990 μl 水混合。
9. 加入Zymolyase（步骤1.5）处理细胞，以水解β-1,3-葡聚糖连接处的葡萄糖聚合物，生成原生质球。从本步骤开始，原生质球应始终置于等渗溶液中，以防止裂解。
10. 在30 °C下轻轻振荡孵育细胞15分钟（以保证zymolyase的最佳活性）。为验证细胞壁的水解及原生质球的形成，取10 μl细胞悬液与990 μl水混合。由于渗透压差异，原生质球应发生裂解，OD₆₀₀ 应至少比步骤1.9中确定的值低10倍。若未达到，继续用zymolyase孵育额外15分钟。
11. 在室温下以 3,000 x g 离心 5 分钟。小心弃去上清液，因为沉淀物可能不稳定。
12. 用Zymolyase缓冲液洗涤原生质球，并弃去上清液。
13. 用100 ml复苏培养基重悬原生质球，将原生质球转移至锥形瓶中，在30 °C下孵育1小时 °C下振荡培养。此恢复步骤是必要的，因为在Zymolyase处理期间，翻译过程被抑制，且mRNA的定位受到破坏（图1B).
14. 加入0.1 mg/ml CHX，并将原生质球转移至预冷的50 ml锥形管中。添加CHX对于冻结核糖体与mRNA的结合至关重要，从而维持核糖体依赖的mRNA与线粒体的结合。
15. 在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心球状体 5 分钟，弃去上清液。
16. 用预冷的甘露醇缓冲液洗涤两次。
17. 用4 ml冷甘露醇缓冲液重悬球状体，并转移至配备紧密研杵的15 ml容量Dounce匀浆器中。轻轻研磨15次以破碎球状体，然后将裂解液转移至13 ml离心管中。
18. 在 4 °C 条件下，以 1,500 x g 离心 6 分钟，使裂解液中的细胞核和未破碎的细胞沉淀。
19. 小心将上清液转移至新管中。留出1 ml（25%）样品作为未分级样品（“总” 样品）。将50 ml该样品转移至新离心管中，加入15 ml 4X LSB，用于蛋白质印迹分析。  从剩余的“Total”样品中沉淀RNA（参见方案3，RNA沉淀）。
20. 在4℃下以10,000 × g离心上清液10分钟 °C 离心以沉淀线粒体。
21. 将上清液（约3 ml）转移至新离心管中，置于冰上保存。此为 细胞质中的 组分。取50 ml该样品转移至新离心管中，并加入15 ml 4x 用于Western印迹分析的LSB。从剩余的“胞质”样品中沉淀RNA（参见方案3，RNA沉淀）。
22. 用3 ml甘露醇缓冲液重悬沉淀，于4 °C、10,000 x g离心10分钟。
23. 用3 ml甘露醇缓冲液重悬沉淀。该样品含有线粒体，记为 线粒体 组分。取50 ml该样品转移至新离心管中，加入15 ml 4x 用于蛋白质印迹分析的 LSB

2. RNA 提取

1. 向每个样品中加入等体积的 8 M 盐酸胍和两倍体积的 100% 乙醇。涡旋混匀，并在 -20 °C 下孵育至少 2 小时。
2. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液。注意操作，因为沉淀可能不稳定。
3. 用 70% 乙醇洗涤沉淀。
4. 用 400 µl 无 RNase 水重悬沉淀，并将样品转移至新的 Eppendorf 管中。
5. 加入 0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠（pH 5.2）和两倍体积的 100% 乙醇，再次沉淀 RNA。涡旋混匀，并在 -20 °C 下孵育至少 2 小时。
6. 在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，并用 70% 乙醇洗涤。
7. 将沉淀空气干燥后，用无 RNase 水重悬。将 RNA 样品于 -80 °C 保存。样品可用于 Northern 分析¹⁹ 或微阵列分析¹⁸（见方案 3）。

3. 准备用于微阵列分析的RNA

1. 用 650 µL 无 RNase 的水重悬第 2.2 步的 mRNA。
2. 为去除任何残留的 DNA 或蛋白质，加入等体积（650 µL）酸性酚:氯仿（5:1，pH 4.7），并剧烈涡旋振荡。在最大转速下离心 2 分钟。
3. 将上层（水相）500 µL 转移至新管中。 避免吸取中间相，因其含有 DNA。同时注意避免吸取酚，以免抑制逆转录反应。
4. RNA 样品中含有大量肝素，而肝素是逆转录酶的强效抑制剂。因此，在进行 RT-PCR 或微阵列标记前需将其去除。通过 LiCl 沉淀法去除肝素：加入 LiCl 至终浓度为 2 M，并在 -20 °C 过夜孵育。
5. 在 4 °C 解冻样品，并在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。
6. 小心弃去上清液，并用 80% 乙醇洗涤沉淀。按第 3.5 步所述再次离心。
7. 弃去上清液，空气干燥后用 150 µL 无 RNase 的水重悬沉淀。
8. 为去除残留的 LiCl，再次使用 0.1 体积的 3 M 乙酸钠（pH 5.3）和 3 体积的 100% 乙醇进行沉淀。在 -20 °C 孵育至少 2 小时。
9. 在 4 °C 下以最高速度离心 20 分钟。用 80% 乙醇小心洗涤透明沉淀，并进行空气干燥。
10. 用 25 µL 无 RNase 的水重悬沉淀，并将样品保存于 -80 °C。
11. 按照文献^18,20中所述的 RNA 标记与杂交流程进行操作。

结果

本方案可实现含线粒体组分与细胞质组分的分离。检验分离效果的最佳方法是对不同分离步骤所得样品进行Northern分析和Western分析（图1），并据此评估三个关键的质量参数。首先，需判断样品中的RNA或蛋白质是否保持完整——在分析结果中应呈现为清晰的条带；若发生降解，则会出现额外的较短条带或弥散信号。其次，通过将各步骤的信号强度与上样输入（即 总样品）进行比较，可获得制备过程中组分损失的重要信息；若总样品与相对信号量之间存在显著差异，则表明存在严重损失。最后，也是最重要的，是评估线粒体组分与细胞质组分之间的分离质量。完整线粒体的有效分离应表现为：线粒体转录的RNA仅在线粒体组分中检测到信号，而在细胞质组分中无信号（图1A）；此外，线粒体相关蛋白在Western blot中仅出现在线粒体组分中，而细胞质蛋白则仅存在于细胞质组分中（图1B）。

图1展示了本实验方案中另外两个典型结果：首先，核基因编码的mRNA与线粒体的结合情况因基因而...

讨论

成像技术的进步已催生出高分辨率工具，用于研究 mRNA 的定位。如今，人们能够在毫秒时间尺度上测量单个 mRNA 分子的运动。^23-26然而，传统的生化方法（如上所述）同样具有信息价值，并且在某些情况下更为可取。生化分离法能够纯化大量种类的mRNA和蛋白质，因此更适合用于全基因组范围的研究。通过一次分离即可获得足量的mRNA，用于对数千个基因进行表征分析，无论是通过DNA微阵列还是RNA-seq技术。^18,27同时，可以分离蛋白质并进行蛋白质组学分析，以表征线粒体上的蛋白质组²⁸生化分级分离法可加以调整，用于将线粒体与其他细胞器（尤其是内质网）分离开来²⁹这在某些细胞类型中可能具有优势，因为在这些细胞中，内质网与线粒体之间的高程度空间重叠会阻碍显微镜下的定位分析。生化分离方法的一个重要优点是成本较低，能够实现对大量不同样本的分析。另一个相关优势是其操作简便——如上所述的生化分离方法通常不需要对mRNA进行繁琐的荧光标记，而这一点在某些其他方法中是必需的 体内 成像研究。最后，这些传统方案的许多陷阱和伪影已被明确诊断，因此必要的对照措...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母提取物
蛋白胨（BactoPeptone）
半乳糖			切勿对半乳糖进行高压灭菌
生长培养基			为富集线粒体，应使用任何非发酵性碳源，例如基于半乳糖的生长培养基：1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 半乳糖，经灭菌处理
0.1 M Tris-HCl，pH 9.4
30 mM Tris-HCl，pH 7.6
二硫苏糖醇（DTT）
10 mM DTT 缓冲液			0.1 M TrisHCl pH 9.4，10 mM 二硫苏糖醇（DTT），每次现配现用
1.2 M 山梨醇
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm 滤膜
溶壁酶缓冲液（Zymolyase Buffer）			1.2 M 山梨醇，4 mM KH2PO4，16 mM K2HPO4。将此缓冲液过滤（0.2 μm），室温保存以备后续使用
溶壁酶 20T（Zymolyase 20T）			20,000 U/g
恢复培养基（Recovery medium）			在基于半乳糖的生长培养基中添加 1 M 山梨醇
0.1 mg/ml 环己酰亚胺（CHX）
0.6 M 甘露醇
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml 肝素
1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）
甘露醇缓冲液			0.6 M 甘露醇，30 mM Tris-HCl pH 7.6，5 mM MgAc，100 mM KCl。新鲜加入：0.5 mg/ml 肝素，0.1 mg/ml CHX 和 1 mM PMSF。将此缓冲液过滤后冰上使用
8 M 盐酸胍
100% 和 70% 乙醇（EtOH）
3 M 醋酸钠，pH 5.2
10 M LiCl 储存液
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
甘油
β-巯基乙醇
溴酚蓝
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8，8% SDS，40% 甘油，20% β-巯基乙醇，0.02% 溴酚蓝
容量为 15 ml 并配有紧密研杵的Dounce匀浆器