利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

摘要

树突状细胞（DCs） 在Toll样受体8（TLR8）识别合成嘌呤类物质R848后，经黑素菌素（nigericin）激活NLRP3炎性小体，进而分泌IL-1β，因此IL-1β可用于检测NLRP3炎性小体的活性。通过细胞内细胞因子染色、免疫印迹和ELISA方法，可准确检测IL-1β的表达水平，从而评估NLRP3炎性小体的启动和激活状态。

摘要

免疫细胞分泌白细胞介素（IL）-1家族细胞因子所引发的炎症过程，可导致局部或全身性炎症、组织重塑与修复以及病毒学控制^1,2。白细胞介素-1β是先天免疫反应的关键组分，在清除入侵病原体的同时，有助于防止持续性感染的建立^1-5。

炎性小体是激活白细胞介素1转化酶（ICE 或 Caspase-1）的关键信号平台。NLRP3 炎性小体在树突状细胞（DCs）中需要至少两个信号才能引起 IL-1β 的分泌⁶。在静息细胞中，前体形式的 IL-1β 蛋白表达受限，因此需要一个启动信号来诱导 IL-1β 的转录和蛋白表达。NLRP3 感知到第二个信号后，会形成多蛋白复合物 NLRP3 炎性小体。可通过使用一种合成嘌呤 R848 来检测树突状细胞对 IL-1β 分泌所需信号的响应能力，R848 可被来源于人单核细胞的树突状细胞 （moDCs）中的 TLR8 感知，从而启动细胞；随后使用细菌毒素及钾离子载体尼日尔菌素（nigericin）激活 NLRP3 炎性小体。

单核细胞来源的树突状细胞 在培养中易于生成，且提供的细胞数量显著多于纯化的人源髓系树突状细胞。本文所述方法与其他炎症小体检测方法的不同之处在于其采用 体外 人源而非小鼠来源的树突状细胞，从而允许对人源炎症小体在疾病与感染中的作用进行研究。

引言

在感染、疾病和疫苗接种过程中，先天免疫系统的激活对于引导适应性免疫应答至关重要⁷。树突状细胞是先天免疫系统中最有效的抗原呈递细胞，其功能特化于抗原摄取、迁移至淋巴结，并激活初始CD4⁺和细胞毒性CD8⁺T细胞^8-10。为了实现对病原体的快速识别，先天免疫系统利用了多种由种系编码的模式识别受体（PRR），这些受体可识别病原体中保守的分子基序或宿主细胞应激与损伤的标志物。Toll样受体（TLRs）是一类膜结合型模式识别受体，能够识别特定的胞外吞噬性病原体相关分子模式（PAMPs）以及损伤相关分子模式（DAMPs）。相比之下，Nod样受体（NLRs）位于细胞质中，可响应多种多样的PAMPs和DAMPs。Nod样受体构成了针对逃逸细胞表面和内吞性PRRs病原体的第二道防御屏障。病原体来源或“危险”相关因子与TLR和NLR配体的相互作用，可诱导树突状细胞（DC）成熟状态，从而增强DC与其他免疫细胞的相互作用，并促进T细胞和自然杀伤细胞的活化¹¹。

白细胞介素-1β（Interleukin-1β）是宿主防御感染的关键组分。当识别到微生物后，这种强效促炎性细胞因子 IL-1β 会被分泌，作为趋化因子并激活先天性和适应性免疫细胞。体内 IL-1β 主要介导急性期反应，包括发热和炎症性细胞因子的合成¹²。

方案

伦理声明：研究样本均在获得捐赠者知情同意后采集并用于研究。所有样本在使用前应进行编码或匿名化处理。本方案遵循本机构审查委员会的指导方针。

1. 人外周血单核细胞向单核细胞来源树突状细胞的分化。

注意：人血沉棕层作为人外周血单个核细胞（PBMCs）的来源，由纽约血液中心（纽约，纽约州）提供。献血者均为健康志愿者。该5天实验流程始于将人外周血单个核细胞（PBMCs）接种至组织培养瓶中^35,36。与已发表的实验方案相比，主要差异如下：

1. 使用带滤膜瓶盖的225 cm²无热原聚苯乙烯组织培养瓶，每瓶接种总共2×10⁸个PBMCs，替代10 cm聚苯乙烯组织培养板（58 cm²）（步骤1）。
2. 在500 ml RPMI-1640 + L-谷氨酰胺中加入30 ml 5%混合人血清（PHS）、5 ml 1 M HEPES缓冲液和1.4 ml 50 mg/ml庆大霉素，配制5% PHS培养基，随后通过20 µM滤器过滤。每225 cm²组织培养瓶中加入50 ml 5% PHS培养基。
3. 用25 ml新鲜RPMI-1640洗涤贴壁细胞三次，每次剧烈震荡5秒 ，并吸除未贴壁细胞（步骤4）。
4. 在第0、2、4天，每瓶分别加入190 µl 400 IU....

结果

这些技术通过R848处理来检测TLR8的启动状态。针对前体IL-1β的细胞内细胞因子染色可用于对CD14^-CD11c⁺ moDCs进行显微镜观察和流式细胞术（FACs）检测。两种技术均可相对于未经启动（即静息状态）的细胞对照以及同型对照进行定量分析（图1 和 图2）。前体IL-1β⁺染色阳性细胞百分比乘以该细胞群体的几何中位数，得到中位荧光强度（MFI）。MFI可反映阳性染色细胞中前体IL-1β的含量。

免疫印迹法检测细胞裂解液中的前体白细胞介素-1β（pro-IL-1β），并相对于细胞内对照（如β-微管蛋白或β-肌动蛋白）进行定量图3）。在尼日利亚菌素处理的细胞中进行pro-IL-1β的免疫印迹检测，应显示pro-IL-1β水平降低。同时，仅在R848预处理后给予尼日利亚菌素的条件下，通过ELISA检测上清液中的IL-1β含量会相应增加（图3和图4.......

讨论

炎症性细胞因子在调控先天性和适应性免疫反应以对抗病毒感染中起着关键作用。已有研究表明，在流感病毒感染期间，分泌型IL-1β水平会升高^3,43,44。然而，这些细胞因子在人类树突状细胞中响应病毒识别而被加工处理的具体机制尚未完全阐明。髓系树突状细胞（DC）的分离试剂盒成本高昂且耗时较长。使用分离试剂盒或流式细胞分选（FAC sorting）可能无意中对细胞造成应激或激活。此外，分离获得的细胞数量常常不足以满足实验需求。幸运的是，体外培养的人源单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）在生物学特性上与原代人髓系树突状细胞非常相似in vitro^45,46。这两种细胞类型均需要两个信号——TLR启动信号和NLRP3激活信号——才能实现成熟IL-1β的分泌。因此，moDCs为研究NLRP3炎症小体在人类健康与疾病中的相关性和功能提供了一种经济、简便的树突状细胞模型。

利用本文所述方法检测IL-1β，可提.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IL-4	R&研发
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	我们凭处方在当地药店购买此物品
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基	Cellgro	10-040-CV
外周血单个核细胞	纽约血液中心		从健康供体的血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
12孔组织培养板	Sigma-Aldrich	3516
96孔圆底组织培养板	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&研发	IC201F
FITC 同型对照	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β微管蛋白	圣塔克鲁兹	SC-9014
α-IL-1β	R&研发	mab201
PVDF Immobilon-FL 膜	默克密理博	IPFL00010
4-12% 聚丙烯酰胺梯度凝胶	伯乐（Bio-Rad）	161-1159
Laemmli 样品缓冲液	伯乐（Bio-Rad）	161-0737
BSA	Equitech Bio 公司		30% 溶液，无菌/过滤
PFA	电子显微镜科学公司	15710	16% 溶液
人炎症性细胞因子微球检测试剂盒	BD	551811
尼日里菌素	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M 公司
α-CD14	BD	340436
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			现场储藏室
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm²2，滤膜盖，70 ml 工作体积，30/箱	赛默飞世尔科技	159933
20 μM 无菌一次性滤器单元	赛默飞世尔科技	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
山羊 α小鼠 IRDye 800CW	Licor	926-32210
驴 α-兔 IRDye 680RD	Licor	926-68073
多色宽范围蛋白质标准品	赛默飞世尔科技	26634
Tris-甘氨酸 SDS 10×	伯乐（Bio-Rad）	1610732
Tris 甘氨酸 10x	伯乐（Bio Rad）	161-0734
甲醇 - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
8孔聚苯乙烯培养皿，经组织培养处理的玻片	BD Falcon	354108
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707